Эта рукопись описывает методы электрофизиологических записей из спинномозговых нейронов полосатого данио эмбрионов и личинок. Препарат содержит нейроны на месте и часто включает в себя минимальное рассечение. Эти методы позволяют электрофизиологическому исследование различных нейронов спинного мозга, от первоначального приобретения электрической возбудимости через ранние личиночные стадии.
Рерио, впервые представлена в качестве модели развития, завоевал популярность во многих других областях. Легкость выращивания большого количества быстро развивающиеся организмы, в сочетании с эмбриональной оптической прозрачностью, служила в качестве исходных убедительных признаков этой модели. За последние два десятилетия, успех этой модели дальнейшего движения его аменабельностью крупномасштабных мутагенеза экранов и легкостью трансгеноза. Совсем недавно, генные редактирования подходы расширили мощность модели.
Для нейроразвития исследований, данио эмбриона и личинки представляют собой модель, в которой может быть применено несколько методов. Здесь мы сосредоточимся на методах, которые позволяют исследование существенного свойства нейронов, электрической возбудимость. Наша подготовка к электрофизиологическому исследованию данио нейронов спинного мозга предполагает использование ветеринара шовного клея, чтобы обеспечить подготовку к записи камере. Альтернативные способы записииз эмбрионов данио и личинок включают прикрепление препарата к камере с помощью тонкой вольфрамовой штифт 1, 2, 3, 4, 5. Вольфрамовый контактный наиболее часто используется для монтажа препарат в боковой ориентации, хотя она была использована для установки личинки спинной стороной вверх 4. Шовный клей используется для установки эмбрионов и личинок в обоих направлениях. Используя клей, минимальная диссекция может быть выполнена, обеспечивая доступ к нейронам спинного мозгу без использования ферментативной обработки, тем самого избегая любое полученное повреждение. Однако, для личинок, необходимо применять краткую ферментативную обработку для удаления мышечной ткани, окружающей спинной мозг. Методы, описанные здесь, были использованы для изучения внутренних электрических свойств моторных нейронов, интернейронов и сенсорных нейронов в несколько девелопментел ступеней 6, 7, 8, 9.
Джордж Стрейзингер вел использование Danio rerio, широко известное как данио, в качестве модельной системы для генетического анализа развития позвоночных 10. Модель предлагает несколько преимуществ, включая: (1) относительно простое и недорогое животноводство; (2) внешнее оплодотворение, обеспечивает легкий доступ к эмбрионам из самых ранних стадий развития; и (3) прозрачный эмбриона, что позволяет прямые и повторные наблюдения клеток, тканей и органов, как они образуют.
В течение последующих десятилетий несколько достижений дальнейшего увеличения мощности данио модели. В частности, передние генетические экраны и усилия секвенирования целого генома играет ключевую роль в идентификации мутаций и генов , имеющих решающее значение для многих процессов развития 11, 12, 13, 14,«> 15, способов клонирования 16. Шлюз позволили рутинное применение трансгенных подходов 17, 18. Последние достижения в области редактирования генома, на примере активатора транскрипции типа (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) -Cas9 нуклеазы, позволяют целевой введение мутаций, а также выбивания и забивные подходы 19, 20, 21, 22. в совокупности эти методы делают данио мощной моделью для изучения генетических механизмов , лежащих в основе конкретных форм поведения и нескольких заболеваний человека 23, 24, 25, 26, 27.
Эта работа сосредоточена на разработкепсихическая регуляция и роль электрической активности нейронов развития. Основное внимание на спинной мозг, для которых данио модель обеспечивает ряд преимуществ. Во-первых, это относительно легко получить доступ к данио на эмбриональных и личиночных стадий; Таким образом, можно изучать функции спинного мозга во время стадий развития , которые имеют меньше нейронов и более простой схемы 28, 29. Кроме того, данио спинной мозг имеет разнообразный набор нейронов, похожими на других позвоночных, как продемонстрировано характерных и отличительных форм транскрипционных факторов 30, 31, 32, 33, 34, 35.
Большинство исследований в данио, которые направлены, чтобы раскрыть механизмы, лежащие в основе функции спинного мозга цепей, особенноте , которые поддерживают двигательную, по понятным причинам сосредоточены на личиночной стадии 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Тем не менее, многие из нейронов , которые образуют спинномозговые локомотивных сети инициировать их дифференциации на ранних эмбриональных стадиях, ~ 9-10 ч после оплодотворения (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. В связи с этим, пониманием того, как морфологические и электрические свойства нейронов спинного мозга возникают и изменения между эмбриональными и личиночными стадиями важно для OveraLL понимание формирования опорно-двигательного аппарата и схемы функции.
Методы рассечение, описанные здесь, позволяют патч зажим записи из нейронов спинного мозга и были успешно применены на эмбриональной стадии (~ 17-48 HPF) и личиночной стадии (~ 3-7 дней после оплодотворения [денье]). Такой подход ограничивает количество рассечения, необходимое для обеспечения доступа к нейронам интереса. Протокол отличается от большинства других опубликованных методов для записи с данио нейронов спинного мозга в этом ветеринаром шовного клея используется, а не тонкой вольфрамовой штифта, чтобы прикрепить эмбрион или личинку к записи камеры. Наличие двух различных подходов (например, шовный клей по сравнению с вольфрамовым штырем) для крепления данио эмбрионов или личинок для электрофизиологического анализа обеспечивает исследователь с альтернативными вариантами для достижения своих конкретных экспериментальных целей.
Во-первых, процедуры доступа и записи из поп-музыки авляет первичных сенсорных нейронов, Rohon-Beard клетки, описаны. Клеточные тела этих нейронов лежат в спинном спинном мозге. Rohon-Борода клетка существует в многочисленных видах позвоночных, дифференцируется на ранних стадии развития, и лежит в основе эмбрионального ответа сенсорного 6, 44, 47, 48.
Во-вторых, процедуры доступа и записи с спинальных мотонейронов детализированы. Рыбок данио спинальные двигательные нейроны возникают в течение двух волн нейрогенеза. В ранее рожденных первичных моторных нейронах возникают в конце гаструляции (~ 9-16 HPF), только с 3-4 первичными двигательными нейронами , присутствующими в hemisegment 45, 46, 49. В противоположность этому, позже родилась популяция вторичных двигательных нейронов является более многочисленны и возникает в течение длительного периода времени, начиная с ~ 14 HPFэф "> 45, 50. Вторичный двигательный нейрон генез в сегментах среднего ствола в основном завершен на 51 HPF 50. Вторичные моторные нейроны считаются аналогом моторных нейронов в амниотых 46. Интересно, что супраспинальные нейроны, с помощью допамина, регулируют передвижение в личинке и вторичные двигательный нейрон генезе у зародыша и молодой личинка 50, 51. первичные и вторичные моторные нейроны каждый из которых содержит несколько различных подтипов. Каждые первичных двигательные нейроны подтипов проекты периферийных аксонов , которые иннервируют характерную группа мышц, что приводят к стереотипному, идентификации аксонов траектории. Как правило, вторичные моторные нейроны следовать аксонального пути, ранее установленных первичных двигательных нейронов. Таким образом, по отношению к аксонов траекторий, первичные и вторичные моторные нейроны сходны, за исключением того, что толщина и аксонов somata размер Aснова больше для первичных двигательных нейронов 45.
В-третьих, методы записи из нескольких типов интернейронов обсуждаются. Тем не менее, в этих случаях, ограниченное количество удаления других клеток спинного мозга требуется, и, следовательно, спинной мозг менее нетронутый, чем для записей из клеток Rohon-Beard или моторных нейронов.
Методы, описанные здесь, позволяют электрической и морфологической характеристике сенсорных и моторных нейронов эмбрионов данио после минимального рассечения спинного мозга. Нейроны оставались здоровыми в течение не менее 1 ч, срок наложенного на этих записях. Нейроны были записаны ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами NIH (F32 NS059120 к RLM и R01NS25217 и P30NS048154 к ABR).
Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | ||
Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | ||
Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | |
a-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | ||
Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | ||
Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye | |
Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | ||
Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | ||
Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer | |
Petri dishes | Falcon | 351029 | ||
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) | |
Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | ||
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | ||
Collagenase XI | Sigma | C7657 | ||
Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | ||
Head stage | Molecular Devices | CV203BU | ||
Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | ||
Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) | |
Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | ||
Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | ||
Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | ||
Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | ||
40x/0.80w Achroplan objective | Zeiss | |||
Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 – Clampex and Clampfit | ||
Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Dissection and Recording Solutions(in mM) | ||||
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | ||||
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | ||||
Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | |||
Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | |||
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | |||
Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Immobilizing agents | ||||
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris | |||
Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C. | ||||
For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media | ||||
250 μM α-bungarotoxin | Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | ||||
1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. |