Summary
Hier beschrijven we een nieuwe aanpak om traumatisch hersenletsel in Drosophila melanogaster te veroorzaken . Onze methode heeft het voordeel om herhaalde effecten te leveren met instelbare sterkte aan het hoofd alleen. Verdere verkenning van het ongewervelde systeem zal helpen bij het verlichten van de pathogenese van chronische traumatische encefalopathie.
Abstract
Chronische Traumatische Encefalopathie (CTE) is een gevestigde neurodegeneratieve ziekte die nauw verband houdt met blootstelling aan herhalende milde traumatische hersenletsel (mTBI). De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor zijn complexe pathologische veranderingen blijven grotendeels ontwijkend, ondanks een recente consensus om de neuropathologische criteria te definiëren. Hier beschrijven we een nieuwe methode om een model van CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) te ontwikkelen in een poging om de belangrijkste genen en pathways te identificeren die leiden tot de kenmerkende hyperfosforyleerde tau-accumulatie en neuronale dood in de hersenen. Verstelbare sterkte-effecten om zacht gesloten letsel te veroorzaken worden direct aan de vliegkop afgeleverd, waarbij het hoofd wordt onderworpen aan snelle versnelling en vertraging. Onze methode elimineert de mogelijke problemen die inherent zijn aan andere Drosophila mTBI-modellen ( bijv. De dierlijke dood kan worden veroorzaakt door schade aanAndere delen van het lichaam of aan inwendige organen). De minder arbeids- en kostenintensieve dierenverzorging, korte levensduur en uitgebreide genetische hulpmiddelen maken de vruchtvlieg ideaal om CTE pathogenese te bestuderen en het mogelijk maken grootschalige genoomwijdte genetische en farmacologische schermen te verrichten. We anticiperen dat de voortgaande karakterisering van het model belangrijke mechanistische inzichten zal genereren over ziektepreventie en therapeutische benaderingen.
Introduction
Chronische Traumatische Encefalopathie (CTE) is onlangs herkend als een duidelijke neurodegeneratieve stoornis, los van andere tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer 1 . In tegenstelling tot de ziekte van Alzheimer en andere algemene tauopathieën - waarvan de belangrijkste risicofactoren de leeftijd en de familiegeschiedenis van dementie bevorderen, betekent CTE, zoals aangegeven door haar naam, een nauwe band met een geschiedenis van hersentrauma, die waarschijnlijk wordt gezien bij contactsporters, Zoals boksers en voetballers, evenals in militaire veteranen 2 , 3 , 4 , 5 . Het wordt vermoedelijk geïnitieerd door herhaaldelijke hersenschudding en subconcussieve klachten aan het hoofd. Patiënten kunnen symptomen en tekenen zoals cognitieve tekorten, stemmings- en gedragsveranderingen en bewegingsstoornissen voordoen, die aanzienlijk overlappen met de ziekte van Alzheimer, frontotemporaleDementie, Lewy body dementie en de ziekte van Parkinson 6 . Daarentegen onthullen post mortemonderzoeken van hersenweefsel een duidelijk patroon van hyperfosforyleerde tau-accumulatie rond kleine bloedvaten bij de diepten van de corticale sulci, een pathognomonale functie die niet in de andere degeneratieve aandoeningen is waargenomen 7 . Maar tot nu toe is zeer weinig bekend over de pathogenese die leidt tot ziekte manifestatie. Dit komt voornamelijk toe door het gebrek aan een getrouw diermodel - pas onlangs zijn knaagdiermodellen gegenereerd 5 , 8 . Deze modelorganismen hebben de nadelen van kostenintensieve zorg en een relatief lange levensduur, die niet goed geschikt zijn voor neurodegeneratieve ziekteonderzoeken.
In vergelijking met zoogdieren tegenhangers zijn ongewervelde dieren zoals Drosophila een uitstekend alternatief, met hun kosteneffectieve onderhoud,Uitgebreide hulpmiddelen voor het dissecteren van genetische determinanten, en een relatief korte levensduur 9 . Opmerkelijk delen, vliegen en menselijke hersenen evolutionair geconserveerde moleculaire en cellulaire wegen, evenals anatomische overeenkomsten 10 , 11 , 12 . Twee ingenieuze Drosophila modellen om traumatisch hersenletsel te bestuderen zijn eerder gerapporteerd 13 , 14 . Het eerste 'High Impact Trauma' (HIT) -apparaat, ontworpen door Katzenberger en collega's, bevatte vrij bewegende vliegen in een plastic flesje die vastgebonden was aan het vrije uiteinde van een metalen veer 13 , 15 . Toen de plastic flesje rechtop werd gekanteld en losgelaten, raakte het een polyurethaanpaneel en bracht trauma aan de vliegen toe, terwijl ze naar de flesmuur stoot en teruggingen. In tegenstelling tot hebben Barekat en collega's ons een andere leveringsmethode ontwikkeldIn het Omni Bead Ruptor-24 homogenisatorplatform 14 . Vliegen waren onbekwaam met CO 2 en geplaatst in een 2 ml schroefdopbuis die aan de homogenisator was bevestigd en onderworpen aan vooraf geprogrammeerde schudtoestanden. Een voordeel van het gebruik van het weefselhomogenisatorsysteem is dat de experimentator de intensiteit van de verwonding, de duur van de blessure en het aantal letselschade kan moduleren. Echter, beide regimes hebben hetzelfde nadeel: primaire verwondingen aan het hoofd worden willekeurig toegebracht in termen van de plaats van impact en kracht. Bovendien leidden beide methoden tot aanzienlijke sterfte, veroorzaakt door onvermijdelijk schade aan andere delen van het lichaam en inwendige organen. Hier beschrijven we een nieuwe methode om mTBI in fruitvliegen te veroorzaken. Ons apparaat bestaat uit een gasdreven ballistische impactor. In vergelijking met de bestaande Drosophila modellen 14 , 15 , heeft onze methode het unieke voordeel van het leveren van measHaalbare impact, die alleen gericht is op het vrij bewegende vliegkop, waardoor de nauwkeurige controle van verschillende factoren, zoals de ernst van de impact, het tijdsinterval tussen de impact en het totale aantal effecten die worden opgelopen, kunnen worden gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montage van het Strike Device ( Figuur 1 )
- Verwijder de plunjer uit een 1 ml tuberculinespuit. Knip het vat met 1 ml af.
- Verwijder een aerosolbarrière (3 mm hoogte x 4 mm diameter) van een 200 μL pipettip en gebruik deze als een slagbuis. Plaats de schok in de spuitvat. Tap het vat voorzichtig om de slaginrichting naar het uiteinde te verplaatsen, met de vlakke zijde die de mondstukopening bedekt.
- Bevestig het uiteinde van het vat aan de plastic buis die is aangesloten op de kooldioxide (CO 2 ) stromingsregelaar van een Drosophila anesthesie station.
- Houd het vat verticaal vast en knijp het aan op een standaard klemhouder, zodat de schroef aan de onderkant van het vat blijft.
- Wijzig een 200 μL pipettip om de vlieghouder te maken.
- Knip 4 mm van de punt om een opening van 0,8 mm te maken waardoor alleen de vliegkop blootgesteld kan worden.
OPMERKING: De thoRax en alle andere delen van het vlieglichaam blijven binnen in de pipettip.
- Knip 4 mm van de punt om een opening van 0,8 mm te maken waardoor alleen de vliegkop blootgesteld kan worden.
- Wijzig een 1.000 μL pipettip en een 1 ml spuit naaldkap om de connector te maken.
- Afsnijd 44 mm vanaf de opening van de punt. Neem een 6 mm lengte van een 1 ml spuit naaldkap en duw het stevig in het overblijvende segment van de 1000 μL pipettip.
2. Bediening van het Strike Device
- Verdoof een enkele 2-daagse volwassen vrouwelijke vlieg met behulp van CO 2 op een vliegkussen.
- Zet het voorzichtig naar de vlieghouder met een fijne borstel. Tik de houder voorzichtig op, zodat de vliegkop buiten het uiteinde wordt gezien. Als de vliegproblemen buiten het uiteinde wordt blootgesteld, steek het met een stompe 1 ml spuitnaald voorzichtig terug in de punt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de vliegproblemen in de houder houdt. Anders kan de vlieg van een zuigende proboscisbeschadiging sterven. - Draai de vlieg hoGa naar de spuitvat met de connector zodat de vliegkop naar beneden gericht is.
- Stel de gasdruk bij 100 kPa in. Stel de stromingssnelheid in volgens het experimentontwerp.
- Draai de schakelaar van de regelregelaar snel in en uit zodat de schakelaar een keer de vliegkop trekt.
- Til de vlieghouder op en beweeg het over een vliegkussen. Draai de vlieghouder omlaag en druk de kant zachtjes om de vlieg uit te laten. Laat de vlieg in een lege injectieflacon achterhalen.
3. Video-assisted Movement Tracking
- Vul een Petri-schotel met 6 cm diameter met transparant silicium elastomeer om het tracé te maken. Laat een 3 mm ruimte tussen de silicon en het afdekplaatje om de vliegen vrij te laten lopen maar niet te vliegen.
- Verdoof elke keer vier vliegen van de sham of de behandelde groep en plaats ze in de arena. Laat de vliegen gedurende 1 uur bij 22 ° C liggen.
- Plaats een CCD-camera (CCD) boven de arena's en record gedurende 5 minuten.
- Analyseer de bewegende trajecten met behulp van Ctrax-software (vrij verkrijgbaar bij Caltech) 16 . Voer de opgeslagen gegevens uit in een programmeertaal (bv. Matlab) -compatibel formaat en analyseer de gegevens op basis van de afstand die per frame is gereisd 17 . Bereken de gemiddelde loopafstand voor elke vlieg en combineer het met alle andere opgenomen vliegen / groep om een gemiddelde cumulatieve afstand te verkrijgen die door de populatie van bestanden in dezelfde groep is gereisd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een CTE-model op te stellen met behulp van volwassen Drosophila , hebben we de effectiviteit van ons apparaat bepaald door een enkele schade aan het hoofd te veroorzaken. Om de variaties die verband houden met genotype, geslacht of leeftijd te elimineren, hebben we 2-daagse Canton-S WT-vrouwelijke vliegen gebruikt in het experiment. We kunnen de sterkte van de impactor gemakkelijk regelen door de stromingssnelheid van CO 2 te reguleren bij een constante gasdruk van 100 kPa. Vliegen die blootgesteld werden aan een enkele staking bij de hoogste stroomsnelheid (15 L / min) vertoonden minimale externe gebreken ( Figuur 2 ). Zowel de externe ogen als mondpartij verschenen intact. Niettemin vonden we dat een stromingssnelheid van 15 L / min acuut dodelijk was, wat resulteerde in minder dan 10% overlevingssnelheid binnen 24 uur ( Figuur 3A ). De blootstelling aan een staking van 10 of 7,5 l / min resulteerde respectievelijk in respectievelijk 61,1% en 96,3%, terwijl bij 5 en 2,5 l / min stromingssnelheden alle vliegen overleefden achterEr is 24 uur ( Figuur 3A ). Daarom hebben we onze toekomstige studies gestandaardiseerd op de 5,0 L / min CO 2 stroming. Na een aanval op 5,0 L / min, vliegen zij geleidelijk hun mobiliteit binnen 4 minuten terug ( Figuur 3B ). Over de volgende 2 d worden hun locomotiefunctie, gemeten door loopmogelijkheden, langzaam teruggezet naar normaal ( figuur 3C ). Als een voorlopige evaluatie herinneren deze fenotypen aan die welke worden voorgelegd door mensen die hersenschudding of milde trauma hebben ervaren 18 . Patiënten die last hebben van traumatisch hersenletsel, komen vaak voor bij een progressieve verslechtering van spierbewegingen en voortijdige dood.
Om de langetermijneffecten van meerdere hersenletsels te evalueren, hebben we een mTBI-protocol van vijf opeenvolgende stakingen toegepast op de 5,0 L / min stromingssnelheid, met 24 uur herstelperiode tussen elke staking. Onderzoeken E de invloed van mTBI op de bewegingsfunctie, hebben we een video-assisted motion tracking systeem gebruikt om het vlieg motor gedrag te analyseren. Na de veroudering van de vliegen 20 d na de behandeling vertoonde de mTBI-behandelde groep gereduceerde loopactiviteit en afgelegde afstand vergeleken met de sham-groep ( Figuur 4 A & B ; sham-groep: 6,49 ± 0,72, n = 28 versus behandelde groep: 4,3 ± 0,47, n = 32; p <0,05). Om te onderzoeken of herhaling van hersenletsels chronische gevolgen heeft voor de overleving, hebben we de levensduur van vliegen bepaald die het mTBI-protocol hebben doorstaan. In vergelijking met de sham-groep (n = 129), getoonde vliegen (n = 100), bleek in figuur 4C een aanzienlijk lagere mediane levensduur (36,9 ± 2,7 Vs. 26,3 ± 0,9 d) en significant verminderde levensduur (49,3 ± 2,4 Vs. 34,7 ± 1,4 d).
1 "class =" xfigimg "src =" / bestanden / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Figuur 1 . Diagram van het Strike Device. Het apparaat gebruikte materialen die gemakkelijk verkrijgbaar zijn in een Drosophila lab: 1) 200 μL pipet tip, 2) 1 ml tuberculine spuit, 3) slagpijp, 4) verbindingsbuis vastgemaakt aan een Drosophila anesthesie station, en 5) connector om de punt vast te zetten Op de spuit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 . Mild Closed-Head Traumatic Injury. Een enkele staking bij de hoogste gasstroom veroorzaakte geen duidelijke externe schade aan het hoofd, het lichaam of de bijlagen. ( A &B ) Staking-toegediende vlieg. ( C & D ) Sham vliegen. De sham vliegen ondergingen precies dezelfde procedures als de behandelde groep, inclusief overdrachten op en buiten de vlieghouder, behalve dat er geen impactor in de spuitvat was geplaatst toen de CO 2 -stroom werd aangebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 . Het effect van een enkele staking. ( A ) De overlevingsindex bij 24 uur (SI 24 ), bepaald door het percentage vliegen die binnen 24 uur na een staking overleefd is, is grafisch versus de gasstroomsnelheid. Vliegen die eenmaal met de 5,0 L / min gasstroom zijn getroffen, hebben de locomotorische activiteit teruggevonden metIn 4 minuten ( B ), en hun mobiliteit langzaam teruggezet naar normaal over een periode van 2 d ( C) . Foutbalk, Standaardfout van de gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 . Ontwikkeling van het mTBI Model in Drosophila . Herhaalde stakingen over vijf dagen resulteerden in aanzienlijke verslechterde bewegingsactiviteit ( A & B ) en verminderde levensduur ( C ). Representatieve wandelroutes opgenomen over 5 minuten voor 4 sham en behandelde vliegen worden getoond in A. Error bars, SEM. * P <0,05, Mann-Whitney U-test met een Bonferroni-correctie. Totaal vliegen: behandelde groep n = 100, sham groepN = 129. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diermodellen die trouw model CTE-eigenschappen, met inbegrip van neurofysiologische veranderingen, neuropathologische kenmerken en neurobehaviorale tekorten, zijn essentieel voor het ontdekken van ziekte-mechanismen en voor het ontwikkelen van diagnostische en therapeutische doelen. Het is begrijpelijk dat geen diermodel van een menselijke ziekte perfect is om alle klinisch relevante eindpunten na te bootsen. Wij geloven echter dat een robuust CTE-model aan de volgende drie eisen moet voldoen: (1) de impact moet direct worden toegepast op een hoofd met een intacte hoofdhuid- en schedelbeveiliging; (2) het hoofd moet niet worden geïmmobiliseerd tijdens de impactblootstelling, zodat snelle versnelling-vertraging en rotatie- en lineaire kopbewegingen toegestaan zijn; En (3) het experimentele ontwerp moet zowel enkelvoudige als herhalende regimes bevatten, en de gevolgen van de gevolgen moeten mild zijn, zonder zichtbare schade aan te brengen, zoals weefsel oedeem, contusie of eerlijke bloeding.
ouR vruchtvliegmodel onderscheidt zich van andere methoden die traumatische hersenletsel in vliegen 13 , 14 , 15 veroorzaken . Zowel het Bead Ruptor-model als het HIT-apparaat veroorzaken letsel met willekeurige slaglocatie en kracht. In beide methoden contacteren de variabele aantallen vliegen in een standaard plastic flesje of een 2 ml schroefbuisbuis de containerwand en keren meerdere keren terug tijdens elke staking of letsel. Aangezien de vliegen vrij beweegbaar zijn in de container, zijn de voornaamste verwondingen aanzienlijk verschillend voor individuele vliegen, aangezien verschillende delen van hun lichamen en / of hoofden met verschillende krachten zijn gewond. Zo is het niet verwonderlijk dat de vliegen aan de hand van die modellen de darmfunctie van de darm hebben gehad. Dit was direct gecorreleerd met de sterftecijfers in beide regimes 13 , 14 , die sterk aanwijzen dat nOn-neuronale veranderingen waren verantwoordelijk voor de door trauma geïnduceerde dood in beide systemen. In tegenstelling hiermee kan onze methode herhaaldelijk directe impact op dezelfde locatie leveren. Het lichaam is beschermd tegen elke directe blootstelling, waardoor de mogelijke caveats worden uitgesloten dat de dood kan worden veroorzaakt door schade aan andere delen van het lichaam of aan inwendige organen. Bovendien kan de stromingssnelheid van het CO 2 -gas dat gebruikt wordt om het gewicht voort te zetten gereguleerd worden om een geregelde, instelbare sterkte te bereiken. Belangrijker nog, het vlieghoofd is niet beperkt in de stakingstijd, waardoor een zeer snelle versnelling-vertraging mogelijk maakt die de meest voorkomende vorm van mTBI, die voorkomt in de menselijke populatie 19, nabootst.
Hoewel het ideaal zou zijn om een automatische aan / uit-schakelaar te installeren om de CO 2- regelregelaar te bedienen, lijkt de huidige handmatige schakelaar niet de reproduceerbaarheid van de slagkracht te beïnvloeden, omdat het ontwerp van ons apparaat allemaalOws de kracht om snel uit te oefenen zodra de impactor het hoofd trekt.
Samengevat biedt ons systeem een nieuw regime om mTBI beter te nabootsen, waarbij een nieuw platform wordt geïntroduceerd voor model CTE. Net als andere Drosophila modellen die waardevol zijn bij het ontcijferen van menselijke neurodegeneratieve stoornissen 9 , 20 , wordt verwacht dat de doorlopende gedetailleerde karakterisering van het model in termen van neuronale verlies, tau-hyperfosforylatie, TDP-43 proteïnopathie en neuro-inflammatoire reactie op de toegediende mTBI Belangrijke mechanistische inzichten genereren in CTE-ziekteprocessen en helpen bij het oplossen van enkele kritieke vragen in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door het Johns Hopkins University School of Medicine faculty startup fonds aan LC
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
