Summary
我々はショウジョウバエDrosophila melanogasterの交尾行動に影響を与える環境および遺伝的合図を分析するためのアッセイを実証する。
Abstract
個人の性的欲求は、遺伝子型、経験および環境条件の影響を受ける。性的行動を調節するためにこれらの因子がどのように相互作用するかは、依然として十分に理解されていない。 ショウジョウバエのメラノガスターでは 、食物の利用可能性などの環境上の手がかりが、性行動を調節するメカニズムを調べるための扱いやすいシステムを提供する交配活動に影響を与えます。 D. melanogasterでは、化学感覚性の味覚システムと嗅覚系を介して、環境の合図がしばしば感知されます。ここでは、交尾行動に対する環境化学的合図の効果を試験する方法を提示する。アッセイは、食物培地と交配するカップルを含む小さな交配アリーナからなる。各カップルの交配頻度を24時間連続してモニターする。ここでは、加圧空気システムを介した外部供給源からの環境化合物の試験、および対合アリーナ内の環境成分の直接操作に対するこのアッセイの適用性を示します。あなたは非常に揮発性の化合物の効果を試験するのに特に有用である一方、交配アリーナ内の成分を直接操作することは、化合物の存在を確かめるために有益であり得る。このアッセイは、交配行動および産卵ならびに他の男性および女性の生殖行動に及ぼす遺伝的および環境的合図の影響に関する質問に答えるために適合させることができる。
Introduction
生殖行動は、通常、特に女性の場合、男性よりも大きな生殖細胞を産生し、発生する子孫を育てる条件を慎重に選択する必要があるため、エネルギーコストが高い。エネルギーコストのために、再生が栄養状態に関連していることは驚くべきことではない。これは、すべてではないにしても哺乳動物を含むほとんどの動物で、栄養失調により思春期が遅れ、性的欲求が食物制限によって悪影響を受ける可能性がある1に当てはまります。
遺伝的モデル生物Drosophila melanogasterの繁殖はまた、栄養状態の影響を受ける。男性の食品揮発性物質2の存在下でより高いレベルで裁判所、と女性は、酵母の存在、卵の生産と子孫の生存3、4、5のための主要な栄養素で、より性的に受容されています。この進化的に保存された食品への生殖的応答は、遺伝的に扱いやすく時間効率の良い生物において、環境的食物の利用可能性を性的複製と結びつけるメカニズムを研究する機会を提供する。実際、 D. melanogasterの研究は、インスリン経路が食物と交配行動との関係の重要な調節因子であることを示唆している6 。それはまた、それ自体を相手の行為が女性の食品嗜好、ならびに関連する化学感覚ニューロン7、8、9を変えることが示されています。
D. melanogasterの食餌の合図は生殖行動に影響することは明らかである。これらの影響は主に女性、特に既に交配している女性に影響するようである5 。しかしながら、環境条件のこれらの急性効果を試験するために、雌交配行動に古典的に用いられるアッセイは、交配エピソードの間に長い間中断があるため、あまり適切ではない。古典的なrematingアッセイでは、処女の女性は最初に男性と仲良くなり、すぐに隔離され、24〜48時間後に新しい男性が呈示されます。この古典的なアッセイは、女性の行動と雌応答12、13、14、15、16、17、18を変更男性精液の成分を同定するために成功裏に使用されてきました。したがって、ここで示された連続交配アッセイは、生殖行動に対する環境条件の急性効果を研究するために使用され得る古典的な交配アッセイに加えられるものである。
ここで説明されている交尾行動についての連続アッセイを用いて、以前に酵母に曝露されたハエのペアが、24時間の観察期間5、19、20を超えるeveral回、21、ハエが食品に曝されていない間は一度だけ5 Remateのであろう。この知見は、女性が（参照10、11に概説されている）最初の交配後、数日間Remateのないことを示すキイロショウジョウバエの文学の大部分の光の中で不可解なことができます。しかし、この相違は、新しい交配機会が提供される前に、1〜数日間、女性が単離されるアッセイ条件によって容易に説明することができる。ペアがこの1時間の観察期間に交配しなければ、女性は受容性ではないと特徴付けられる。さらに、野生の捕獲されたハエからのデータが、女性が貯蔵器官に4〜6匹の男性の精子を含むことを示すとすれば、高い交配頻度は驚くべきではない。したがって、女性は自然に数回22、23を Remateのことdicating。
ここでは、この連続交配アッセイを使用して、ハエがどのように集まり、環境条件に関する情報を組み合わせて交配頻度を調節するかを実証する。このアッセイにより、遺伝学的研究のために比較的多数の交配対を試験し、揮発性及び非揮発性の環境手がかりの影響を試験することができる。アッセイは典型的には24時間実行されるが、48時間まで延長することができ、明暗（LD）サイクルなどの循環環境試験を行うことができる。我々は、食品基質中の不揮発性酵母栄養素の利用可能性と相まって、加圧空気システム内の酵母培養からの揮発性手がかりの影響を試験することにより、このアッセイを実証する。
加圧空気システムは、揮発性の手がかりを、食物基質および試験対（その交配挙動がモニターされる）。酵母が交配に影響を及ぼす特異性をさらに決定するために、本発明者らは、酵母の主要な揮発性化合物、すなわち酢酸24を、食品基質中の酵母のアミノ酸含量と組み合わせて、ペプトン（アミノ動物性タンパク質の酵素消化に由来する酸）。これらの実験は、 D. melanogasterの交配行動に対する環境上の合図の効果がこのアッセイでどのように試験され得るかを示す。
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Protocol
1.環境制御された結合ボックス
- 制御された、簡単に洗浄できるテスト領域を確保するには、図1Aに示すように、120 cm x 64 cm x 85 cmのステンレス製のキッチンキャビネットを設置します。
- 天井のすぐ下のキャビネットの背面に1つの穴を開け、側面に4つの穴の4つのセット、直径がそれぞれ2 cmの穴をあけます。ボックスの両側に4つの穴の最初の2つのセットを、ボックスの底から7 cmの高さに、穴の間に12.5 cmの高さで掘ります。箱の両側にある他の2つのセットを底から35cmの高さで掘ります。
注：4つの穴の4つのセットは、カメラ電源ケーブルとエアポンプチューブがキャビネットに出入りするために使用されます。背面の穴はライトボードの電源ケーブルに使用されます。 - 各ライトの間に2.5 cmのスペースを持つ交互に並ぶ40個の白と赤の発光ダイオード（LED）の18列のライトボードを構築してください。電源を使用してください。各LEDを560Ω、0.25W、5％の許容差の抵抗器と直列に接続します。
注：赤色光の発光波長は、590〜661nmに及んでおり、627nmに鋭いピークを有していた。実験領域での結果として得られる光の強度は、約900ルクスであり、両方のライトオンと90ルクスで、赤色ライトのみが点灯している。これはスマートフォン光度計アプリを使用して測定されました。 - ライトボードをステンレス製キャビネットの上部に取り付け、電源ケーブルを背面の穴に通します。
- 白色LEDのアダプターを電源制御タイマーに接続して、暗い段階の実験中に白色LEDをオフにすることができます。赤い光のアダプター（ 25番まで盲目）を通常の電源に接続して、実験の全期間にわたって点灯させます。
- 幅0.5cmの金属製ブラケット110cmと54cmをそれぞれ高さ50のボックスの内側に固定します箱の底から1cm。これらのブラケットに曇りガラス拡散板（119.0 cm×54.5 cm×0.5 cmの寸法）を置きます。
- ライトボードとガラスプレートの間に3枚の濾紙（120cm x 50cm）を加えて、光を拡散させ、相手のアリーナの表面にグレアを制限します（セクション4を参照）。マグネット（側面）を使用して長さ120cmの木製ロッドの長辺に2枚の濾紙を挟み、金属キャビネットの内側に貼り付けます。このアクションを3回実行します。
- 箱の側面に4つのファンを取り付けて、相手方のボックスを連続的に通気する空気の流れを作ります。ライトボードによって生成される熱の蓄積を最小限に抑えるために、ライトボードとガラスプレートの間に8cmファンの最初のセットを取り付け、左側の空気入口とボックスの右側の排気口を取り付けます。
- キャビネットの底面の25cm上にある12cmのファンの2番目のセットを取り付けて、iを通気する外側の気流を作りますキャビネットの裏側に設置し、安定した26°Cに冷却します。排気側のファンを吸入ホースに取り付け、エアストリームを室内から取り出して、キャビネット内の空気の再循環を防止します。
- 天井のすぐ下のキャビネットの背面に1つの穴を開け、側面に4つの穴の4つのセット、直径がそれぞれ2 cmの穴をあけます。ボックスの両側に4つの穴の最初の2つのセットを、ボックスの底から7 cmの高さに、穴の間に12.5 cmの高さで掘ります。箱の両側にある他の2つのセットを底から35cmの高さで掘ります。
- 2つのスタンド（約48cmの高さ）を、スタンドのベースから28cmと30cmの2つのクランプで取り付けます。各クランプにウェブカメラを固定します。監視ソフトウェアを実行しているコンピュータに4台のカメラを接続します。
- 各ウェブカメラの下にA4シートを置きます。交絡アリーナ（セクション4で説明）を収容するために、4cmの軸を有する7×5の正方形の事前に番号が付けられたグリッドを有する未印刷の白色シートまたはシートを使用する。
注：78°の広角表示と500万画素の解像度を持つHDウェブカメラカメラは、A4シートに対応する21cm×30cmの領域をカバーし、20と35の対合アリーナを監視することができます。
2.フライ・ライティングとコレクション
- 20匹の雄および20匹の野生型Canton-S45mLの豊富なフライ食品培地（セクション3参照）を含むフライ飼育用ボトルに3〜4日間飛ぶ。同じ大人を最初に3回タップしてから新鮮なボトルに3回移します。
- 瓶をインキュベーター内に25℃で入れ、12時間：明暗サイクルを12時間点灯させ、午前9時に点灯させます（Zeitgeber時間（ZT）0）。新しい世代は約10日後に現れます。
- 得られた新しく閉鎖したハエを二酸化炭素パッドで5分以内に麻酔し、ペイントブラシを用いてフライ食品バイアルに集める。
- 野生型Canton-S株のバージン（新しく閉鎖された）のメスとバージンオスを2.5 ml x 9.5 cmのフライ用バイアルに6.5 mlの豊富なフライ食品培地で採取する。
- 25°C、12時間：明暗サイクル12時間、午前9時に点灯（ZT 0）、5〜8日間、フライバイアルバイアル中で、それぞれ20匹の同じ性別のハエを飼育する。
- トランス実験の前日に、飛行機を新鮮な飛翔バイアルに移してください。
3.食物培地の調製
- リッチフライ培地1Lを以下のように調製する。
- 磁気攪拌棒を備えた2Lのガラスビーカーに1Lの水道水を注ぎ、ビーカーを磁気ホットプレート上に置く。攪拌を止めて、沸点に達するまで加熱を300℃まで上げてください。
注記：次のステップで長時間沸騰する間に、ある割合の水が蒸発しますが、添加された成分と共に、約22℃の室温で調製した場合、このプロトコールの結果、1リットルの豊富なフライ培地が得られます。 - 毎分500回転まで回転させ、沸騰水に次の成分を添加する：寒天10g、グルコース30g、ショ糖15g、小麦15g、小麦胚芽10g、大豆粉10g、糖蜜、35g活性乾燥酵母。酵母が激しく泡立つのを待ってから、ホットプレートの温度を下げる120℃までエージングする。
- 10分後、ホットプレートを30℃に下げ、混合物を48℃に冷却するまで撹拌した。食品に直接温度計を挿入して温度を監視する。
- p-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（テゴセプト、100％）2gを10mLの96％エタノールに溶解する。これと1Mのプロピオン酸5mLを混合物に加える。 3分間撹拌する。
- アリーナ（セクション4で説明）にフライ食品の培地を注ぎ、アリーナの底に厚さ0.3 cmの層を作ります。
- 注ぐために200mLのガラスビーカーを使用する。正確な量が重要な場合は、10 mLの血清学的ピペットを使用してください。
- 磁気攪拌棒を備えた2Lのガラスビーカーに1Lの水道水を注ぎ、ビーカーを磁気ホットプレート上に置く。攪拌を止めて、沸点に達するまで加熱を300℃まで上げてください。
- ステップ3.1.1〜3.1.5に記載されているように、酵母を除いたフライ培地を調製するが、ステップ3.1.2では酵母を除いておく。
- 寒天10gとペプトン35gを1Lの沸騰水に混合し、ステップ3.1.4〜3.1.5を行うことにより、ペプトンを含むか含まない寒天培地を調製する。
4.マチンgアリーナの準備
- 3.5cm×1.0cmのプラスチックペトリ皿の上側に、加熱された調製針（ブンゼンバーナーで赤色に加熱された）を用いて直径約0.3cmの穴を穿孔する。または、はんだごてを使用してください。
- においのある化合物を含む食品培地を調製する場合、最初に、実験用皿の半分のために、30μL（最終食品培地の1％、例えば酢酸酢酸100％）の所望の化合物を皿にピペットで入れる。比較のために残りの半分の料理を空にしておきます。
注記：ここで説明するセットアップでは、最大140個のアリーナを一度にテストできます。 - 10 mLの血清学的ピペットを使用して、所望の化合物の上の皿の底に3 mLの食品培地を注ぎます。汚染を防ぐためにチーズ布で覆い、室温で約1時間固化させておきます。
- 皿の上にふたを置き、それぞれ両側を締めます。穴を覆う小さなパラフィンフィルムプラグを準備するパラフィンフィルム片を0.2cmの厚さのロールに転がし、次いでそれらを0.5cmのセグメントに切断することによって、皿を洗浄する。
5.においのための酵母培養
- 14.0cm×2.06cmペトリ皿中の酵母エキスペプトンデキストロース（YPD）寒天上に乾燥した活性酵母を生育させる。このステップでは、汚染を防ぐために手袋を着用してください。
- 沸騰した超純水1Lに酵母エキス10g、ペプトン20g、グルコース（0（+） - グルコース一水和物）22gおよび寒天（純粋）15gを加えてYPD寒天プレートを調製する。すべてが解凍されたら、ペトリ皿の底を覆い、4℃の冷蔵庫に上下逆さまに2ヶ月間保存します。
- YPD培地プレートに乾燥した酵母を数粒撒いて溶解させます。次に、滅菌ループを使用して培地プレートをストリークします。プレートを30℃のインキュベーターに一晩保存してください。その後、1週間以上冷蔵庫に保存してください。
- YPD液体培地を調製するi10gの酵母エキス、20gのペプトン、22gのグルコース（0（+） - グルコース一水和物）および攪拌棒を1Lの超純水に加えることによって、1Lのボトルに入れた。
- 120℃および1バールの圧力で25分間オートクレーブ処理する。その後、使用するまで2ヵ月間4℃でボトルを保管します。
- 厚さ0.32cmのシリコンセプタムを備えた開いたボトルキャップ（4.5cm）を取り付けます。
- 中隔に2つの小さな穴をカットして、かかりつけのバルクヘッドフィッティングにぴったりとフィットします。瓶を出る両方の出口と瓶に入る入口の1つに小さなPVC塩化ビニール（PVC）チューブ（直径0.8 cmと内側0.5 cm）を取り付けます。図1Bを参照してください。
- 120℃、1バールの圧力下で25分間アルミホイルとオートクレーブに詰めたキャップとチューブを包みます。
- このステップでは、汚染から保護するために手袋を着用してください。滅菌100μLピペットチップをYPD寒天プレートから酵母コロニーの1つに浸す（d5.1に記載）、オートクレーブしたYPD液体培地ボトルに滴下する。
- この酵母接種YPD液体培地ボトルと、オートクレーブ滅菌キャップをイン・アウトで取り付けたYPD培地コントロールボトル（酵母添加なし）（ステップ5.3で説明）をキャップします。両方のボトルを別々の磁気プレート上に置き、実験開始前に室温で100rpmで24時間撹拌し、酵母培養物を増殖させる。
- 両方のボトルの入口を接続して、酵母培養に空気を供給するために水槽ポンプを分離します。実験に干渉しないように、酵母の臭いを実験室から排出するチューブに実験酵母の瓶の出口を必ず接続してください。
6.エアーポンプのセットアップ
- 大きなPVCチューブ（外径1.2cmおよび内径0.9cm）を加圧空気供給装置に取り付け、活性炭を充填した2つの1Lガラスエルレンマイヤーフラスコに800mL空気を浄化するためのライン。実験室で一般的に供給される加圧空気を給気として使用するか、チューブをエアポンプに接続します（ここでは加圧空気が使用されています）。
注記：チューブ材料は、揮発性物質の化学的性質に基づいて選択し、揮発性物質がチューブの内張り（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロンまたはステンレススチール）に付着しないように試験する必要があります。 - 2つのエアースプリッターを15 mLのチューブと3つの1,000μLピペットチップからそれぞれ作成します。
- 〜1 cmの直径の3つの穴を作ってください。最初に、15 mLのチューブの蓋のすぐ下にお互いに隣接して、加熱された調製用針（ブンゼンバーナーで赤色に加熱された赤色）を使用して、2つの穴を焼きます。次に、チューブの底を取り除いて3番目の穴を作ってください。
- 狭い方の端を外側に向けて穴に1,000μLのピペットチップを接着します。より大きな空気の流れを可能にするために、ピペットチップの端を切ってください。
- 大きなPVCチューブをcの出口から接続してください15 mLのチューブの底にあるピペットチップに、ハルカルで満たされたエルレンマイヤーフラスコを置きます。 2つの水平ピペットチップに小さなPVCチューブ出口を追加し、コントロールと実験用ボトルの方向に導く。
- 微生物によるYPD培地の混入を防ぐために、小さなチューブをフィルターに向かうバルクヘッドチュービングコネクターのプラスティックプッシュとフィルターを出るプラスチックバルクヘッドコネクターのネジで滅菌シリンジフィルター（0.45μm孔径）に取り付けます。次に、チューブをYPD培養ボトルの入口に接続します（ 図1Bを参照）。
- 浮遊酵母が培養フラスコから実験場に移動するのを防ぐために、小型管を用いて各YPD培養瓶の出口にガラス管（長さ6.5cm、外径= 0.5cm、内径= 0.3cm）を取り付ける。ガラスチューブの反対側にPVCチューブを取り付け、実験ボックスの下部の穴（両側に穴が開けられている）に向かってこれを導きます。
- チューブをガラス繊維で満たし、使用する前にオートクレーブします。
- 別の15 mLチューブスプリッター（セクション6.2で説明）を実験ボックスの両側にある小さなPVCチューブに加えて、実験側（ファン空気流の排気に最も近い）の両方のボックスに2本のチューブを流し、 （ファンの空気流の入口に最も近い、左）の制御側に接続されている。
- それぞれ80個の交配するカップルを同時に検査するために10個の出口を有する8×25mLの血清学的ピペットを準備する。 すなわち 、各空気状態について40回。
- 直径0.8cm、直径2cmの10個の穴をピペットに焼きます。
- 1 mLのシリンジの外側を1つの小さな（2.5 cm）コンセントと1つの大きな（5 cm）コンセントに切断します。
- これらのアウトレットをホットグルーで穴に接着してください。
- コンセントの端にプラスチックのパラフィンフィルムの小さなバンドを包み、1,000μLのピペットチップを取り付けます。先端開口部の直径は0.1cmである。各実験にクリーンなヒントを使用します。
- 外径≧0.5cmのTスプリッターと小さなPVCチューブの短いピースを使用して、両側の2つのアウトレットのそれぞれに、2つの血清学的ピペットを取り付けます。ピペットを白い紙のシートの上に平らに貼ってください（スティールボックスのカメラの下）。
- エアーフローモニターを使用して、1000μLピペットチップ出口の空気速度が0.5 m / sになるようにエアーフローを設定します。これは、先端あたり0.0017L / sの空気流量に対応する。
7.交配行動のモニタリング
- 口腔ピペット（参照番号26に記載）を使用して、1人の実験用女性を15:00時に（ZT 6）小さなペトリ皿（セクション4に記載）に入れ、彼女を交配場に順応させる。
- 実験ボックス（セクション1で説明）を次のように設定します。
- ライトをオン、12H上すなわち白色光LED：上のスイッチタイマーに接続された12時間の明暗サイクル09:00の光（ZT0）、実験のダークフェーズ中にハエを監視するための連続的な赤色LEDが含まれています。ファンをオンにして、光源によるキャビネットの加熱を制限し、余分な臭いがテストエリア外に排出されるようにします。
- Webカメラのカメラをコンピュータに接続し、画像監視用の監視ソフトウェアで起動します。
- カメラごとに、監視ソフトウェアでフォーカス、輝度、ズームを設定します。
- カメラの画面を右クリックし、「カメラのプロパティ」を開き、「自動フォーカス」をクリック解除します。紙シート上のグリッドや文章を明確にするために、「フォーカス」を調整します。必要に応じて、「明るさ」と「ズーム」を変更します。
- 2分ごとに1枚の画像をキャプチャするように監視ソフトウェアのプログラムを設定します。各カメラ画面を右クリックして、「カメラの編集」を選択し、次に「アクション」オプションを選択します。アクションを開始するにはクリックしてください "at regular int時間を「2分」に変更します。実行するアクションを選択して「OK」をクリックすると、「写真を撮る」を選択します。
- カメラの各画面を右クリックし、「監視開始」を選択します。
- 1時間後（ZT 7で）、マウスピペットを用いて野生型雄をペトリ皿に移し、ウェブカムカメラの下のA4紙に皿を置き、24時間「モニタリング開始」をクリックする。エアポンプの実験では、ピペットの出口が相手の競技場の入り口に接続されるようにディッシュを置きます。
- 夫婦の交配行動を分析するには、次のようにします。
- 画像を表示しているソフトウェアのすべての画像を選択して開き、時間順に表示します。
- 日付、実験番号、料理番号、開始時刻を同じ行のスプレッドシートに書き留めます。 webcaの下に置かれている瞬間から各アリーナの開始時間を取るmカメラ。写真からタイムスタンプを記録します。
- 同じ行の各交配の開始時間をスプレッドシートにマークします。男性が女性を装着し、カップルが適度に静止し、少なくとも5つの連続フレーム（10分）の同じ姿勢にあるときに、交絡をインシデントとしてカウントする。
注：この基準は12からキイロショウジョウバエにおける27分の範囲交尾の報告された長さ、および上10分のcopulations 27、28肥沃であるという観察に基づいています。 - スプレッドシートの各行の交叉回数を数え、交配頻度を決定します。あるいは、交配待ち時間の尺度として各列の最初の交配の時間から実験の開始時間を差し引くか、または再遊走待ち時間の尺度として第2の交配の時間から最初の交配の時間を差し引く。
- remating latencyを計算するには、スプレッドシートソフトウェアで連続する日として第1および第2の交配の日付を定義する。
- 独立した変数の統計的有意性を決定するために統計ソフトウェア（材料の表を参照）を使用して、データの正規分布を仮定し、実験の日付をランダム因子として含む混合効果モデルを用いてデータを分析する - 空気の種類、および相互作用 - 前述した5 。
- 対数尤度比検定と関連する赤池情報を使用して、重要でない独立変数を逆方向に除去することによって、最良の説明モデルを選択します。モデルを実行した後、データ残差を視覚的に検査して正常性を確認します。 Levene検定を用いて分散の均質性を確認する。等しくない均質性の場合、平方根はデータを変換する。
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Representative Results
この連続アッセイを使用して、交配行動および特異的な交配頻度を、実験的環境条件下で決定することができる。環境条件をコントロールするために、ステンレス製のキッチンキャビネットを、独自の光源と拡散機能を備えたテストエリアに変えました。これにより、光が豊富になり、対合アリーナの上部からグレアが最小限に抑えられました（ 図1A ） 。内側の試験領域はステンレス鋼とガラスで完全に覆われており、ヘキサンやエタノールなどの有機溶媒で洗浄することができます。さらに、キャビネットには、配管用のインレットとして機能する穴があり、加圧空気システムから揮発性の手がかりをもたらします（ 図1Aおよび1Bを参照）。酵母の臭いに合わせて調整された加圧空気システムは、液体酵母培養液を通した空気流で構成され、試験場に入る前に、4つのピペットスプリッター10のアウトレット（ 図1C ）。システム全体は気密性があり、酵母培養に入る前と後の両方にいくつかの粒子フィルターを取り付け、交絡臭の混入を最小限に抑えます （ 図1B ）。
このアッセイの使用を実証するために、我々は、酵母培養物からの揮発性キューが交配行動に影響を及ぼし得るかどうかを試験した。空気を液体酵母培養液に24時間通気し、空気出口を各交配アリーナの入口に配置した（ 図2A参照）。交配アリーナの半分は酵母（フード+酵母）を含むフライフードを含み、残りの半分は酵母を添加しないフライフード（フード - イースト）を含有した。野生型の雄性および雌性を外部酵母培養から来る臭気に曝露し、それらの交配頻度を記録した。グラフ化された結果を説明するためにどの変数が必要かを判断するために、混合効果モデル食物培地、酵母菌の空気、およびこれらの2つの相互作用の独立変数を含む。 図2Bのデータは、食品媒質（p = 0.001）および酵母空気（p = 0.061）の独立変数を含むモデルによって最も良く表されるが、説明的な相互作用効果はない。この完全なデータセットで酵母菌の変数が重要ではないにもかかわらず、その結果を説明する必要があります。食物培地のために分離された酵母空気の分析は、食餌培地中に酵母が存在しない場合（空気：p = 0.992）、対合カップルは酵母臭に応答しないが、酵母が存在する場合に酵母空気中の交配頻度を増加させる食物培地（空気：p = 0.018）に添加した。一緒に、これらの結果は、食品媒質条件と組み合わせて環境臭の影響を試験するための加圧空気システムの適用性を実証しています。
また、加圧空気システムがどのようにテストアリーナに直接環境ケミカルキューを追加することによって、黙っている。特定の酵母化合物が交配頻度に影響を及ぼすことを実証するために、我々は、酵母によって供給されるアミノ酸に対応するペプトン（加水分解されたタンパク質）の用量を寒天に置くことにより、酵母のアミノ酸含量が交配効果に必要であるという仮説を試験した嵌合アリーナの裏打ち基板。我々はまた、交配頻度を増加させるために、酵母の主要な揮発性発酵産物の1つである酢酸の必要性を試験した。これは、食品媒体に酢酸を直接添加することによって行われた。野生型のオスおよびメスを、寒天またはペプトンを含む寒天を含有するアリーナにおいて、酢酸を含むまたは含まない食物培地中で直接試験した（ 図3B ）。これは非常に単純な食物媒体と貧しい環境を作ります。したがって、平均交配頻度も図2Bと比較して減少する。 図3Bのデータは、（p = 0.002）、酢酸空気（p = 0.001）、およびこれら2者の相互作用（p = 0.022）のような、雌の受容性は、酢酸存在下で増加するが、培地中にペプトンが存在する状態でのみ増加する。これは、ハエがそれらの交配頻度を増加させるためにアミノ酸と酢酸を同時に検出する必要があることを示している（ 図3B ）。これは、臭気化合物を試験場に直接加えることが交配行動に影響を及ぼし、その影響が非常に単純な環境条件で検出できることを示している。
図1：酵母を含む実験ボックスおよび加圧空気システムの図。 （ A ）セクション1で説明した環境制御された嵌合ボックスの概略図。注釈付き数字と矢印の説明：1.軽ボード白と赤の光を合わせる。 2.小さなファン。各層が2枚の濾紙からなる3層の濾紙。 4.ボックスの3つの側面に取り付けられたブラケット上に置かれたガラス拡散板。 5.大きなファン。チューブおよびケーブル用の穴; 6。 7.実験領域。大きな矢印、ガラス板まで50cm。中央の矢印、ケーブルホールの高さは35 cm。チューブの穴には7 cmの小さな矢印が付いています。 （ B ）第5節、第6.4節および第6.5節に記載されているように、空気流を用いた液体酵母培養の概略図。注釈付き数字の説明：1.使い捨てフィルタユニット。シリコーンセプタムと出入口を有するキャップ; 4。液体培地; 3。ガラス繊維入りガラス管。 （ C ）セクション6.7で説明した吹き出し口の概略図。注釈付き数字の説明：1.血清学的ピペット; 2。 2. 1mLのシリンジから切断したチュービング、および3.1,000μLのピペットチップ。target = "_ blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：酵母臭は、食品基質中の酵母の存在下で女性の受容性を増加させる。 （ A ）入口穴を通って入る、図1Cの空気出口からの1つの雄と1つの雌およびピペットチップを有する交配アリーナの概略図。 （ B ）フライ食品培地（酵母：培地空気n = 12、酵母空気n = 13、食品+酵母）中の酵母の有無にかかわらず酵母臭のカントンSカップリングカップルの交配頻度における応答のグラフ表示。 ：中程度の空気n = 24、酵母空気n = 23）。 SEM誤差バーと独立変数としての空気と各食品媒体のランダム変数としての日付とを含む混合効果モデルの統計的出力を有する線グラフ。主な統計モデルには食物（p = 0.001）および酵母空気（p = 0.061）が含まれる。参考文献5から適応される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：フライ食品の基質中の酢酸は、ペプトンの存在下で女性の受容性を高める。 （ A ）酢酸を含むフライ食品培地および入り口を閉鎖するプラスチックパラフィンフィルムプラグを有する交配アリーナの概略図。 （ B ）寒天またはペプトン培地（寒天： - 酢酸n = 52、+酢酸n = 40およびペプトン： - 酢酸のいずれか）上の酢酸に応答するCanton-S結合対の交配頻度のグラフ表示n = 28、+酢酸n = 25）。 SEMエラーバーとスタティを備えた折れ線グラフ食品媒質（p = 0.002）、酢酸空気（p = 0.001）、食物*空気（p = 0.022）を独立変数とし、混合変数モデルの統計的出力を確率変数とした。参考文献5から適応される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、交配する夫婦が交配頻度を決定するために使用することが仮定されている環境的合図を連続的に制御しながら、24時間にわたり交配行動を試験するためのアッセイを記載する。培地に酵母も含まれている場合（ 図2B ）、加圧空気システムを介して送達された酵母空気に応答して交配頻度を増加させることが可能である。さらに、寒天、ペプトン、および酢酸臭だけを培地中に直接含有する簡略化した食品培地では、交配頻度における同様の応答が観察され得る（ 図3B ）
ここで実証された実験では、夫婦が同じ環境条件にさらされているので、カップルの一般的な交際行動についてのみ結論を導くことができます。しかし、以前の研究から、交配頻度の変動の47％が女性によって決定され、男性の寄与は変動の11％しか占めないことがわかっている20 。したがって、観察される交配頻度の変化の大部分は、女性の性的受容性の結果である可能性が高い。増加した男性は、成人D.はメスが正常に交尾の試み29をそらすことができショウジョウバエとして、まだ、交尾を受け入れるか拒否する女性を残し求愛します。確固とした結論のために、そして交配頻度の差異を女性の性的受容性と特異的に関連付けるために、女性の遺伝子型は変化するが男性のそれは一定に保たれる追加の交尾カップルを試験することが必要である。
このプロトコルは、加圧空気システムを用いて、または食品媒体中に直接的に、対合カップルに臭気化合物を送達する2つの方法を実証している。加圧空気システムは、空気を介して送達される化合物に起因するあらゆる効果が得られるという利点を有するが、化合物が食品媒体に直接入れられたときには結論づけられない。一方、w加圧空気システムで効果が見られない場合、自動的にキューが動作に影響しないことを意味するわけではありません。それは、化合物が加圧空気システムを通して効率的に送達されないことを意味してもよい。空気供給システムの出口での空気の組成は、炭化水素フィルタを配置し、捕捉された空気量を質量分析計と組み合わせたガスクロマトグラフィで分析することによって分析することができる。加圧空気システムは、より長い範囲で容易に浮遊させることができる化合物を試験するための優れたアッセイです。より揮発性の低い化合物は、食品媒体に直接入れなければならないかもしれない。加圧空気システムの別の欠点は、空気速度がフライ挙動に及ぼす影響である。飛行速度が高すぎる場合（0.7-1.6m / s以上）、飛行は停止します30 。加えて、加圧空気システムは、食品媒体を乾燥させることによって耐えられない単純で低品質の環境を提供することができる。いずれの場合も、ハエは繁殖しない同様に、試験された特定の化合物に起因する結論は得られない。
これらのアッセイを最適に実行するための準備中に、いくつかのステップが不可欠です。注意を必要とする最初のステップは、培地の準備です。酢酸のような臭気のある揮発性化合物を含む媒体は、実験の日に調製され、蒸発を避けるために早く調製することが重要である。また、空気の流れが臭いの蒸発を促進する可能性があるため、余分な空気の流れがない状態で媒体を硬化させる必要があります（ヒュームフードを使用しないでください）。特別な注意が必要な第2のステップは、加圧空気システムの確立である。気流は、液体をアリーナに移すことなく、酵母培養物を優しく泡立たせるほど十分に高くなければならない。
このプロトコルは、交配行動と組み合わせて酵母臭を用いた行動アッセイを実証している。しかし、このシステムは、匂いのタイプ、および他の種類の行動に関連する。このシステムを他の臭気に使用するには、気流および臭気媒体を調整して、化合物の皿への移動を最適化する必要があります。しかしながら、一般に、空気によって移送することができる化合物は、この系で試験することができる。さらに、同じタイプの食器を使用することによって、またはより大きいまたはより小さい試験領域に到達して接続するようにチュービングを調整することによって、男性および女性の両方において、あらゆるタイプの行動を試験することができる。さらに、より詳細な動作をテストする場合、使用されるカメラのフレームレートと解像度を再検討する必要があります。いずれの場合でも、試験臭がある場合とない場合の両方の実験を同じ空気源で同時に実行すると、ある実験から別の実験への圧力または濃度の変化にかかわらず、環境的合図に対する応答を検出することができる。最後に、ここで示されたアッセイは、少なくとも1回のLDサイクル（最大48時間）にわたって延長することができ、fオードの供給は乾きません。
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Disclosures
著者らは、開示する競合する持分はない。
Acknowledgments
フライングストックのブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝します。 C. Gahr、JT Alkema、およびS. van Hasseltによる加圧空気アッセイの開発に関する初期の試み。ジャスパー・ボスマン、酵母の栽培に関するアドバイス。もともとショウジョウバエの交尾行動の経過観察モニタリングを開発してくれたRezza AzanchiとJoel Levine。 JA Gorterは、Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Programグラントの支援を受けました。この研究は、JC Billeterの科学研究（NWO）（参考文献：821.02.020）のオランダ組織によって一部支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
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