Summary
Эта статья описывает метод для вставки полые связующим звеном между спинного пни после полного перерезка и заполнить Шванновские клетки (СКС) и инъекционные базальной мембраны матрицы для моста и способствуют регенерации аксона через пробел.
Abstract
Среди различных моделей для спинного мозга крыс наиболее часто используется модель ушиба, потому что это наиболее распространенный тип спинного мозга человека. Полный перерезка модель, хотя не как клинически значимых как модель ушиба, является наиболее строгий метод оценки регенерации аксона. В модели ушиба трудно отличить регенерированного из проросших или пощадил аксоны благодаря наличию остающихся пост повреждения тканей. В модели полного перерезка метод перемычки необходимо заполнить этот пробел и создать преемственность с ростральной хвостового пни для того чтобы оценить эффективность лечения. Надежный мост хирургия имеет важное значение для проверки исходов снижая изменчивость из-за хирургический метод. Протоколы, описанные здесь используются для подготовки Шванновские клетки (СКС) и трубопроводы до трансплантации, полный перерезка спинного мозга на грудном уровне 8 (T8), вставить каналом и пересадить СКС в канал. Этот подход также использует в situ гелеобразующего инъекционные базальной мембраны матрицы с SC трансплантации, который позволяет улучшенная аксона роста через интерфейсы ростральной и хвостового с ткани макроорганизма.
Introduction
Ремонт повреждений спинного мозга является сложной и трудной проблемой, которая потребует стратегии комбинаторного лечения с участием, например, использование клеток и биоматериал обеспечить благоприятное микроокружение для функции пересаженных клеток и аксон Регенерация на месте травмы. Гемисекция1,2,3,4,5,6,,78,9 и полный перерезка10 ,11,12,13,14,,1516,,1718,19 ,20,,2122 модели часто используются для оценки последствий на основе биоматериала преодоление терапии. Преимущество использования гемисекция модель является, что он обеспечивает большую стабильность для моста конструкции, по сравнению с полной перерезка. Однако в моделях гемисекция, трудно доказать регенерации аксона как результат прикладной терапевтического метода связано с наличием пощадил ткани. Полный перерезка модель является наиболее строгий метод продемонстрировать регенерации аксона.
Были изучены различные природные и синтетические материалы для использования в качестве инъекционный гель, предварительно сформированных гель помещается в ушиб или гемисекция модели, или как структурированной каналом в гемисекция или завершить перерезка модели (подробные отзывы23 , 24 , 25). в situ гелеобразующего смеси инъекционные матрица/SC создает более либеральными интерфейс между трансплантации и принимающей шнур для axon пересечения26,27 по сравнению с предварительно загущенное матрица/SC имплантатов 5 , 18 , 19 , 28. в situ гелеобразующего допускается матрицы контур вокруг нерегулярных хост интерфейсов, в то время как более жесткой и структурированных каналом или менее moldable предварительно сформированных гель не может. Структурированный каналом часто обеспечивает контакт руководство и имплантат стабильность в отличие от инъекционного матрицы. Протоколы, здесь представлены описания хирургическая процедура, которая использует матрицу инъекционные базальной мембраны (например, matrigel, см. Таблицу материалы, упоминаемые как инъекционные матрицы здесь) и структурированных каналом для Оцените регенерации аксона в самые строгие модели травмы спинного мозга.
Electrospun поли vinylidenedifluoride трифторэтиленом (PVDF-ТрФЭ) соответствие волокнистых полые трубы используются в нашем экспериментальном подходе. PVDF-ТрФЭ является пьезоэлектрический полимер, который генерирует переходных заряда, когда механически деформируется и показал neurite расширение и аксон регенерации в vitro29,30 и в естественных условиях 31. Electrospinning является распространенным методом изготовления лески, который может быстро производить надежные волокнистых подмостей, с использованием различных полимеров с управляемыми свойствами, такими как выравнивание волокна, волокна диаметр и толщину лески для Нейронные и других приложений32,,3334.
Многочисленные исследования крыс SCs, пересаженные в сайты травмы спинного продемонстрировали лечения эффективность5,9,18,19,20,21 ,26. Эти трансплантаты являются нейропротекторной для ткани вокруг очага поражения, уменьшить размер полости поражения и способствуют регенерации аксона в сайт поражения/трансплантации и миелинизации регенерированный аксонов. Можно autologously трансплантированы человеческой SCs, преимущество по сравнению с большинством других связанных с нервной клетки24. После биопсии периферических нервов, СКС может быть изолированный и очищенный и будет распространяться на нужную сумму для трансплантации в людей. Аутологичной трансплантации SC для позвоночника пациентов было доказано быть безопасными в Иране35,,3637,38, Китай39,40и 42Соединенные Штаты41,. СКС, как известно, выделяют многочисленные нейротрофических факторов и белков внеклеточного матрикса, важное значение для роста аксона и играть важную роль в регенерации аксона после травмы периферических нервов. Наша цель здесь — для описания методов, которые можно исследовать трубы конструкции улучшить результаты трансплантации SC в полной крыса спинного перерезка модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
самок взрослых Фишер (180-200 г веса тела) размещаются согласно низ и USDA руководящие принципы. Институциональные животное уход и использование Комитет (IACUC) из университета Майами одобрил все животные процедуры.
1. подготовка предварительного трансплантации
- каналом подготовки.
- Вырезать трубы до 5 мм в длину, с помощью #10 лезвия под микроскопом рассечения.
Примечание: Внутренний диаметр трубы составляет 2,4-2,7 мм; наружный диаметр составляет 2,5-2,8 мм. - Сложить трубы аккуратно вдоль продольной стороны ( рис. 1A). Вырежьте четыре небольшие надрезы длиной 0,4 мм и по крайней мере 1 мм от отверстия трубы и около 1 мм друг от друга с помощью прямой край беззаботными ножницы ( рис. 1B).
- Разворачиваться канала ( рис. 1 c) и вырезать между двумя разрезами вдоль той же стороны, создание двух окон бок о бок ( рис. 1 d). Убедитесь, что окна можно открывать и закрыты должным образом вдоль стороны режиссерский.
- Стерилизации труб в 75% этанола для 25 мин в чашке Петри 10-см. Промыть трубопроводы для 4 мин с 1 x-фосфатный буфер (PBS) и передачи проводники стерильным пинцетом новой Петри 10-см. Промыть трубопроводы дважды с PBS 1 x 25 мин.
- Хранить проводники в однократном ПБС до хирургии.
Примечание: Многие каналы можно стерилизовать одновременно. Хранить проводники в отдельный стерильный 1,5 мл пробирок держать их стерильными.
- Вырезать трубы до 5 мм в длину, с помощью #10 лезвия под микроскопом рассечения.
- Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)-подготовка Шванновские клетки (SC)
- подготовить очищенный SC культур от большеберцового нервов взрослых женщин Фишер крыс как описано 43. По завершении этого шага, тарелка СКС на поли L-лизин (PLL)-покрытием Петри 10 см и поддерживать в среде D10/3 М; Эти SCs, определяются как проход 0.
Примечание: D10 / 3M среды состоит из следующих: экстракт 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллин стрептомицином (ручка/воспаление), 20 мкг/мл гипофиза, форсколин 2 мкм, 2,5 Нм heregulin в Дульбекко ' s изменение орел ' s среднего (DMEM). - Пополняться свежими среднего D10 / 3M (7 мл/10-см Петри) каждые 3-4 дня.
- Сплит SC культуры после того, как он достигает 70-80% слияния.
- Удалить среднего и дважды промыть Хэнк ' s сбалансированного солевого раствора (HBSS) без кальция или магния.
- Добавить 5 мл 0,25% трипсина/ЭДТА в каждой чашке Петри 10 см и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
- Добавить 5 мл D10 среднего (10% FBS и 1% перо/воспаление в среде DMEM) в 50-мл пластиковых пробирок для нейтрализации трипсина. Решение
- нежно накапайте трипсина/ЭДТА в Петри блюдо несколько раз, чтобы отсоединить SCs. Удалите суспензию клеток от блюдо и поместить его в пластиковых пробирок, подготовленных на предыдущем шаге. Промойте блюдо с 5 мл среды D10 и поместить его в пластиковых пробирок для максимального урожая ячейки.
- Центрифуга клетки на 370 g x 5 мин на 4 o C. удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в среде D10/3 M 4 мл для каждого разбиения Петри.
- Обойтись 1 мл суспензии SC и 6 мл среды D10 / 3M в чашке Петри 10-см; каждый Петри Сплит приведет к 4 чашки Петри. Эти SCs, определяются как проход 1.
- Пополните со свежими D10 / 3M средний день после покрытия и каждые 3-4 дня после покрытия.
- Раз SCs достичь слияния 70-80%, повторите шаги 1.2.3.1 на 1.2.3.6. СКС в настоящее время на прохождение 2.
- Передают СКС, после достижения 50% слияния, с лентивирусные векторное кодирование гена GFP в D10 / 3M среднего ночь на разносторонности инфекции 30 как описано 44 , 45 .
- Пополнения со свежими D10 / 3M средний, на следующий день и каждые 3-4 дня после покрытия.
- После GFP-СКС достигает 70-80% слияния, повторите шаги 1.2.3.1 для 1.2.3.5 но Ресуспензируйте GFP-СКС в 6 мл D10 среды вместо. Отказаться от 15 мкл суспензии GFP-SC в 1,5 мл пластиковых пробирок и 15 мкл раствора Трипановый синий 0,4%. Осторожно проведите пластиковых пробирок и лунки 10 мкл смеси в камеру подсчета клеток слайда.
- Слайд в счетчик автоматизированной клеток и определить плотность клеток.
- Центрифуга клетки на 370 g x 5 мин на 4 o C. удалить супернатант, Ресуспензируйте с 1,5 мл замораживания среды для каждого 3 х 10 6 GFP-СКС. дозировки 1,5 мл суспензии GFP-SC в криогенных флакон и заморозить в -80 o C для по крайней мере за 24 часа до переезда в жидкий азот для хранения.
Примечание: Замораживание среднего: 25% FBS и 8% диметилсульфоксида в среде DMEM. - Оттепель GFP-СКС за одну неделю до операции.
- Добавить 10 мл D10 среднего в 50 мл пластиковых пробирок.
- Оттепель флаконов замороженных GFP-СКС в водяной бане на 37 o C до тех пор, пока частично оттаяла.
- Удалить GFP-SC подвеска из криогенных флакона и поместите его в 50 мл пластиковых пробирок, подготовленный в 1.2.8.1. Аккуратно накапайте раствор вверх и вниз несколько раз.
- Центрифуга клетки на 370 g x 5 мин на 4 o C. удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в среде D10/3 M 4 мл для каждого флакона оттаяла.
- Отказаться от 2 мл GFP-SC подвеска и 5 мл среды D10 / 3M в чашке Петри 10-см; каждый флакон следует привести к 2 чашки Петри. GFP-СКС определяются как проход 3.
Примечание: Петри 10 см обычно дает около 8 х 10 6 GFP-СКС после одной недели.
- В день операции, повторите шаг 1.2.6. Использование, плотность клеток рассчитаны на шаге 1.2.10. Трубы
- дозировки аликвоты 3 х 10 6 GFP-СКС в стерильных 1,5 мл центрифуги, основанный на плотность клеток рассчитывается от шага 1.2.9. Центрифуга аликвоты GFP-SC на 370 g x 5 мин на 4 o C и удалить супернатант. Добавьте 1 mL среде DMEM/F12 к каждому Алиготе и центрифуги на 370 x г.
Примечание: Каждое животное получает 3 х 10 6 GFP-СКС. Средний с сыворотка используется с GFP-СКС до этого шага. - Держать GFP-СКС на льду до момента трансплантации.
- подготовить очищенный SC культур от большеберцового нервов взрослых женщин Фишер крыс как описано 43. По завершении этого шага, тарелка СКС на поли L-лизин (PLL)-покрытием Петри 10 см и поддерживать в среде D10/3 М; Эти SCs, определяются как проход 0.
2. Полный перерезка на грудном уровне 8 (T8)
- животных подготовка к операции
- Anesthetize девушки Фишер крыса (180-200 г) с внутрибрюшинного введения кетамин (60 мг/кг массы тела) и ксилазина (5 мг/кг веса тела). Контроль глубины анестезии перед переходом к следующему шагу, проверяя мыс щипать и глаз мигает ответы.
- Бритья задней Крыса с электрической машинки и протрите кожу на 70% спирте. Применить глазные смазки для обоих глаз. Перенесите животное в хирургии на грелку для поддержания температуры тела на около 37 o C. место животное на рулон таким образом позвонков легко получить доступ к.
Примечание: Рулон могут быть сделаны из бумажное полотенце или 2 в x2 в марлю, которые можно стерилизовать. Большие рулоны, рекомендуется, когда T7-T9 должен быть заложен плоский поверх рулон.
- T7 T9 Ламинэктомия
- найти ориентир для остистого отростка Т9-T11.
Примечание: Пробелы между T9, T10, T11 малы по сравнению с другими сегментами яn региона. После размещения крысы на рулон, Т9-T11 остистых отростков будет чувствовать себя как маленький треугольный удар через кожу. - Сделать 4-5 см срединной линии разреза кожи с помощью лезвие #10 от T4 T11. Сделать небольшой надрез в поверхностный слой жира с изогнутые ножницы с тупыми концами для того чтобы рассечь жир.
Примечание: Другие виды инструментов может использоваться для разделения жира, но изогнутые ножницы с тупыми концами включить наиболее эффективным и наименее инвазивных метод для разделения жира. - Найти T7 для T9 остистого отростка, с использованием задней лезвие #10. Держите мышцы на о T4 с тупым щипцами и надрезают в мышцу вдоль каждой стороны позвонков от T6-T10. Сделать разрез ближе позвонков как можно сделать отверстие чистым и минимальной травмы животного.
- Изолировать каждый индивидуальный остистого отростка от T7 T9 путем сокращения мышц и связок между Т6 и Т7, T7 и T8, Т8 и Т9 и T9 и T10 с лезвием #10.
- Использовать rongeur для удаления любых мышц и связок на пластинки из T7 T9. Удаление мышц и связок максимально сбоку до тех пор, пока разрыв между поперечной процессы от T7 T9 видны.
- Удалить Т9 остистого отростка с rongeur. Держите T8 остистого отростка с тупым щипцы и подъемник осторожно, чтобы поднять T9 пластинки в небольшое отверстие между процессами T9 и T10.
- Удаление пластинки, начиная от открытия и перемещение рострально с rongeur на T9. Удаление пластинки боково насколько это возможно; спинной корни должны быть видны после ламинэктомии.
- После удаления пластинки, повторите этот процесс для T8 и Т7.
Примечание: Во время ламинэктомии, используйте поглощения Спирс для удаления крови продолжая Ламинэктомия. Если избыточное кровотечение происходит, место сжатый губки на объекте кровотечения и добавить физиологического раствора, чтобы помочь с свертывания крови.
- найти ориентир для остистого отростка Т9-T11.
- Перерезка в T8
- место втягивающего устройства вокруг T7 T9. После того, как будут удалены все пластинки, убедитесь, что разрыв между поперечных отростков видны, особенно на Т8. Также рассмотреть кости вдоль длины с обеих сторон между T7 T9 обеспечить есть нет костных фрагментов, выступающие наружу.
Примечание: Этот разрыв в T8 имеет важное значение для выполнения полного перерезка. Позвонков по длине должны быть удалены для более каналом. - Вырезать дорсальной и вентральной корни выше и ниже с помощью T8 угловые ножницы весной. Добавить физиологического раствора в спинной мозг и ждать крови сгусток.
Примечание: этот шаг имеет важное значение для правильного канала вставки. - Место ножницы угловой весной выше спинного мозга в зазорах между поперечных отростков на Т8 и сделать один разрез полностью разорвать спинного мозга. Место небольшой кусок сжатых пены в результате 2-2,5 мм зазор и добавить физиологического раствора в область сразу.
- место втягивающего устройства вокруг T7 T9. После того, как будут удалены все пластинки, убедитесь, что разрыв между поперечных отростков видны, особенно на Т8. Также рассмотреть кости вдоль длины с обеих сторон между T7 T9 обеспечить есть нет костных фрагментов, выступающие наружу.
3. Каналом вставки
- во время ожидания пни разорвала шнур для достижения гемостаза, вывезти каналом с ПБС. Вырезать поглощения треугольников на тонкие длинные кусочки и поместите их в трубы для удаления избыточных PBS. Проверьте, что предварительно нарезанные окна открыты.
- Удаления солевых и крови, используя тонкие длинные куски поглощения треугольников. Поднимите две пни спинного мозга с помощью microspatula, чтобы гарантировать хорошее разделение. Аккуратно поднимите ростральной пень с microspatula и скольжения труба над пень с окнами, выходящими себя. Убедитесь, что весь пень вставляется и не избыточное кровотечение в канал.
- Осторожно поднимите каудальной культю и скольжения на другом конце канала над культи. Убедитесь, что весь пень вставляется и окна на дорсальной поверхности ( рисунок 2A).
4. Шванновские клетки / инъекционные матрицы (см. таблицу материалы) подготовка и инъекций
- во время ожидания разорвала шнур для достижения гемостаза, удалите средний выше GFP-SC Пелле (подготовленных на шаге 1.2). Ресуспензируйте GFP-СКС в 10 мкл холодной среде DMEM/F12. Добавить 10 мкл холодной инъекционный гель суспензию клеток и перемешать хорошо повторил закупорить. Держите GFP-SC/DMEM/F12/инъекционные матрица смеси на льду до завершения вставки каналом.
- После того, что windows на дорсальной поверхности являются открыть ( рисунок 2A), придать 20 мкл GFP-SC/DMEM/F12/инъекционные смеси матрица трубы через один из предварительно нарезанные windows 46 с помощью загрузки подсказки и микропипеткой западную помарку. Если смесь матрица SC/DMEM/F12/инъекций следует переполнения канала, удалите избыток с поглощения треугольников. Закройте окна после инъекции; ушивание не требуется ( рис. 2B).
5. Закрытие и послеоперационный уход
- шов мышцы слои и поверхностные слои жира. Очистите кожу с 70% этанола и затем штапель (например, с помощью раны клипы) кожи закрыты. Держите животных в термически регулируемых инкубатор, до тех пор, пока они восстановить сознание. Трансфер обратно в клетки животных. Обеспечить водой с давно питания трубки и место питания гранул на постельные принадлежности для легкого доступа.
- Администрирование бупренорфин (0,1 мг/кг массы тела) дважды в день в течение 3 дней, подкожно, начиная сразу после операции, чтобы уменьшить боль. Придать гентамицина (5 мг/кг массы тела) подкожно раз в день в течение 7 дней сразу же после операции для предотвращения и сокращения инфекции. 10 мл раствора лактат Ringers вводить подкожно дважды в день в течение 7 дней для гидратации.
- Пустые резервуары вручную два раза в день до мочевого пузыря функция возвращает. Если инфекция мочевого пузыря возникает, то управлять 10 мл физиологического раствора подкожно, пока моча становится ясно. Если нет улучшения в течение двух дней, придать гентамицина (5 мг/кг веса тела, один раз в день) подкожно до тех пор, пока моча становится ясно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель использования этой хирургической техники заключается в оценке использования структурированных каналом и инъекционные матрица, которая максимизирует SC функция после пересадки в завершенных пересекал шнуры спинного мозга. Через три недели после пересадки, животных увлажненную с параформальдегида 4% и спинного колонны грубо расчлененные и исправлена в же фиксатором для еще 24 часа. Спинного мозга затем расчлененные и образцы для криостата сагиттальной разделов помещаются в 30% раствор сахарозы для криозащиты. 1 мм толщиной сечения изолированы от середины моста SC другого набора расчлененных связок позвоночника помещаются в глютаральдегид фиксатором для обработки пластиковых секций. Образцы подвергаются расписание для электрона микроскопических подготовки подробно по Бейтс et al. 47. криостата сагиттальной разделы были immunostained с основного антитела против GFP, глиальные фибриллово кислой белка (СВМС), тяжелые цепи neurofilament (RT97) и средней цепью neurofilament (NF) следуют вторичных антител, в том числе Коза анти курица-488, коза анти кролик-546, коза анти мышь-647 и коза анти кролик 647, соответственно. GFP-СКС были равномерно распределены вдоль и внутри трубы (рис. 3A, внутренние стены, обозначается желтой линии). Регенерации аксона наблюдается (рис. 3B) и тесно связан с наличием GFP-СКС (Рисунок 3А и рис. 3 c) указанием, что этот метод является успешным в обеспечении СК мост в рамках структурированных каналом и в способствует регенерации аксона вдоль моста между ростральной и хвостовой пни. Кровеносные сосуды и Миелинизированные аксоны были также обнаружены в центре СК мост (рис. 3D). Более подробную информацию о влияние СКС с electrospun PVDF-ТрФЭ волокнистых труб на регенерации аксона можно найти в нашей недавно опубликованной работе31.
Другие результат меры может быть выполнена включая: количественная оценка регенерации аксона в сагиттальной секций по линии разрез методом, описанным в нашей недавней работы31 и количественной количество Миелинизированные аксонов и судов в пластиковых сечений. Образцы, подготовленные для пластиковых секций можно далее секционного для просвечивающей электронной микроскопии для количественного определения количество unmyelinated аксоны. Cryoprotected спинного образцы также могут быть поперечном вместо sagittally секционного и immunostained поддается регенерации аксона и присутствие GFP-СКС. поведенческие тесты могут также выполняться на животных через соответствующие промежутки времени во время ведутся животных.
Рисунок 1: окно подготовки в канал. Сложите одну сторону вдоль продольной оси 5 мм труба (A). Вырежьте четыре надрезы длиной 0,4 мм и по крайней мере 1 мм от отверстия трубы (B). Каждый разрез — около 1 мм друг от друга. По разворачивается каналом, 4 параллельные разрезы наблюдаются (C). Вырежьте между двух разрезов вдоль ростральной хвостового оси для создания окна, который может быть открыт путем подъема заслонки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: закрытие окна после инъекции SC/DMEM/F12/матрица. Путем складывания обратно каждый клапан после размещения связующим звеном между ростральной и хвостовой пни (A) открываются окна. Окна будут закрыты после инъекции (B). Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Confocal флуоресцентного изображения сагиттальной секций и светлые области изображения пластиковый сечения от спинного мозга шнуры, пересаженные с GFP-СКС в соответствие волокнистой трубы PVDF-ТрФЭ. Обзор SC моста в каналах, где внутренние стены обозначается желтой линии и immunostained для GFP и глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) для визуализации пересаженные СКС и принимающих спинного астроциты, соответственно. Регенерированный аксоны были помечены RT97 (тяжелые цепи neurofilament) (A, B) и средне цепь neurofilament (NF, C) антител. Аксоны не видны как в (A) из-за их тесной связи с GFP-СКС как наблюдается в регионе среднего канала (C) с большим увеличением. Аксоны не видны в ростральной культю из-за неполной проверки в глубине участка ткани, когда воображения confocal микроскопии. В регионе середину Трубы пластиковые секции наблюдались кровеносных сосудов (помечены как v ре) и Миелинизированные аксоны (помечены как ма в D). Увеличениях и масштаба бары: A, B (10 x, 200 мкм); C (20 x, 100 мкм); D (63 x, 25 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным этапом в создании эффективной перерезка модели разрыва спинного мозга в одной или двух разрезов. 2-2,5 мм зазор между ростральной и хвостовой спинного пни должны присутствовать на сайте перерезка. Три наиболее вероятные причины такой разрыв не появляется являются (1) спинной/вентральный корни не были удалены правильно, (2 брюшной Дура не был должным образом удален, или (3 животное не был должным образом позиционируется на рулон, помещены под ней.
Для выполнения вставки эффективным каналом между пней: (1) диаметр трубы должны быть адаптированы для конкретных видов и возраста животного, используемых в эксперименте; (2) пластинки должны быть удалены боково достаточно до тех пор, пока разрыв между поперечной процессы могут быть визуализированы; (3) корни должны быть удалены и (4) канал вставки между пни должно быть выполнено на первой попытке. Если требуется несколько попыток, это может вызвать отек в пни, далее осложняет задачу канала вставки между пней и вызывая дополнительные травмы.
Для выполнения эффективного GFP-SC/DMEM/F12/инъекционные матрица введение в канал, убедитесь, что: (1) спинного мозга не кровотечение перед каналом вставки между пни. Если есть жидкость в труба после вставки между пни, используйте небольшой кусок поглощения копье удалить его через предварительно нарезанные windows. (2) убедитесь, что труба поскользнулся на обоих спинного пни хорошо и (3), что спинной нарезанные окна открыты. Инъекции 20 мкл SC/инъекционные смеси матрица должна быть более чем достаточно, чтобы заполнить трубы. Переполнение от нарезанные windows является хорошим показателем для эффективного трансплантации.
Ограничения этой процедуры являются: (1) восстановление Дура, (2) никакого контроля над движением каналом/SC трансплантации после завершения операции и (3) не альтернативный метод если есть утечка во время инъекций SC/инъекционные смеси матрицы.
Преимущество этой процедуры является сочетание использования обоих структурированной каналом с инъекционными матрицы. В этой хирургической процедуры может использоваться любой трубопровод, сделал с материалом выбора, податливой вставляется между пни. Может также использоваться любой инъекционные матрица выбора в этой процедуре; Температура чувствительные гель предпочтительнее из-за его способность геля in situ и контур формы культи, создание бесшовные интерфейса. Каналы с более сложной внутренней структуры может использоваться вместо полые интерьер. Наркотики, факторы роста, малые молекулы или любой тип клеток могут быть включены в структурированных каналом или инъекционные матрицы или оба повысить выживание пересадки, нейронные защиты сразу после травмы, уменьшить воспаление, содействовать аксон Регенерация и поощрять ангиогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить вирусный вектор и животных ядер в Майами проекта для лечения паралича для производства lenti-GFP-вирус и обеспечение ухода за животными, соответственно, гистология и изображений ядра для использования криостат, конфокального микроскопа, и Флуоресцентный микроскоп с стерео следователь. Финансирование было предоставлено NSF (DMR-1006510), NINDS (09923) и МО (W81XWH-14-1-0482). М.б. Бунге является Кристина E Линн Уважаемый профессор неврологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
- King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
- Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
- Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
- Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
- Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
- Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
- Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
- Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
- Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
- Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
- Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
- Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
- Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
- Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
- Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
- Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
- Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
- Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
- Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
- Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
- Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
- Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
- Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
- Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
- Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
- Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
- Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
- Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
- Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
- Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
- Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
- Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
- Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
- Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
- Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
- Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
- Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
- Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
- Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
- Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
- Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
- Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).
