يوفر هذا البروتوكول تعليمات للمراقبة المباشرة من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. في إليكتروبوراتيون الرحم ، يتم دمج ثقافة شريحة عضوي النمط، والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لدراسة مباشرة وديناميكية آثار أوفيركسريسيون أو دونريغولاتيون من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية المهاجرة وتحليل التمايز أثناء التنمية.
في الرحم إليكتروبوراتيون هو نهج سريع وقوي لدراسة عملية الهجرة شعاعي في القشرة المخية لتطوير الأجنة الماوس. وقد ساعدت على وصف مختلف خطوات الهجرة شعاعي وتوصيف الآليات الجزيئية السيطرة على هذه العملية. لتحليل الخلايا العصبية المهاجرة مباشرة وديناميكية يجب أن تعزى على مر الزمن. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يجمع بين إليكتروبوراتيون الرحم مع ثقافة شريحة عضوي النمط والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر، والذي يسمح لفحص مباشر وتحليل ديناميكي من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. وعلاوة على ذلك، توصيف مفصل من الخلايا العصبية المهاجرة، مثل سرعة الهجرة، وملامح السرعة، وكذلك التغيرات التوجه شعاعي، هو ممكن. طريقة يمكن بسهولة أن تتكيف لأداء تحليلات وظيفية من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية القشرية تهاجر شعاعيا عن طريق فقدان وكسب وظيفة فضلا عن تجارب الإنقاذ. الوقت الفاصلالتصوير من الخلايا العصبية المهاجرة هو للدولة من بين الفن التقنية التي أنشئت مرة واحدة هو أداة قوية لدراسة تطور القشرة المخية في نماذج الماوس من اضطرابات الهجرة العصبية.
القشرة المخية الجديدة هي الموقع الرئيسي للوظائف الإدراكية والعاطفية والحسية. وهو يتألف من ست طبقات أفقية موجهة بالتوازي مع سطح الدماغ. خلال الخلايا السلف التنمية في الجدار الجانبي من تلسينيفالون الظهرية تؤدي إلى الخلايا العصبية الإسقاط التي تهاجر شعاعيا نحو سطح بيال واكتساب هوية طبقة محددة الخلايا العصبية. بعد أن يتم إنشاؤها في المناطق البطين / البطين (ف / سفز) هذه الخلايا العصبية تصبح متعددة الأقطاب عابرة وبطيئة هجرتها. بعد إقامة قصيرة في المنطقة المتوسطة (إيز) أنها تتحول إلى مورفولوجيا القطبين، نعلق على سقالة الدبقية شعاعي، ومواصلة الهجرة شعاعي المنحى في لوحة القشرية (كب). عند الوصول إلى الهدف النهائي إسقاط الخلايا العصبية فصل من العمليات الدبقية شعاعي واكتساب هوية طبقة محددة. الطفرات في الجينات التي تؤثر على خطوات مختلفة من هجرة الخلايا العصبية يمكن أن يسبب تشوه قشري شديد، مثل ليسنسشفويا أو المادة البيضاء تغاير 1 ، 2 .
في الرحم إليكتروبوراتيون هو تقنية سريعة وقوية ل ترانسفيكت الخلايا السلف العصبية في الدماغ النامية من الأجنة القوارض 3 ، 4 . مع هذه التقنية فمن الممكن لضربة قاضية و / أو أوفيركسريس الجينات ذات الاهتمام من أجل دراسة وظائفها في تطوير الخلايا العصبية. وقد ساعدت هذه الطريقة على وجه التحديد لوصف التفاصيل المورفولوجية وتوصيف الآليات الجزيئية لعملية الهجرة شعاعي 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 . الخلايا العصبية المهاجرة شعاعيا تخضع لتغييرات ديناميكية في شكل الخلية، وسرعة الهجرة، وكذلك الاتجاه المهاجرة، والتي تتطلب المراقبة المباشرة والمستمرة مع مرور الوقت. شريحة أورغانوتيبيك كولتووإعادة التصوير الفاصل الزمني متحد البؤر من العقول إليكتروبوراتد تسمح لمراقبة مباشرة الخلايا العصبية المهاجرة مع مرور الوقت. باستخدام هذا النهج مجتمعة، فمن الممكن لتحليل سمات متميزة من الخلايا العصبية المهاجرة التي لا يمكن التحقيق في أقسام الأنسجة الثابتة من العقول إليكتروبوراتد.
طبقنا مؤخرا الفاصل الزمني التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شرائح شريحة من العقول إليكتروبوراتد لدراسة دور عامل النسخ B خلية كل / سرطان الغدد الليمفاوية 11A (Bcl11a) خلال التنمية القشرية 10 . يتم التعبير عن Bcl11a في الشباب الخلايا العصبية القشرية المهاجرة واستخدمنا متحولة أليل Bcl11a أليل ( Bcl11a فلوكس ) 11 لدراسة وظائفها. إليكتروبوراتيون من كري ريكومبيناس جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) في الأسلاف القشرية من Bcl11a أدمغة فلوكس / فلوكس سمح لنا لخلق حالة متحولة الفسيفساء، والتي يتم تحوير عدد قليل من الخلايا فقط فيخلاف ذلك البرية من نوع الخلفية. وبهذه الطريقة، كان من الممكن لدراسة وظائف مستقلة الذاتي الخلية من Bcl11a على مستوى الخلية واحدة. وجدنا أن الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a عرض سرعة منخفضة، والتحولات في ملامح السرعة، وكذلك تغييرات تشبه العشوائية أثناء هجرتها 10 . في بروتوكول المبين وصفنا سير العمل لنجاح إليكتروبوراتيون وشريحة إعداد الثقافة 12 من أدمغة الماوس، فضلا عن الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الثقافات شريحة القشرية.
الهجرة الشعاعية هي عملية رئيسية في تطوير القشرة المخية الجديدة. الطفرات في الجينات التي تؤثر على خطوات مختلفة من هذه العملية يمكن أن يسبب تشوهات قشرية شديدة، بما في ذلك ليسنسيفالي والمادة البيضاء تغاير 1 ، 2 . لقد أظهرنا مؤخرا أن Bcl11a، ا?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر جاكلين أندراتسشك، إيلينا ويرل، ساتشي تاكيناكا، وماتياس توبيرر للمساعدة التقنية الممتازة، وكذلك فيكتور تارابكين للمناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل منحة من دويتشه فورسشونغزجيمينشافت إلى سب (بر-2215).
isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
6-well plate | Corning | 351146 | |
12-well plate | Corning | 351143 | |
non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
horse serum | Gibco | 26050088 | |
BME | Gibco | 41010026 | |
borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
stereo microscope | Leica | M125 | |
inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
hybrid detector | Leica | HyD | |
objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
fast green | Sigma | F7252 | |
laminin | Sigma | L2020 | |
poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
D-glucose | Sigma | G6152 | |
calcium chloride | Sigma | C7902 | |
magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |