Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Published: September 17, 2017 doi: 10.3791/55779
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

Summary

Structures des assemblages supramoléculaires protéine à résolution atomique sont de grande importance en raison de leur rôle crucial dans une variété de phénomènes biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des études structurales à haute résolution sur des ensembles de protéines macromoléculaire insoluble et non cristalline par magie-angle spinning spectroscopie RMN à l’état solide (MAS SSNMR).

Abstract

Assemblages supramoléculaires protéines jouent un rôle fondamental dans les processus biologiques allant de l’interaction hôte-pathogène, infection virale à la propagation de maladies neurodégénératives. Ces assemblys consistent en plusieurs sous-unités protéiques organisées d’une manière non covalentes pour former de grands objets macromoléculaires qui peuvent exécuter une variété de fonctions cellulaires ou provoquer des conséquences néfastes. Perspicacités atomiques dans les mécanismes de l’assemblage et le fonctionnement de ces assemblages macromoléculaires restent souvent peu abondantes depuis leur insolubilité inhérente et non-cristallinité souvent radicalement réduit la qualité des données obtenues de la plupart des techniques utilisé en biologie structurale, tels que la cristallographie aux rayons x et la solution de résonance magnétique nucléaire (RMN). Nous présentons ici la spectroscopie RMN à l’état solide de rotation à l’angle magique (SSNMR) comme une méthode puissante pour étudier les structures des assemblages macromoléculaires à résolution atomique. SSNMR peut révéler des détails atomiques sur le complexe assemblé sans limites de taille et de la solubilité. Le protocole présenté ici décrit les étapes essentielles de la production de 13C /15N les assemblys marqués isotope macromoléculaires protéiques à l’acquisition du standard des spectres de SSNMR et leur analyse et leur interprétation. À titre d’exemple, nous montrons le pipeline d’une analyse structurale de le SSNMR d’un assemblage de protéines filamenteuses.

Introduction

Les progrès dans la filature de la spectroscopie RMN à l’état solide (SSNMR) à l’angle magique offrent un outil efficace pour la caractérisation des assemblages macromoléculaires protéiques à une résolution atomique. Ces ensembles de protéines sont des systèmes ubiquitaires qui jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques. Leurs structures moléculaires, les interactions et les dynamiques sont accessibles par des études SSNMR, comme l’a montré pour virale (capsides1) et des mécanismes d’infection bactérienne (sécrétion systèmes2,3, pili,4), membrane protéines complexes5,6,7,8 et fonctionnelle amyloïdes 9,10,11. Ce type d’assemblage moléculaire peut également provoquer des pathologies telles que les maladies neurodégénératives où les protéines se réunissent dans des États mal repliées, amyloïdes et provoquent un comportement aberrant de cellule ou cellule mort 12,13. Ensembles de protéines sont souvent construits par l’oligomérisation symétrique des copies multiples de sous-unités protéiques en gros objets supramoléculaires de différentes formes, y compris les fibrilles, les filaments, les pores, les tubes ou les nanoparticules. L’architecture du Quaternaire est définie par des interactions faibles entre les sous-unités protéiques d’organiser l’Assemblée spatiale et temporelle et pour permettre des fonctions biologiques sophistiquées. Enquêtes structurelles à l’échelle atomique sur ces assemblées sont un défi pour les techniques de haute résolution depuis leur insolubilité intrinsèque et très souvent leur cristallinité-non restreint l’utilisation de la diffraction conventionnelle ou solution NMR approches. Magie-angle spinning SSNMR (MAS) est une technique émergente d’obtenir des données de résolution atomique sur des assemblages macromoléculaires insolubles et a prouvé son efficacité pour résoudre les modèles atomiques 3D pour un nombre croissant de systèmes biomoléculaires complexes y compris filaments bactériens, les assemblys amyloïdes et les particules virales 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Des progrès techniques sur les champs magnétiques élevés, des développements méthodologiques et préparation des échantillons a établi SSNMR MAS dans une méthode robuste pour étudier les protéines insolubles dans divers environnements, notamment dans leur biologiquement pertinente macromoléculaires assemblées d’État ou dans les membranes cellulaires, ce qui rend la technique très complémentaire de cryo-microscopie électronique. Dans de nombreux cas, un très haut degré de symétrie caractérise ces assemblys de protéine. MAS SSNMR exploite cette fonctionnalité, comme toutes les sous-unités protéiques dans un assembly homomolecular aurait la même structure locale et donc pratiquement la même de signature SSNMR, réduisant considérablement la complexité de l’analyse.

Un protocole efficace pour des études structurales des assemblages macromoléculaires protéiques par MAS modérées (< 25KHz) SSNMR est présenté dans cette vidéo et peut être subdivisée en différentes étapes (Figure 1). Nous allons démontrer les étapes cruciales du flux de travail d’une étude structurale de SSNMR illustrée sur un assemblage de protéines filamenteuses (voir mis en évidence les étapes à la Figure 1), à l’exception de purification de protéine de sous-unité, différentes pour chaque protéine l’Assemblée mais d’une importance cruciale pour les études structurales et sans entrer dans les détails techniques/méthodologiques de calcul de structure et de la spectroscopie SSNMR pour quels tutoriels spécialisés sont disponibles en ligne. Alors que le présent Protocole se concentrera principalement sur les expériences de RMN à l’état solide effectués dans des conditions de MAS, l’utilisation d’alignés environnements biologiques 23,24,25,26 , 27, tels que bicelles alignées, permettre l’enquête de la conformation des protéines et l’interaction dynamique de protéine-protéine dans les médias de type membrane sans la technologie MAS. Nous allons montrer l’expression de la protéine et étapes de l’assemblage ainsi que l’enregistrement des spectres SSNMR cruciales et leur analyse et l’interprétation. Notre but est de donner un aperçu de l’oléoduc d’analyse structurale permettant au lecteur d’effectuer une étude structurale d’atomique-résolution d’une Assemblée macromoléculaire par des techniques SSNMR.

Le protocole comprend 3 sections :

1. à l’état solide production d’échantillon de NMR

Comme une condition préalable à une analyse par RMN à l’état solide, les constituants protéiques de la nécessité de macromoléculaires Assemblée de s’exprimer, isotopes marqués, purifiée et assemblé in vitro dans l’état natif complexe (pour un exemple, voir Figure 2) . Pour assurer la haute sensibilité de NMR, enrichissement isotopique 13C et 15N étiquetage est nécessaire grâce à l’utilisation de médias minime expression bactérienne additionné de 13C et sources d’azote 15, comme uniformément 13 C-étiqueté glucose/glycérol et 15NH4Cl respectivement. Dans le stade avancé du protocole, sélectivement 13C marqué échantillons produit avec sélectivement 13C marqué des sources telles que (1, 3 -13C)- et (2 -13C)-glycérol (ou (1 -13C)- et (2 -13C)- le glucose) sont utilisés pour faciliter l’analyse par RMN. Échantillon étiqueté mélangé correspondant à un mélange équimolaire de soit 50 % 15N - et 50 % 13C marqué ou 50 % (1, 3 -13C)- et 50 % (2 -13C)-glucose ont été introduites pour décrire la détection d’intermoléculaire interactions. Un haut degré de pureté de la protéine ainsi que des conditions rigoureuses au cours de l’étape d’assemblage sont des facteurs clés pour assurer un ordre structurel homogène de l’échantillon final.

2. préliminaire caractérisation structurale basée sur unidimensionnelle (1D) à semi-conducteurs NMR

Nous présentons les expériences essentielles pour l’analyse structurale par SSNMR. Unidimensionnelle (1D) polarisation croisée (CP) et INEPT / RINEPT28 expériences, détectés sur les noyaux de 13C sont utilisées pour détecter des segments rigides et flexibles de protéine dans l’Assemblée, respectivement et d’estimer le degré de structure homogénéité et polymorphisme local (pour un exemple, voir Figure 3).

Rong > 3. Détermination de structure de l’analyse conformationnelle et 3D

Les paragraphes 1 et 2 concernent l’analyse conformationnelle, qui repose sur l’affectation de résonance SSNMR de tous les résidus rigides de l’Assemblée de protéines, comme les déplacements chimiques sont des sondes très sensibles à l’environnement local et peuvent être utilisés pour prédire la phi/psi dièdre angles et déterminer ainsi la structure secondaire. La figure 4 illustre un exemple d’une cession de résonance séquentielle dans le noyau rigide d’un assemblage de protéines. La détermination de la structure 3D repose sur la collecte des données structurelles, telles que les contraintes de distance encodage fermer proximités (< Å 7-9), contenant aussi bien intra - et intermoléculaires informations. Les paragraphes 3 et 4 décrivent interprétation et collection de retenue lointain à longue distance. Contacts à longue distance sont définis comme intramoléculaires 13C -13C proximités provenant de tout résidu i à j, avec | i-j | ≥ 4, définissant ainsi le giron de la protéine tertiaire de la sous-unité monomère ou intermoléculaires 13C -13C proximités, définir les interfaces intermoléculaires entre les sous-unités protéiques dans l’assembly. Intra - et intermoléculaires interfaces sont illustrées à la Figure 5. Dispositifs de retenue pour SSNMR détectée par le biais de 13C -13C et 15N -13C raccordement expériences habituellement codent pour des distances internucléaires < 1 nm. Paragraphe 4 explique la détection des dispositifs de retenue de la distance intermoléculaire. Dans les assemblys de protéine symétrique, l’utilisation d’échantillons étiquetés de façon homogène (c'est-à-dire 100 % uniformément ou sélectivement marqués) pour identifier les interactions intermoléculaires sous-unité sous-unité est limité, comme les deux intra - et inter-moléculaires contacts aboutissent à signaux détectables. La détection sans ambiguïté des proximités intermoléculaires est obtenue en utilisant mixtes échantillons étiquetés, contenant un mélange équimolaire de deux échantillons différemment étiquetées, combiné avant l’agrégation. Paragraphe 5 présente brièvement la modélisation de la structure.

Figure 1
Figure 1 : D’une étude d’atomique-résolution structurale par RMN à l’état solide, les flux de travail. 13 C, 15N isotopique marqué la production de protéines, purification de la sous-unité, Assemblée de sous-unité, contrôle de la formation de l’Assemblée, SSNMR des expériences, analyse expérience SSNMR et extraction des contraintes de distance et modélisation de la structure sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Solid-State NMR échantillon productiona

  1. Production d’uniformément 13 C / 15 sous-unités de protéines marquées N contenant du plasmide
    1. utilisation fraîchement transformée, peptide-pET24-6his E. coli BL21 (DE3) cellules, récolter de la gélose préparés.
    2. Ensemencer une pré-culture 15 mL de milieu LB préchauffé pour une colonie. Incuber à 37 ° C, avec 200 tr/mn agitation du jour au lendemain.
    3. Transférer le pré-culture dans 1 L de la culture principale de préchauffé M9 moyen (voir composition dans le tableau 1), qui contient les sources requis de carbone et d’azote isotopes marqués.
      Remarque : Ceci peut être uniformément 13 C-étiqueté glucose, sélectivement (1 - 13 C)- ou (2 - 13 C)-étiqueté glucose 29 , 30 , 31 ou () 1, 3 - 13 C)- ou (2 - 13 C)-étiqueté glycérol 32 , 33.
    4. Ceci incuber à 37 ° C et mesurer l' OD 600 dès que la culture devienne trouble. Lorsque l' OD 600 a atteint une valeur de 0,8, induire d’expression de la protéine avec 0,75 mM IPTG pour 4 h.
      Remarque : Les conditions optimales d’induction peuvent varier d’une protéine à l’autre.
    5. Récupérer les cellules par centrifugation pendant 30 min à 6000 x g et 4 ° C.
  2. Croquis de purification (non montré dans la vidéo protocole)
    1. lyser les cellules à l’aide de techniques standard telles que le traitement de sonication ou lysozyme et de purifier la sous-unité de la protéine à l’aide de techniques établies ou adaptés à la étudié l’Assemblée protéine.
      Remarque : La protéine peut être exprimée en corps d’inclusion, vérifiez pour la localisation des protéines par lyse cellulaire et centrifugation ultérieure. Si la protéine se trouve dans les sédiments avec les débris cellulaires, elle a été accumulée dans le corps d’inclusion.
    2. Test expression et la pureté de l’échantillon de protéine par exemple par une standard 12-15 % Tris-Tricine SDS-PAGE, voir Figure 2 a. Si la pureté est suffisante, les protéines peuvent être assemblés, sinon effectuer une étape de purification supplémentaire.
  3. In vitro l’assemblage des filaments protéiques
    1. Vérifier la concentration de protéines dans la solution purifiée. Si la protéine contient des résidus absorbants, mesurer l’absorption dans un spectrophotomètre UV à 280 nm. Insérez le tampon pur dans le spectrophotomètre comme étalonnage et mesurer puis l’absorption de protéine.
    2. Calculer la concentration de la protéine à l’aide du coefficient d’absorption de la sous-unité de la protéine avec la Loi de Beer-Lambert adaptée : A λ = ε λ x l densité x c ; ici, A est l’optique à une longueur d’onde donnée λ ; ε est la coefficient d’absorption spécifique ; l est la longueur de la trajectoire optique en cm ; c est la concentration en mol/L.
    3. Concentré de la protéine à une concentration de 1 mM dans une unité de filtration centrifuge. Introduire l’échantillon dans l’unité de filtration centrifuge et centrifuger à 4000 x g pendant 30 min, mélanger la solution dans l’unité de filtre doucement avec une pipette pour éviter les dépôts de protéines au niveau du filtre. Répétez la procédure jusqu'à ce que la concentration désirée soit atteinte.
      Remarque : La concentration optimale de montage dépend du système et doit être optimisée (généralement entre 0,1 - 1 mM). Si un équimolaire mixte étiqueté échantillon de deux lots de différentes protéines marquées est prêt (par exemple (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-étiqueté), mélange doit avoir lieu avant ou juste après l’étape de concentration afin d’assurer homogénéisation de la solution mélangée.
    4. Transférer l’échantillon dans un tube et incuber sous agitation pendant une semaine à température ambiante il.
    5. Habituellement la polymérisation des sous-unités en filaments est accompagnée de la solution devient trouble. Vérifier la morphologie microscopique de fibrilles et l’homogénéité par exemple par microscopie électronique (6300 X - 45000 X grossissement), voir Figure 2 b.
    6. Centrifuger l’échantillon pendant 1 h à 20000 x g et 4 ° C. Retirer la majorité du liquide surnageant, laissez seulement suffisamment de liquide pour couvrir la surface afin d’éviter le séchage des échantillons. Vérifiez le liquide surnageant des sous-unités non assemblé sur le spectrophotomètre UV.
    7. Laver l’échantillon en ajoutant H 2 O et prudent Resuspendre le contenu avec une pipette. Ne pas vortexer. Faire tourner l’échantillon pendant 30 min à 22000 x g et 4 ° C. répéter l’étape de lavage 3 fois. Vérifier pendant toutes les étapes de lavage si le culot conserve son aspect après centrifugation et le surnageant des sous-unités non assemblé sur le spectrophotomètre UV.
    8. Ajouter 0,02 % (p/v) d’azide de sodium (NaN 3) pour éviter la contamination bactérienne et de stocker l’échantillon jusqu'à la mesure à 4 ° C.
  4. Solid-State NMR rotor remplissage
    1. centrifuger deux fois pendant 30 min à 22000 x g et 4 ° C. Remove maximum de surnageant ; la consistance de l’échantillon qui en résulte dépend de l’assemblage des protéines et est habituellement une type gel dépôt.
    2. Utiliser une pipette capillaire pour introduire l’échantillon dans le rotor SSNMR.
      NOTE : Ici, nous présentons la procédure sur un rotor de diamètre 4 mm. Centrifugeuse
      1. centrifugeuse le rotor sur une table à introduire doucement l’échantillon dans le rotor. Répétez la procédure jusqu'à ce que le rotor est rempli. Maintenir un espace minimum pour fermer le rotor avec le capuchon du rotor. Si la quantité de l’échantillon n’est pas suffisante, introduire un encart disponible dans le commerce pour remplir l’espace restant pour assurer l’homogénéité de distribution d’échantillons dans le rotor.
        NOTE : Dépendant sur la consistance de l’échantillon assemblé, il serait plus convenable d’utiliser une spatule mince, surtout pour les échantillons très denses. Rotors de 2,5 à 4 mm de diamètre sont utilisés à des fréquences de MAS modérées.
    3. Ajouter des traces d’acide 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) pour étalonnage interne de changement et de la température chimique.
    4. Fermez le bouchon avec un dispositif de fermeture.
    5. Vérifier sous une loupe si le bouchon est bien inséré et complètement fermé.

Figure 2
figure 2 : représentant des résultats pour purification de protéine sous-unités et l’Assemblée. A) 15 % Tris-tricine SDS-PAGE de sous-unité protéique (y compris son 6-tag) à différentes étapes de purification. Piste 1 - marqueur de poids moléculaire de protéines ; piste 2 - e. coli BL21 (DE3) cellules contrôle non induit ; piste 3 - e. coli BL21 (DE3) cellules induites avec 0,75 mM IPTG ; piste 4 - solubilisée inclusions voie 5 - les fractions surnageantes des cellules lysat ; voie 6 - fraction purifiée après Nickel immobilisés par chromatographie d’affinité métallique (IMAC) FPLC et de dessalage. B) coloration négative des fibrilles protéiques par imagerie TEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. caractérisation structurale préliminaire basée sur unidimensionnelle (1D) à semi-conducteurs NMR

  1. mise en place initiale et 1D polarisation croisée (CP)
    1. Insérer le rotor en l’aimant de NMR
    2. commencent à Faites tourner le rotor à une fréquence de 5 kHz et attendre une stabilisation de ± 10 Hz, puis accélérer jusqu'à 7 kHz. Branchez-vous et correspondent à 1 H, 13 quater et 15 N canaux. Régler la température à 2-10 ° C (275-283 K) ; échantillon de chauffage à 7 kHz MAS est faible et le réglage de la température n’est habituellement pas nécessaire à cette fréquence MAS.
    3. Enregistrer un single-pulsé 1D 1 H du spectre en utilisant 16 balayages.
      Remarque : Des niveaux de puissance doivent ont précédemment été optimisées sur un composé de référence (comme un 13 C / < sup > 15 N histidine ou la glycine), afin de fournir des valeurs de départ permettant d’optimiser les niveaux de puissance dans les expériences sur l’échantillon cible ; Cette procédure est une tâche courante et donc hors du champ d’application du présent protocole.
    4. Garder la température au cours de toutes les expériences entre 2 et 10 ° C, dans des échantillons hydratés, que la température se reflète dans le déplacement relatif de la résonance de 1 H de l’eau en vrac en ce qui concerne le signal DSS 34. Mesurer la température suivant la relation δ (H 2 O) = 7.83-T/96,9 avec une précision de 1 à 2 ° C 35.
      5. Fréquence de MAS
    5. ensemble vers le haut la direction désirée et attendre jusqu'à stabilisation de ± 10 Hz.
      NOTE : Ici, il est démontré à une fréquence de 11 kHz.
    6. Tune et match 1 H et 13 C canaux à nouveau et ajuster la température à l’aide d’une expérience de 1 H 1 D.
    7. Configurer un 1D 1 H - 13 C CP 36.
      Remarque : Les expériences de CP montrent les signaux provenant des résidus dans une conformation rigide. Étalonnage de l’impulsion et le découplage des paramètres peuvent être directement optimisés sur l’échantillon lorsque la sensibilité est suffisamment élevée pour observer des signaux après moins de 32 ~ scans. Les valeurs d’optimisation initiale sont repris de l’optimisation standard sur un composé de référence. Temps de contact de CP et de niveaux de puissance sont choisis en fonction sur l’intensité du signal maximal. Dans des échantillons de protéine, le temps de contact optimal de CP est généralement entre 200 µs et Mme 2 les paramètres découplage devraient également être réajustés de l’étalonnage sur un composé de référence.
      1. Observer attentivement la localisation de la filature des bandes latérales à la fréquence de MAS donnée.
    8. Enregistrer un spectre référence 1D 13 C CP qui sert d’empreinte spectrale 1D. Les paramètres typiques sont 128 scans, 1 ms CP temps de contact, 100kHz découplage effectif, un retard de recyclage de 3 s et 25 ms d’acquisition.
    9. Calibrer les 1 H et des déplacements chimiques de 13 C suivant l’IUPAC recommandations 37. Déterminer la fréquence de résonance du signal 1 H DSS (déplacement chimique de 0 ppm) ; 13 C les déplacements chimiques sont référencées aux déplacements 1 H (généralement ~ 0.25144, dérivé de la ratio des 13 C le de fréquence de résonance 1 H 37).
    10. Processus le 1D 1 H - 13 C CP expérimenter sans apodisation fonctionne (voir les figures 3 a et B pour la détection sur un assemblage de protéines homogène bien ordonné). Choisissez un pic isolé pour estimer la largeur des raies dans l’échantillon, d’homogénéité et d’ordre structurel. Largeurs de typique 13 C pour assemblages de protéine biologique bien ordonnées sous MAS à des champs magnétiques élevés allant de 20-150 Hz (mesurée par la pleine largeur à mi-hauteur (FWHH)).
    11. Estimer le ratio signal-bruit (S/N) dans le spectre de la CP.
      NOTE : Le rapport signal/bruit dépend de nombreux facteurs, dont principalement la quantité d’échantillon dans le rotor, le degré de rigidité de la structure des protéines et la présence d’une seule conformation moléculaire. Comme règle générale, un échantillon doit être approprié pour spectroscopie multidimensionnelle de SSNMR si un signal est observé dans un optimisation 1D 1 H - 13 C CP spectre enregistré avec 64 scans.
      12. Résonances
    12. zoom dans la région spectrale du carbonyle d’épine dorsale de protéine localisées (principalement) entre 165-180 ppm. Estimer la teneur en structure secondaire dans l’Assemblée par la position des résonances protéine épine dorsale carbonyle avec les résonances de résidus en α-hélicoïdale ou conformation β-brin décalé vers les bas champs ou upfield, respectivement (voir figure 3 b pour une sous-unité principalement α-hélicoïdale) 38.
  2. 1 D INEPT Experience
    1. mis en place un 1D 1 H - 13 C INEPTE expérience pour sonder les pièces très mobiles (sub-µs) de l’Assemblée de protéine.
      NOTE : GARP découplage de quelques kHz au cours de l’acquisition de 39 est couramment utilisé, permettant des courts délais interscan (typiquement 1 s) sans endommager la sonde.
    2. Enregistrer un spectre INEPTE de référence qui sert d’empreinte pour les segments mobiles protéine ; paramètres typiques sont 128 scans et un temps d’acquisition de 25 m
    3. Processus de la 1 H - 13 C INEPTE expérimenter. Le montant ainsi que les positions des signaux sont révélateurs de la quantité de résidus de mobiles et de la composition en acides aminés respectivement.
      Remarque : Enregistrer également un 2D 1 H - 13 C INEPTE expérience si les signaux sont présents dans le spectre INEPTE 1D (voir la Figure 3 pour obtenir un exemple) pour permettre une identification plus spécifique des acides aminés. En cas de cession ambigu, nous vous recommandons de vérifier les positions de signal de composant de mémoire tampon par solution NMR.
    4. Utiliser la base de données BMRB 40 et publié les données 38 pour attribuer les résonances de leur acide aminé correspondant à près de conformation de pelote aléatoire ; le spectre contient uniquement les composants de tampons mobile si non les résidus sont dans un régime très mobile.

Figure 3
figure 3 : résultats représentatifs des Acquisition de spectres SSNMR pour un assemblage de protéines bien structuré. A) 13 FID C détectées d’une expérience de polarisation croisée 1 H - 13 C. Expérience de polarisation croisée de 13 C de 1 H - de B). C) 1 H - 13 Experience C INEPTE d’un assemblage de protéines rigide ; uniquement les composants de tampons sont visibles. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. détermination de structure de l’analyse conformationnelle et 3D

  1. cession de résonance séquentielle
    1. configurer un 2D 13 C 13 C pilotée par le proton spin diffusion (DESD) 41 l’expérience pour détecter les corrélations intra-résidu 13 C - 13 C, y compris les chaînes latérales. Prendre en charge les valeurs de l’étape de polarisation croisée initiale 1 H - 13 C de la 1D 1 H 13 C CP accède.
      1. Définie le temps de mélange à 50 ms pour uniformément 13 échantillons marqués au C et à 100 ms pour sélectivement 13 échantillons marqués au C. Réglez le temps d’acquisition indirecte entre 5-25 ms et l’acquisition directe entre 15 à 25 ms dépendantes de la résolution spectrale intrinsèque, qui peut être estimée par le signal visible dans la longueur de Free Induction Decay (FID) (illustrée dans figure 3 a).
      2. Tester plusieurs paramètres de traitement pour trouver des valeurs optimales en ce qui concerne le signal-bruit et résolution dans le spectre, généralement traitement adéquat peut être réalisé en utilisant une fonction de fenêtre qsine avec un déplacement de bell de sinus (SSB) de 2,5-4.
    2. Mis en place, enregistrement et processus un 2D 13 C - 13 C DESD avec une expérience de temps mélange intermédiaire pour détecter séquentielle 13 C - 13 C corrélations reliant principalement j’ai - i±1, mais aussi i±2 et i±3 résidus, fonction rigidité épine dorsale de protéine et des éléments de structure secondaire. Le temps de mélange devrait être placé entre 100-200 ms pour les échantillons étiquetés de façon uniforme. Toutes les autres valeurs peuvent être repris depuis le court mélangeant temps 2D 13 C - 13 C DESD.
    3. Mis en place, enregistrement et processus un 2D 15 N - 13 C N j’ai CA j’ai et j’ai CO j’ai experiment utilisant un CP 1 H - 15 N et un transfert de 13 C 15 N - CP spécifique 42. optimiser le transfert de polarisation 15 N - 13 C de façon 1D directement sur l’échantillon, basée sur l’intensité maximale dans la région de CA ou de carbonyle, respectivement. Communication graphiqueles valeurs de CAL pour le temps de contact spécifique CP sont entre 2-6 m
    4. mis en place, enregistrement et procédé à une série de 2D 15 N-(13 C-) 13 C des expériences dans le but de l’affectation.
      Remarque : La première valeur du paramètre 15 N - 13 C polarisation transfert seront prélevée le N j’ai CA j’ai / N j’ai CO j’expérimente. Les corrélations intra-résidus sont établies de N j’ai (CA j’ai) CB i et N j’ai (CA j’ai) CO j’ai, en utilisant respectivement rêve 43 et DESD 13 C - 13 C transferts de polarisation. La connectivité séquentielle (i-1) résidus (i) de résidus prélevée sur des N j’ai (CO i-1) CA i-1 et N j’ai (CO i-1) CX i-1 expériences, les deux en utilisant un DESD 13 C - 13 C transfert de polarisation.
    5. Programme d’analyse de choisir un NMR comme CcpNmr analyse 44 ou SPARKY 45
    6. Charger les spectres 2D dans le logiciel (exemplifié par analyse CcpNmr) et charger la séquence protéique primaire.
    7. Commence par l’identification des types d’acides aminés visibles dans le court-mélange 13 C - 13 spectre C DESD. Connecter les atomes de carbone des systèmes de spin pour permettre le " type de résidus " Attribution spécifique ; Voir Figure 4 a de l’affectation d’un résidu thréonine. Identifier les résidus autant que possible ; Cela dépendra de la taille de sous-unité protéique, la résolution spectrale et la dispersion.
    8. Overlay le court-le mélange avec le spectre de la DESD C intermédiaire-mélange 13 C - 13.
      Remarque : Les sommets supplémentaires visibles dans la mélange intermédiaire DESD découlent principalement de séquentiel (résidu i - résidus i±1) contacts. Un exemple d’une affectation de deux résidus séquentiel est illustré dans la Figure 4 b.
      1. Marquer les pics de résonance d’un système de rotation et trouver des corrélations à la DESD intermédiaire-mélange avec des fréquences de résonance des autres systèmes de spins. Dans les petites protéines ou de peptides, il peut être possible d’obtenir la cession de toute résonance séquentielle après des expériences de DESD 2D 13 C - 13 C.
        Remarque : Dans les résidus de motifs brins β structure secondaire i - résidu i±2 13 C - 13 C contacts pourraient montrent des signaux plus intenses que les contacts séquentiels en raison de leur proximité dans l’espace ; dans les résidus de motifs de structure secondaire α-hélicoïdale, contacts de i - résidu i±3 13 C - 13 C peuvent aussi conduire à signaux intenses.
    9. Si intermédiaire-mélange des expériences DESD sélectivement 13 C marqué échantillons sont disponibles, tu les couvriras sur le spectre court-mélange (si disponible sur la sélectivement 13 C marqué échantillon) et assigner le supplemental pics, prenant en compte l’étiquetage sélectif 13 C modèle (1, 3 - 13 C et 2 - 13 C glycérol 32 , 33 ou 1 - 13 C et 2 13 C glucose 29 , 30 , 31.
      Remarque : par exemple, dans un 2 - 13 C glycérol étiqueté échantillon plusieurs types d’acides aminés sont marqués sur la position de Cα sans les carbones adjacents (Cβ et C ') étiqueté, favorisant donc la Cα-Cα transfert entre les résidus adjacents. Dans les échantillons sélectivement marqués, à longue distance 13 C - 13 C corrélations pourraient s’accumuler déjà dans mélange intermédiaire 13 C - 13 C DESD expériences. Si un pic ne peut s’expliquer par une corrélation séquentielle, il peut survenir d’un contact à longue distance. Pour commandé hautement structures sous-unité homogène dans l’assembly macromoléculaire, qu’un jeu de résonances devrait être visible dans le spectre. Si doublé (ou encore multiplié) résonances sont visibles pour les atomes de 13 C ou protéine épine dorsale s’étire, conformations deux (ou plusieurs) pour l’atome ou de la portion de la séquence primaire à l’Assemblée, il existe respectivement,.
    10. Permet d’identifier les fréquences de résonance de 15 N pour chaque résidu le spectre NCA 2D contenant des corrélations de Cα intra-résidu 15 N - 13. Si la résolution dans la dimension de 13 C n’est pas suffisante, utiliser les informations supplémentaires sur la résonance Cβ dans le 2D NCACB d’identifier la fréquence de résonance intra-résidu 15 N.
    11. Utiliser les spectres NCACO contenant intra-résidu 15 N - 13 C - 13 C corrélations et 2D NCACB (i) identifier la fréquence de 15 N intra-résidus et (ii) à lever les ambiguïtés dans les 13 C - 13 C DESD avec l’aide de la dimension supplémentaire 15 N. L’inversion du signal en raison du transfert de rêve conduit à l’observation des corrélations de Cα Cβ typiques pour lequel le signal Cα est positif et le signal Cβ négatif. Plus chaîne latérale 13 C, si elle est visible dans le spectre, redeviennent positifs.

Figure 4
figure 4 : 2 dimensions 13 C - 13 C SSNMR DESD expérimente sur un bien ordonnées, uniformément 13 C, assemblage de protéines marquées N 15. A) bref temps DESD de mélange (mélange de 50 ms). B) cession du tronçon Ile32 - Thr33 2-résidu à l’aide de la superposition de la courte durée de mélange DESD avec un temps de mélange longtemps DESD (mélange de 200 ms). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. détermination de la structure secondaire
    1. utiliser 13 Cα, valeurs des déplacements chimiques Cβ 13 pour calculer le produit chimique secondaire changement 46 ΔδCα-ΔδCβ , indicative de la structure secondaire. Calculer 13 Cα(assigned) - 13 Cα (pelote aléatoire) et 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (pelote).
      Remarque : Les valeurs de déplacement chimique pour les résidus de conformation de pelote aléatoire peuvent provenir de 38.
      1. Terrain ΔδCα-ΔδCβ, positive ou négative des valeurs pour > 3 résidus d’affilée indiquent respectivement les brins β ou conformation α-hélicoïdale ; résidus glycine et la proline peuvent afficher les valeurs des déplacements chimiques inhabituels, comme ils agissent souvent comme " briseurs de structure secondaire ".
    2. Prédire les angles dièdres de protéine de déplacements chimiques affectées OUC TALOS + 47 , 48 PREDITOR 49 , 50. Les prédit des angles dièdres Phi/Psi reflètent la structure secondaire de la Marie de protéine AnesieNIT et sont utilisés comme structurelle retenue tout au long du processus de modélisation.
  2. Collection de contraintes structurelles
    1. Set up et enregistrer un 2D 13 C - 13 C DESD expérimenter un temps de mélange depuis longtemps pour détecter à grande distance 13 C - 13 C corrélations. Un mélange typique fois varient de 400 ms à 1 s. utiliser sélectivement 13 échantillons marqués au C, comme la dilution de spin qui améliore grandement le transfert de polarisation entre les carbones lointains.
    2. Recouvrement le long-mélange 2D 13 C - 13 C DESD enregistrés sur échantillon sélectivement marqué sur le mélange des intermédiaires 13 C - 13 C DESD, si possible enregistrée sur le même échantillon sélectivement marqué. Pics supplémentaires proviennent des corrélations entre atomes de 13 C plus éloignés. Au cours de l’affectation de résonance, prendre en compte le régime d’étiquetage sélectif.
    3. Évaluer attentivement la résolution du spectre afin de définir une fenêtre de tolérance affectation, c'est-à-dire dépendant sur les résonances de résolution spectrale dans une certaine gamme de ppm, que ce qui peut contribuer au signal. L’écart de la précision de cession est calculé automatiquement dans les programmes de cession de NMR comme l’analyse de CcpNmr ou SPARKY.
    4. Si un signal peut être expliqué par une séquentielle (résidu i - i±1 de résidus) ou un milieu de gamme 13 C - 13 C contact (résidu i - résidus j’ai ± 2, 3 ou 4), maintenir cette affectation depuis polarisation relayée transfert peut expliquer le même si la distance de 13 C - 13 C est supérieure à la plage de contact visible attendue corrélation.
    5. Classer les affectations de longue portée 13 C - 13 C contacts dans les signaux de fréquence sans équivoque et ambiguë. Dans le cas de fréquences autorisées sans ambiguïté, affectation de seul résonance est possible par rapport à la fenêtre de tolérance affectation.
      NOTE : Affectations ambigues contiennent toutes les affectations de résonance possible dans la fenêtre de tolérance. Les ambiguïtés peuvent être soulevées simultanément lors du calcul de structure par cycles itératifs d’homonymie issu des structures préliminaires calculés en utilisant seulement les dispositifs de retenue non ambiguës, interprété dans les routines de calcul comme ARIA 51 ou 52 de la UNIO. En outre, les données structurelles provenant de différentes sources biophysiques (p. ex. muté ou tronquée des sous-unités de solution NMR ou cristallographie aux rayons x, les mesures de masse-par-longueur, cryo-EM carte) permet également de réduire le niveau de l’ambiguïté, pour exemples, voir 1 , 3 , 53 , , du 54 55 , 56 , 57 , 58.
  3. détection des dispositifs de retenue de la distance intermoléculaire dans un assemblage de protéines symétrique
    1. mis en place un 2D 15 N - 13 expérience 59 C douleur-CP sur un mixte (50/50) U - 15 N - / U - 13 C marqué sample. Les signaux détectés sur le spectre de la douleur-CP devraient découler de leurs 15 N - 13 C proximités. Utiliser les résonances précédemment assignées pour effectuer l’affectation des contacts intermoléculaires.
    2. Créer un 2D 13 C 13 DESD C avec un temps de mélange long (> 600 ms) sur un (50/50) mélangé (1, 3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glycérol ou (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-échantillon de glucose.
      Remarque : Les signaux détectés dans ce spectre de 13 C - 13 C proviennent de moléculaire inter et intra-13 C - 13 C proximités. Cependant, la complémentarité élevée de ces deux régimes d’étiquetage permet de paires une résonance particulière se poser sans ambiguïté de leurs contacts, par exemple, une sérine CA dans le (2 - 13 C)-glucose marqué sous-unités qui sont corrélés à un CB de sérine à le (1 - 13 C)-glucose marqué des sous-unités.
      1. Overlay le spectre de l’échantillon mélangé aux spectres 2D 13 C - 13 C enregistré sur homogènement étiqueté échantillons de ((1,3-13C) et (2 - 13 C)-glycérol ou (1 - 13 C)- et (2 - 13 C)-glucose échantillons étiquetés). Les signaux supplémentaires dans le spectre enregistré sur l’échantillon mélangé devraient découler de leurs interactions.
  4. Structure de modélisation de données SSNMR
    1. préparer les listes de retenue SSNMR nécessaires pour le calcul de structure : séquence de la protéine (1) ; (2) dispositifs de retenue intra moléculaires distance sans ambiguïté ; (3) restrictions de distance ambigu intra moléculaires ; (4) angle de dièdre TALOS-base restrictions ; (5) dispositifs de retenue inter moléculaires distance sans ambiguïté ; (6) restrictions de distance ambigu inter moléculaires ; (7) d’autres données par d’autres techniques biophysiques (p. ex. les paramètres de symétrie des masse-par-longueur,).
    2. Plusieurs examens donnent un aperçu de la modélisation de structure basée sur des données SSNMR et en conjonction avec les données structurelles complémentaires 14 , 60 , 15 , 19 , , du 61 62 note que les contraintes de distance ambiguë peuvent être désambiguïsés lors du calcul de structure par rapport à l’enquête préliminaire modèles structurels basés sur les restrictions de distance sans ambiguïté. Pour assurer l’exactitude de la structure, observer attentivement si la structure converge vers un seul pli.

Figure 5
figure 5  : Intra - et intermoléculaires contacts dans les assemblys de protéine symétrique. Représentation schématique des intra - et intermoléculaires 13 C - 13 C contacts à longue distance dans un assembly macromoléculaire hélicoïdal. Les sous-unités sont colorées en blanc et rouge pour illustrer l’étiquette mixte des sous-unités ; c.-à-d. avant l’Assemblée, un mélange 1:1 des deux différents régimes d’étiquetage a été réalisé (par exemple 1 - 13 C glucose et 1 - 13 Glucose C). A) intramoléculaire 13 C - 13 C contacts à longue distance (flèche bleue en pointillés) ; B) intermoléculaire 13 C - 13 C contacts à longue distance (rouge déçus des flèches). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Representative Results

Le workflow SSNMR typique comporte plusieurs étapes illustrées dans la Figure 1. Habituellement les sous-unités protéiques sont produites par in vitro expression hétérologue chez e. coli, purifiées et assemblées sous agitation, mais parfois aussi dans des conditions statiques. Expression et purification de la sous-unité de la protéine sont suivis par chromatographie sur gel SDS (Figure 2 a). La formation des assemblages macromoléculaires peut ensuite être confirmée par l’analyse au microscope électronique (EM) (voir la Figure 2 b pour obtenir un exemple d’un assembly filamenteux).

Après l’introduction de l’ensemble de la protéine dans le rotor SSNMR, le rotor est inséré dans le spectromètre, la fréquence de MAS et la température sont réglementés et les spectres sont enregistrés. Premier aperçu peut être obtenue par les techniques de SSNMR 1D. La figure 3 montre un FID SSNMR typique détectée sur le canal 13C sur un échantillon de protéine structurellement homogènes, un 1H13C CP spectre, révélant les résonances de13C présents dans le noyau rigide de la sous-unité de la protéine dans la l’Assemblée et un spectre 2D 1H -13C INEPTE, représentant les résidus mobiles. Pour les idées atomiques dans le noyau rigide de la structure de l’Assemblée, des expériences de SSNMR multidimensionnelle doivent être enregistrées sur uniformément et sélectivement marqués d’échantillons pour les résonances SSNMR d’abord assigner et alors détecter de proximités à longue distance (voir Figure 4 de ).

Tous les spectres sont traités et analysés avec le logiciel adéquat pour attribuer les résonances SSNMR et extraire intra - et les contraintes de distance intermoléculaire (Figure 5). Les contraintes de distance SSNMR sont soit utilisés seul ou en conjonction avec les données techniques complémentaires, qui peuvent être intégrés dans le programme de modélisation.

Pour les structures atomiques représentatives des assemblages macromoléculaires résolus par des techniques SSNMR la Figure 6 illustre plusieurs assemblys filamenteux d’appendices bactériennes et de fibrilles amyloïdes.

Figure 6
Figure 6:filamenteux structures macromoléculaires, déterminées par une approche de RMN à l’état solide : filaments bactériens et des fibrilles de protéine amyloïde. A) pilus de Type 1 des uropathogènes e. coli, PDB code 2N7H 4; B) ASC filament, PDB code 2N1F 63; C) aiguilles de système de sécrétion de Type III, APB codes 2MME, 2LPZ et 2MEX 2,3,64; D) bêta-amyloïde Aß42 fibrilles, PDB code 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,,du6667 et Osaka mutant PDB code 2MVX 57, Iowa mutant PDB code 2MPZ 58; E) Alpha-synucléine fibrilles, PDB code 2N0A 68; F) domaine de prion HET-s, 2RNM code PDB, 2KJ3 69,70. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La RMN à l’état solide (SSNMR) est une méthode de choix pour la caractérisation des assemblages macromoléculaires protéiques au niveau atomique. Une des questions centrales dans la détermination de la structure axée sur les SSNMR est la qualité spectrale du système étudié, qui permet d’établir des modèles structurels 3D de précision différents, qui vont généralement de modèles basse résolution (contenant l’image secondaire structure des éléments et peu d’information 3D) aux structures 3D Pseudo-aléatoire atomiques. La quantité et la qualité des informations structurales extraites des expériences multidimensionnelles de SSNMR est la clé pour calculer une structure RMN haute résolution de l’Assemblée.

Le protocole décrit repose sur la détection de 13C -13C et 15N -13C structurelle retenue nécessitant l’enregistrement de plusieurs spectres 2D (et parfois 3D) avec signal sur bruit élevé. À des fréquences de MAS modérées (< 25 kHz), l’échantillon est introduit dans les rotors avec tailles de 3,2 à 4 mm de diamètre permettant de quantités de protéine jusqu'à ~ 50 mg, dépendant de l’hydratation de l’échantillon. La quantité de l’échantillon à l’intérieur du rotor est directement proportionnelle à la ratio signal-bruit dans les spectres SSNMR, un facteur décisif pour la détection des contraintes de distance longue portée ainsi que leur affectation sans ambiguïté.

La résolution spectrale est un paramètre crucial lors de la cession de résonance séquentielle et la collection de restrictions. Pour obtenir des résultats optimaux, les paramètres de préparation d’échantillon doivent être optimisés, notamment dans la purification de la sous-unité et les conditions de montage (pH, tampon, secouant, température, etc.). Pour l’optimisation de l’échantillon, il est recommandé de préparer les échantillons non étiquetées pour plusieurs conditions distinctes pour lesquelles l’Assemblée a été observée et d’enregistrer un 1D 1H13C CP spectre (décrit à l’étape 2.1) sur chaque échantillon préparé. Les spectres permettent de confronter la résolution spectrale et la dispersion entre les différentes préparations, selon qui les conditions optimales peuvent être jugées.

La qualité des données SSNMR dépend fortement du choix des paramètres d’acquisition du NMR, surtout pour les étapes de transfert de polarisation. L’utilisation des intensités de champ magnétique élevées (fréquence de 1H ≥600 MHz) est essentielle pour la haute sensibilité et résolution spectrale, nécessaire face à des cibles complexes tels que les assemblages macromoléculaires protéiques.

Un facteur limitatif dans bien des cas est la disponibilité de spectromètre. Par conséquent, un choix judicieux des échantillons pour être préparé doit précéder la session spectromètre. Dans tous les cas, uniformément 13C, 15échantillon marqué N est une condition sine qua non pour effectuer l’assignation de résonance séquentielle et intra-résiduelle. Pour les protéines assignés par des techniques de RMN à l’état solide voir71. Détermination de la structure des assemblages macromoléculaires à des fréquences de MAS modérées nécessite sélectivement 13échantillons marqués au C ; pour la détection à longue distance 13C -13C et 13C -15N entre en contact avec échantillons basée sur 1, 3 -13C - et 2 -13C-gylcerol ou 1 -13C - et 2 -13C-glucose étiquetage sont couramment utilisés, comme décrit ci-dessus. Le choix entre les deux régimes d’étiquetage est issu de la spectrale ratio signal-bruit et de la résolution. Pour distinguer entre intra - et intermoléculaires contacts à longue distance, mixtes échantillons étiquetés et dilués ont révélé efficace.

En bref, les étapes essentielles pour une étude structurale de SSNMR atomique sont : (i) la préparation des sous-unités et la nécessité de l’Assemblée d’être optimisée pour obtenir l’excellent échantillon quantitatif et qualitatif, les paramètres de résistance et d’acquisition du champ spectromètre (ii) doivent être choisis avec soin ; (iii) sélectifs étiquetage stratégies sont nécessaires pour une détermination de la structure 3D et la quantité de données requises dépend de la qualité des données et la disponibilité de données complémentaires.

Malgré son applicabilité à un large éventail de systèmes supramoléculaires allant de protéines membranaires à homomultimeric nano-objets, SSNMR est souvent limitée par la nécessité pour les mg-quantités de matériau isotopiquement étiqueté. Les récents développements technologiques en ultra-rapide SSNMR MAS (≥100 kHz) ouvert vers le haut de l’avenue à 1H-détecté NMR et pousser la limite de la quantité d’échantillon minimal pour sub-mg 72,,du7374. Néanmoins, pour des études structurelles détaillées 13C marqué échantillons sont indispensables, ce qui limite l’application de SSNMR d’échantillons rassemblés en vitro ou de systèmes exprimés dans les organismes qui survivent dans un milieu minimal lorsque dans la cellule SSNMR est une nouvelle méthode (pour 75,76,77,78, voir commentaires).

Un facteur important dans l’application SSNMR pour obtenir des structures 3D haute résolution est la résolution spectrale : intrinsèque hétérogénéité conformationnelle dans un assembly peut limiter l’analyse spectrale de spectres et de résolution. Résidus spécifiques 13C étiquetage peut dans certains cas fournir une alternative pour obtenir des informations de distance spécifique sur les résidus de stratégiques afin d’obtenir des modèles structuraux (pour une récente voir du 79,d’exemples80).

SSNMR pour la détermination de la structure 3D nécessite toujours la collecte de plusieurs ensembles de données avec des temps de collection de données souvent long sur des instruments sophistiqués, selon l’approche et le système de plusieurs jours à plusieurs semaines sur un 600-1000 MHz (fréquence de1H) spectromètre. Par conséquent, l’accès au temps du spectromètre peut être un facteur limitant dans une étude approfondie de la SSNMR.

Dans le cas des ensembles de protéines homomultimeric, conduisant à des données SSNMR d’une qualité suffisante pour identifier un grand nombre de contraintes structurelles telles que dans 3,57,64,70, SSNMR ne donne toujours aucun accès aux dimensions microscopiques. Par conséquent, dans une détermination de structure SSNMR de novo d’un assembly homomultimeric, EM ou par longueur-masse (MPL) données idéalement complément données SSNMR pour calculer les paramètres de la symétrie. Données SSNMR seules fournissent atomique intra - et intermoléculaires interfaces

SSNMR est très complémentaire avec les techniques structurelles telles que les mesures EM ou MPL, mais les données peuvent aussi parfaitement être combinées avec la structure atomique obtenue par cristallographie aux rayons x ou la RMN en solution sur des sous-unités mutées ou tronquées. Un nombre croissant d’études se trouvent dans la littérature où la conjonction de différentes données structurelles a permis de déterminer des modèles 3D atomiques des assemblages macromoléculaires (voir Figure 6 exemples représentatifs).

Dans le domaine de la biologie structurale, SSNMR apparaît comme une technique prometteuse pour étudierassemblys insolubles et non cristalline à l’atomique niveau, c.-à-d. fournissant structurelle des données à l’échelle atomique. À cet égard, SSNMR est le pendentif à solution NMR et cristallographie de rayon x pour assemblages moléculaires, y compris les protéines membranaires de leurs assemblées d’environnement et de la protéine natives comme enveloppes virales, bactériennes filaments ou amyloïdes, RNA et Complexes ARN-protéine (voir, par exemple,81). Ses applications hautement versatile in vitro et dans le contexte cellulaire, comme le suivi des modifications de structures secondaires, tertiaires et quaternaires, identification des surfaces d’interaction avec les molécules de partenaire à l’échelle atomique (par exemple, 82) et cartographie dynamique moléculaire dans le cadre des assemblées complexes, indiquent le potentiel important de SSNMR dans de futures études structurales sur les assemblys biomoléculaire complexes.

Composant Moyen de M9
NaCl 0,5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6.7 g/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 ΜM
FeCl3 1 ΜM
CaCl2 100 ΜM
Mélange de vitamine MEM 100 X 10 mL/L
13 C-glucose 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tableau 1 : Composition du milieu minimal d’expression de protéine recombinante production de E. coli cellules BL21.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail est financé par l’ANR (13-CDRP-0017-01 B.H. et ANR-14-CE09-0020-01 à A.L.), « Investissements d’avenir » Programme IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 à B.H.) référence ANR-10-IDEX-03-02 à B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-AJE20140630090 à A.L.), le programme FP7 (pcrd7-personnes-2013-CIG à A.L.) et le Conseil européen de la recherche (CER) en vertu du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (ERC Starting Grant à A.L., contrat N° 639020) et le projet " WEAKINTERACT. »

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. , http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. , http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. , https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. , http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. , http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. , http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Tags

Biochimie biologie structurale assemblages macromoléculaires question 127 la résonance magnétique nucléaire RMN de l’état solide magic angle spinning self-assemblages complexes protéiques fibrilles amyloïdes filaments bactériens
Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon,… More

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter