Biz pHluorin, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein kullanarak bozulmamış adacıkları insülin ekzositozu görselleştirme için bir iletişim kuralı tanımlamak. İzole adacıkları adenovirus pHluorin vezikül kargo peptit Y birleştiğinde kodlama ile bulaşmış. Bu confocal mikroskobu tarafından insülin granül füzyon olayları algılama için sağlar.
İnsülin salgılanması glikoz homeostazı normal şartlarda fizyolojik de olduğu gibi hastalığı merkezi bir rol oynar. İnsülin granül ekzositozu Elektrofizyoloji veya floresan gazetecilere ifade için birleştiğinde mikroskobu kullanın eğitim için geçerli yaklaşımlar. Ancak bu tekniklerin çoğu klonal hücre hatları için optimize edilmiş veya pankreas adacıkları dissociating gerektirir. Buna ek olarak, burada sunulan yöntemi insülin granül ekzositozu sağlam pankreas adacıkları içinde gerçek zamanlı görselleştirme olanak sağlar. Bu protokol için ilk viral enfeksiyon peptit Y (NPY) birleştiğinde bir pH duyarlı yeşil flüoresan protein (GFP), pHluorin, kodlar adenovirus ile izole pankreas adacıkları tarif. İkinci olarak, confocal adacıkları beş gün sonra viral enfeksiyon ve insülin granül sekresyonunu izlemek nasıl görüntüleme açıklar. Kısaca, virüslü adacıkları bir coverslip bir görüntüleme odası üzerinde yerleştirilir ve bir dik lazer tarama confocal mikroskop altında sürekli olarak çeşitli uyaranlara içeren hücre dışı çözüm ile periosteum süre görüntüsü. Confocal görüntüleri adacık 50 µm kapsayan bir hızlı rezonans tarayıcı kullanarak hızlandırılmış kayıtları elde edilir. İnsülin granülleri plazma zarı ile füzyon zaman içinde izlenebilir. Bu yordamı Ayrıca tek bir deneyde bir pil uyaranların test etmek için izin verir, fare ve insan adacıkları ile uyumludur ve fonksiyonel görüntüleme (örneğin, membran potansiyeli veya sitozolik kalsiyum boyalar) için çeşitli boyalari ile kombine edilebilir.
İnsülin pankreas adacık beta hücreleri tarafından üretilen ve glukoz metabolizma1anahtar bir düzenleyicisidir. Ölüm ya da beta hücre fonksiyon bozukluğu glikoz homeostazı rahatsız ediyor ve diyabet2‘ ye götürür. İnsülin bir Ca2 +içinde yayımlanan çekirdek yoğun granüller içinde paketlenmiştir-bağımlı bir şekilde3. İnsülin granül ekzositozu nasıl düzenlenir elucidating tam olarak ne insülin salgılanması belirler ve diyabet tedavisi için yeni tedavi hedefleri tanımlaması için yeni yollar açar anlamak önemlidir.
İnsülin ekzositozu kapsamlı floresan molekülleri ile birlikte membran kapasitans ölçümleri ve mikroskobik yaklaşımlar gibi Elektrofizyolojik yaklaşımları kullanarak çalışılmıştır. Membran kapasitans ölçümleri iyi temporal çözünürlüğe sahip ve tek hücre kayıtları sağlar. Ancak, kapasite değişimler hücrenin net yüzey değişikliği yansıtmak ve bireysel füzyon olayları yakalamak veya insülin granül füzyon diğer sigara insülin salgı veziküller3ayırt. İki fotonlu veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, floresan problar ve vezikül kargo proteinler, birlikte gibi mikroskobik yaklaşımlar ek ayrıntı sağlar. Bu teknikler tek exocytotic olayları ve ayrıca öncesi ve sonrası exocytotic aşamaları yakalamak ve nüfus hücreleri3exocytotic desen eğitimi için kullanılabilir.
Floresan gazetecilere üç tür olabilir: 1) hücre dışı, 2) sitoplazmik veya 3) veziküler. 1) hücre dışı gazetecilere ekstraselüler ortamın4ten kutup tarayıcıları (örneğin, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer sarı, pyranine) vardır. Polar verici kullanımı bir nüfus hücre füzyon gözenek incelenmesi için izin verir ve kan damarları gibi çeşitli hücreler arası yapıları yakalar. Ancak, vezikül kargo davranış bildirmez. 2) sitoplazmik gazetecilere floresan problar sitoplazma yüz ve rıhtım ve ekzositozu dahil membran ilişkili proteinler için birleştiğinde vardır. Örnekler nörotransmitter sürüm5çalışmak için nörolojik başarıyla kullanılan çözünür N– ethylmaleimide-duyarlı faktör ek protein reseptörü (tuzak) aile üyeleri. Bu proteinler birden çok bağlayıcı ortak ve insülin-granül değildir belirli. 3) veziküler gazetecilere floresan problar kargo özel vezikül davranış soruşturma için izin veziküler kargo proteinlere erimiş vardır. İnsülin-granül özel kargo proteinler insülin, c-peptid, adacık amiloid polipeptid ve NPY diğerleri arasında içerir6,7. NPY sadece insülin granülleri içeren mevcuttur ve insülin ile ortak yapım o bir floresan muhabir8için mükemmel bir partner yayımlanır.
Füzyon NPY için farklı floresan proteinlerin daha önce ekzositozu nöroendokrin hücrelerinde, belirli synaptotagmin izoformlarının9,10 şartı gibi çeşitli yönlerini incelemek için istihdam edilmiştir ve nasıl zaman-yayın tabii aktin sitoiskeleti üzerindeki ve myosin II11,12bağlıdır. Bu çalışmada, floresan olmayan değiştirilmiş bir GFP olan flüoresan muhabir pHluorin seçtik yoğun çekirdek içinde asidik pH granül ama olur maruz nötr ekstrasellüler pH13üzerine parlak floresan. Olgun insülin granülleri bir asidik pH 5.5 aşağıda var. Bir kez plazma zarı ve açar ile granül sigortalar, taşıdığı 7.4,7,14muhabir olarak pH duyarlı proteinler pHluorin kullanımına izin nötr ekstrasellüler pH için yararlanılır.
PHluorin pH hassas doğası ve insülin granülleri NPY seçici ifade içinde görüş-in NPY-pHluorin füzyon yapı insülin granül ekzositozu çeşitli özelliklerini incelemek için kullanılabilir. Füzyon yapı viral teslim yüksek transfection verimlilik sağlar ve birincil beta hücreleri veya hücre hatları yanı sıra izole adacıkları üzerinde çalışır. Bu yöntem, bir kılavuz olarak ekzositozu hücreye herhangi bir diğer NPY içeren veziküller ile çalışmak için de kullanılabilir. Ayrıca ekzositozu üzerinde belirli koşullar (nakavtlar, overexpression, vb) etkilerini incelemek için herhangi bir transgenik fare modeli ile birleştirilebilir. Bu teknik daha önce insülin granül sekresyonunu beta hücre popülasyonlarının insan adacıkları15içinde kayma ve temporal desenlerini tanımlamak için kullanılmıştır.
Bu el yazması tarafından confocal mikroskobu sağlam pankreas adacıkları içinde beta hücrelerindeki insülin granülleri ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir bir teknik anlatılmaktadır. Bu NPY-pHluorin adenovirus klonlanmış floresan muhabir olarak yüksek transfection verimliliği sağlamak için kullanılır.
Yöntem bizim ellerimizde yüksek verimli olmasına rağmen öncelikle iki parametre bağlı bazı değişiklikler gerektirebilir: 1) adacık hazırlık ve viral …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Marcia Boulina yardım için çekirdek özelliği mikroskoplar sayesinde görüntüleme DRI dan teşekkür ederiz. Bu eser NIH hibe 1K01DK111757-01 tarafından (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 ve R56 DK084321 (AC) destek verdi.
Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
Vacuum filter | VWR | 431098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
Forskolin | Sigma | F3917 |