Summary
Detta protokoll syftar till att presentera en allmän metod för att visualisera lignin, cellulosa och hemicellulos i växtcellsväggar med användning av Raman-bildbehandling och multivariatanalys.
Abstract
Applikationen av Raman imaging till växtbiomassa ökar eftersom den kan erbjuda rumslig och kompositionell information om vattenhaltiga lösningar. Analysen kräver vanligtvis inte omfattande provberedning; Strukturell och kemisk information kan erhållas utan märkning. Varje Raman-bild innehåller emellertid tusentals spektra; Detta ger upphov till svårigheter när man extraherar dold information, speciellt för komponenter med liknande kemiska strukturer. Detta arbete introducerar en multivariatanalys för att lösa problemet. Protokollet fastställer en allmän metod för att visualisera huvudkomponenterna, inklusive lignin, cellulosa och hemicellulosa i växtcellsväggen. I detta protokoll beskrivs procedurer för provframställning, spektralförvärv och databehandling. Det är högt beroende av operatörskunskap vid provberedning och dataanalys. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan en Raman-undersökning utföras av en icke-specialiserad användare att förvärva higH-kvalitetsdata och meningsfulla resultat för analys av växtcellväggar.
Protocol
1. Provberedning
- Skär ett litet vävnadsblock (ca 3 mm x 3 mm x 5 mm) från växtprovet ( t.ex. en poppelstam).
- Doppa vävnaden i kokande avjoniserat vatten under 30 minuter. Överför det omedelbart till avjoniserat vatten vid rumstemperatur (RT) i 30 minuter. Upprepa detta steg tills vävnaden sjunker till botten av behållaren, vilket indikerar att luften i vävnad har tagits bort och att vävnaden har mjukat.
Obs! För de prover som sjunker till botten före detta steg, upprepa vanligtvis denna cykel 3-5 gånger. - Förbered 20, 50, 70, 90% (volym / volym) alikvoter av polyetylenglykol (PEG) i avjoniserat vatten, såväl som ren PEG, och håll lösningarna vid 65 ° C.
- Inkubera vävnaden i en serie graderade PEG-bad för att förskjuta vattnet och låta PEG infiltrera.
Anm: Typiskt används PEG med en molekylvikt 2000 (PEG2000) för inbäddning.- Bearbeta vävnaden med gRadade PEG i en torkugn enligt följande: (a) 20% PEG under 1 h, (b) 50% PEG i 1,5 h, (c) 70% PEG under 2 h, (d) 90% PEG under 2 h och (E) 100% PEG i 10 h.
- Förvärm en kassett vid 65 ° C i en ugn. Häll PEG som innehåller blocket i kassetten och placera sedan vävnadsblocket i önskat läge med hjälp av förvarmade pincett eller nålar.
- Kyl långsamt ned kassetten och förvara vävnaden vid RT tills användning.
- Dissektera PEG-blocket som innehåller målvävnaden i ett litet block (ca 1 cm x 1 cm x 2 cm) med ett skarpt rakblad och montera det på mikrotomen.
- Skär tunna sektioner från PEG-blocket (vanligtvis 3-10 μm).
- Skölj avsnittet med avjoniserat vatten i ett klockglas 10 gånger för att ta bort PEG från vävnaden.
- Sänk sektionerna med toluen / etanol (2: 1, volym / volym) i 6 h för att avlägsna extraktionsämnena. Förbered reaktionsvätskan genom att blanda 65 ml avjoniserat vatten, 0,5 ml ättiksyra och 0,6 g natriumkloridRite i en bägare. Tillsätt en sektion och 3 ml reaktionsvätska till en 5 ml ampull. Skruva på toppen av flaskan.
- Värm flaskan i vattenbad vid 75 ° C i 2 h för att avlägsna lignin i vävnaden. Skölj avsnittet med avjoniserat vatten i ett klockglas 10 gånger.
- Överför obehandlad / delignifierad sektion till ett glasmikroskopglas. Fäll ut avsnittet försiktigt med penslar eller nålar. Ta bort extra avjoniserat vatten med tissuepapper.
- Sänk in snittet i D 2 O. Täck provet med en glaslock. Försegla locket med nagellack för att förhindra att D 2 O avdunstas.
2. Spektral förvärv
- Öppna instrumentets operativprogram för konfokal Raman-mikroskop. Slå på lasern (våglängd = 532 nm), fokusera på ytan av det kristallina kislet med ett 100X mikroskopmål och klicka på kalibreringsknappen för att kalibrera instrumentet.
- Byt instrumentetTill det optiska mikroskopläget och sätt på mikroskoplampan. Montera mikroskopglaset på scenen, med locket mot målet.
- Se provet med ett 20X-mikroskopmål och lokalisera området av intresse. Applicera nedsänkningsolja på täckglaset och byt till immersionsmikroskopets mål (60X, numerisk bländare NA = 1,35). Fokusera på provets yta.
- Byt instrumentet till Raman testläge och stäng av mikroskoplampan.
- Välj ett kartläggningsområde med hjälp av ett rektangulärt verktyg. Ändra stegstorleken för att bestämma antalet erhållna spektra.
Obs! Var medveten om steget storlek (vanligtvis större än spotdiametern beräknad med målets numeriska bländare, teoretiskt 1,22λ / NA). Storlekar under detta kommer att resultera i översampling. - Ställ in de optimala spektralparametrarna för att få det bästa signal-brusförhållandet (SNR) och spektralkvaliteten under en lämplig uppköpstid (i allmänhet <8 h), depeNding på provets lämplighet. Generellt matar in bildparametrarna i instrumentprogrammet enligt följande: laser (532 nm), filter (100%), hål (300), slits (100), spektrometer (1,840 cm -1 ), spår (1200t) 60X olja) och förvärvstid (2 s).
- Spara spektraldata före databehandling och konvertera dem till ett universellt format ( t.ex. TXT-filer).
3. Dataanalys
- Ladda spektraldata (TXT-filer) i dataanalysprogrammet ( t.ex. Matlab). Applicera en brusreduceringsteknik på datasatsen för att förbättra SNR ( t.ex. Savitzsky-Golay-algoritmen eller wavelet-algoritmen)
- Använd obehandlade prover för att producera bilderna av lignin och polysackarider. För lignin imaging, överväga spektral topp cirka 1600 cm -1 på grund av den aromatiska ringsymmetriska sträckningsvibrationen. För polysackaridavbildning (inklusive cellulosa och hemicellulosa), använd spektral topp aRunt 2,889 cm -1 på grund av CH- och CH2-sträckningarna.
- Använd delignifierade prov för att generera bilderna av cellulosa och hemicellulosa. Utför självmodellerande kurvupplösning (SMCR) på de förvärvade spektra för att diskriminera spektrogen av cellulosa och hemicellulosa och att bilda deras fördelningar.
- Utför huvudkomponentanalys (PCA) och klusteranalys på de förvärvade data för att skilja Raman-spektra från olika cellväggskikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 ger en översikt över ett typiskt mikro-Raman-system för Raman-avbildning av en växtcellsvägg. Som ett exempel har de ursprungliga pilanspektrarna av poplar ( Populus nigra L.) signifikanta baslinjedrifter och spikar ( Figur 2a ). Efter att ha utfört den automatiska förbehandlingsmetoden för Raman imaging data set (APRI), elimineras dessa två spektrala föroreningar framgångsrikt ( Figur 2b ). Ett typiskt poplar av poplar visas i Figur 3 , och dess banduppdrag är listade i Tabell 1 . Ramanbilden av lignin alstras genom integrationen av spektralområdet från 1,550-1,650 cm- 1 , vilket tillskrivs den aromatiska ringstrukturen ( Figur 4a ). Figur 4d visar Ramans bild av polysackarider, whDet uppnås genom att integrera toppen vid 2,889 cm- 1 . För bildcellulosa och hemicellulosa utförs SMCR på Raman-bilddata av ett delignifierat prov. Motsvarande spektra och bilder visas i Figur 5 . Figur 6 presenterar de resultat som uppnåtts genom PCA och klusteranalys.
Figur 1: En schematisk ramanimaging för växtcellsväggen. Tvärsnittsprovet (poppel som ett exempel) mäts med ett mikro-Raman-system som kopplar ett optiskt mikroskop till en Ramans högupplösande spektrometer med en CCD-detektor. I ljusfältbilden är växtcellsväggen organiserad i cellhörnet (CC), sammansatt mittlist (CML) och sekundärvägg (SW). Konventionellt genereras en Raman-bild av single-peakIntegration eller intensitet. Två spektrala föroreningar ( dvs baslinjedrifter och kosmiska spikar) finns i originaldata. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ramanspektra före ( a ) och efter ( b ) förbehandling av APRI. Två spektrala föroreningar avlägsnas framgångsrikt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ett typiskt Raman Spektrum av Poplar Cell Wall. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ramanbilder av Lignin ( a ) och Polysackarider ( b ) i Poplar Cell Wall. Ligninbilden genereras genom att integrera toppen omkring 1600 cm -1 . Polysackaridbilden produceras genom att integrera toppen omkring 2,889 cm -1 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ramanbilder av cellulosa ( a ) och hemicellulosa ( b ) inom populärväggens vägg. SMCR utförs på Raman-bilddata av ett delignifierat prov. Delignification bidrar till exponeringen av spektralegenskaper hos cellulosa och hemicellulosa. Cellulosa är mest koncentrerad i SW, medan fördelningen av hemicellulos är nästan enhetlig i hela poppelväggen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Resultat av PCA och Clustering Analysis för att automatiskt identifiera olika cellväggslag i Poplar Cell Wall. Genom att använda PCA och clustering analys, spektra delas in i fyra delar som motsvarar celllumen, CC, CML och SW. De genomsnittliga spektra för dessa lager anges nedan. Resultaten avslöjade att ligninet är koncentrerat längs CML och i CC, medan polysackariderna huvudsakligen är koncentrerade i SW. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Wavenumbers (cm -1 ) | Komponenter | Uppgifter |
| 1095 | Cellulosa, hemicellulosa | Tung atom CC och CO sträckande vibrationer |
| 1123 | Cellulosa, hemicellulosa | Tung atom CC och CO sträckande vibrationer |
| 1163 | Cellulosa, hemicellulosa </ Td> | Tung atom CC och CO sträckningsvibration plus HCC och HCO böjningsvibration |
| 1275 | Lignin | Aryl-O av aryl OH och aryl-O-CH3; Guaiacylring med C = O-grupp |
| 1331 | Lignin, cellulosa, hemicellulosa | HCC- och HCO-böjningsvibrationer |
| 1378 | Cellulosa, hemicellulosa | HCC, HCO och HOC böjningsvibrationer |
| 1460 | Lignin, cellulosa, hemicellulosa | HCH och HOC böjningsvibrationer |
| 1603 | Lignin | Arylring sträcker vibrationer, symmetrisk vibration |
| 1656 | Lignin | Ringkonjugerad C = C sträckningsvibration av koniferylalkohol; C = O sträckande vibration av coniferaldehyd |
| 2889 | C, H | CH och CH2 sträckande vibrationer |
| L, C, H | CH sträcker vibrationer i OCH 3 asymmetrisk vibration |
Tabell 1: Raman Peak-positioner och banduppdrag
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Växthusväggen är en komposit som är organiserad i flera lager, inklusive cellhörn (CC), sekundärvägg (SW, med S1, S2 och S3-skikten) och sammansatta mittskivor (CML, mitt lamell plus angränsande primär Vägg), vilket gör det svårt att erhålla en plan yta under provberedningen. Således måste växtprover, särskilt gräs, som har en mer komplicerad struktur än trä, ofta stelna för att möjliggöra fin snittning. PEG är en idealisk hårdmatris för skärning och Raman-undersökning, eftersom den är löslig i vatten. Det kan lätt avlägsnas genom sköljning med avjoniserat vatten. PEG som används för inbäddning har olika molekylvikter, varierande från 1 000-20 000. Ju högre molekylvikten för PEG är, desto lägre penetreringsförmåga 10 . D 2 O hjälper till att minska fluorescensen av lignin och har en märkbar topp vid 2,490 cm -1 , men det kommer inte att eliminera fluorescensinterferensen. TvåStora ljudsignaler spolas över i kanalerna, tillsammans med de faktiska signalerna: 1) Prov- och bakgrundsfluorescens samt termiska fluktuationer av CCD kan resultera i baslinjens drift och 2) kosmiska strålar kan påtagligt påverka de känsliga detektorerna, vilket manifesterar sig i Spektra som smalbandbreddspikar. APRI-metoden utvecklades för att lösa dessa problem 11 . APRI inkluderar de adaptiva iterativt reweighted penalized minsta kvadraterna (airPLS) och huvudkomponentanalysen (PCA) för att eliminera baslinjens drift och kosmiska spikar genom att använda de spektrala egenskaperna själva.
För att uppnå distributionsbilder bör man välja hög intensitet / integrering och helspektra linjär montering med multivariata metoder. Den tidigare är lämplig för komponenterna med specifika ramantoppar ( t.ex. lignin), medan den senare är lämplig för komponenterna med stark spektral överlappning ( t.ex. cellulosa och hemicellulosa). DistriButionsbilder av lignin och polysackarider är tillgängliga genom att integrera de specifika topparna runt 1600 cm- 1 respektive 2,889 cm- 1 (Figur 4). Bilderna av cellulosa och hemicellulos är emellertid svåra att direkt generera genom toppintegration på grund av den starka spektralöverlappningen. Multivariatanalys gör det möjligt att sortera det sammanfattade informationsinnehållet enligt hypotesen att de ursprungliga uppgifterna rekonstrueras från ett begränsat antal betydande faktorer 12 . Det kan således tillämpas för att diskriminera deras spektra och att producera motsvarande Ramanbilder. För växtprover stör närvaron av extraktionsmedel och lignin förmågan att rekonstruera spektra av cellulosa och hemicellulosa. Det är nödvändigt att avlägsna dessa störningar före SMCR-analysen av bildningsdata. SMCR introducerades först av Lawton och Sylvester som en multivariat teknik som speciellt utvecklats för att lösa en ren komponent fRom en uppsättning spektra, utan att använda ett spektralbibliotek, för att analysera bildningsdata 13 . Spektral klassificering är viktig för att ytterligare förstå den strukturella och kemiska naturen hos växtcellsväggen. Här har avbildningsdata utsatts för huvudkomponentanalys (PCA) och klustringsanalys för att skilja Raman-spektra från olika cellväggskikt 14 .
Emellertid har denna teknik två begränsningar. Först är Raman-effekten svag. Den typiska totala Raman-spridningstvärsnittet är ~ 10-29 cm 2 per molekyl, vilket gör den sårbar mot intensiv fluorescens 15 . Ett möjligt sätt att förbättra defekten är att förbereda sektionerna så tunt som möjligt och tillämpa en baslinjekorrigeringsalgoritm men fluorescerande signaler är svåra att ta bort. För det andra är kemisk behandling ett signifikant förfarande när man uppnår Raman-bilder av cellenUlos och hemicellulosa, och det kan öka risken att ändra det ursprungliga kemiska innehållet. Därför är det bäst att ta bort extraktionsämnena och lignin så mycket som möjligt, utan att cellväggstrukturen ser för annorlunda ut än den obehandlade.
Sammanfattningsvis är detta protokoll lämpligt för att studera fördelningen av lignin, cellulosa och hemicellulosa inom växtcellsvägg. Användning av Raman-avbildning för att erhålla den önskade informationen är starkt beroende av operatörskunskapen vid provframställning och dataanalys. God provberedning är viktigt för att samla högkvalitativa Raman-spektra. Lämplig dataanalys ger insikter i storskaliga spektra och extraherar den dolda informationen från bilden. Som en grundläggande metod kan detta protokoll användas för att spåra de dynamiska förändringarna hos huvudkomponenterna vid kemisk, fysisk eller biologisk behandling på mikronivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Kinas ministerium för vetenskap och teknik (2016YDF0600803) för det ekonomiska stödet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
