Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.
Abstract
Maternale obesitas wordt geassocieerd met een verhoogd risico op nadelige perinatale uitkomsten die zijn waarschijnlijk gemedieerd door gecompromitteerde placenta functie die kan worden toegeschreven aan, in deel, de disregulatie van autophagy. Aberrant wijzigingen in de expressie van de regelgevers autophagy in de placentas van zwaarlijvige zwangerschappen kunnen bij inflammatoire processen gekoppeld aan zowel overgewicht en zwangerschap worden geregeld. Hier beschreven is een protocol voor de bemonstering van villous weefsel en isolatie van de villous cytotrophoblasts van de term menselijke placenta voor primaire celculturen. Dit wordt gevolgd door een methode voor het simuleren van de inflammatoire milieu in de zwaarlijvige uteriene omgeving door het behandelen van primaire trophoblasts van mager zwangerschappen met tumor necrose factor Alfa (TNFα), een proinflammatoire-cytokine dat is verheven in zwaarlijvigheid en in zwangerschap. Via de implementatie van het protocol beschreven hier, komt het voor dat de blootstelling aan exogene TNFα regelt de uitdrukking van Rubicon, een negatieve regulator van autophagy, in trophoblasts van mager zwangerschappen met vrouwelijke foetussen. Terwijl een aantal biologische factoren in de zwaarlijvige uteriene omgeving behouden het potentieel om te moduleren kritische trajecten in trophoblasts, is dit systeem ex vivo vooral handig voor het bepalen van als expressie waargenomen in vivo patronen in menselijke placentas met moeders obesitas zijn een direct gevolg van TNFα signalering. Uiteindelijk, deze aanpak biedt de mogelijkheid om te ontleden de regelgevings- en moleculaire implicaties van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over autophagy en andere kritische cellulaire routes in trophoblasts die de potentie hebben om invloed functie van de placenta.
Introduction
Obesitas is een inflammatoire staat gekenmerkt door chronische low-grade ontsteking, die voortkomen uit overtollige vetweefsel en de beschikbaarheid van nutriënten. In overgewicht, zijn proinflammatoire cytokines verheven in metabole weefsels en systemisch in omloop. Een robuust lichaam van bewijsmateriaal blijkt dat TNFα is aanzienlijk verhoogd in de omgeving van obesitas met gevolgen in insulineresistentie en metabole dysfunctie1. Activering van TNFα draagt ook bij aan de pathogenese van de ziekte in aandoeningen zoals kanker en autoimmuniteit, waardoor het een aantrekkelijke therapeutisch doel2.
Ontsteking in obesitas wordt verergerd door zwangerschap, ook een proinflammatoire staat3,4. Eerder is aangetoond dat de placenta TNFα inhoud met moeders vetmobilisering in zwangerschappen met vrouwelijke foetussen toeneemt. Bovendien remt TNFα behandeling mitochondriale ademhaling in vrouwelijke maar niet mannelijke trofoblast cellen, suggereren dat TNFα is betrokken bij de regulering van de placenta metabolisme in een seksueel dimorphic wijze5. Maternale obesitas wordt geassocieerd met de verhoogde incidentie van allerlei complicaties tijdens de zwangerschap, met inbegrip van doodgeboorte, met mannelijke foetussen worden de meest gevoelig3,6,7,8 . Als gevolg van haar belangrijke rol op de moeders-foetale interface, kunnen veranderingen in de functionele capaciteit van de placenta in de zwaarlijvige uteriene omgeving in reactie op inflammatoire signalering een belangrijke rol in het bemiddelen van de resultaten van zwaarlijvige zwangerschappen.
Cytotrophoblasts en syncytiotrophoblasts in het villous weefsel van de placenta zijn kritisch voor endocriene signalering en voedingsstoffen en zuurstof uitwisseling tussen de moeder en de ontwikkeling van de foetus9. Verstoringen in de functionele capaciteit van villous cytotrophoblasts (hierna te noemen trophoblasts) in gevaar kunnen brengen foetale gezondheid en ontwikkeling. Dit protocol beschrijft een methode voor de bemonstering van villous weefsel van de placenta menselijke termijn door het ontleden weg de chorionic en basale platen samen met een geoptimaliseerde procedure voor de isolatie van de trophoblasts voor primaire celculturen. Dit protocol is afgeleid van gevestigde methoden waarbij enzymatische vertering van villous weefsel vrij te geven van de cellen van de extracellulaire matrix gevolgd door differentiële dichtheid centrifugeren te isoleren trophoblasts10, 11,12. De gegevens van dit protocol een aanpak waarin primaire trophoblasts van placentas van mager zwangerschappen worden behandeld met voedingsbodems aangevuld met TNFα te simuleren een onderdeel van de inflammatoire milieu gekoppeld aan moeders obesitas. Eindelijk, een eenvoudige procedure voor de oogst van de cel Totaal lysates van TNFα-behandeld trophoblasts gevolgd door Western blotting om de opsporing van wijzigingen in genexpressie is beschreven.
Dit model doet het obesogenic in utero milieu in zijn geheel niet recapituleren, geeft maar een gecontroleerde systeem dat een toelaat parseren uit de individuele bijdrage van TNFα-gemedieerde ontsteking naar aanleiding van de trophoblasts maternale obesitas. Dit model biedt zowel de mogelijkheid om te ontdekken of bevestigen van moleculaire targets direct geregeld TNFα signalering in trophoblasts evenals maakt het mogelijk om te testen of veranderingen in gen-expressiepatronen in vivo in placentas met moeders waargenomen overgewicht kan een gevolg zijn van TNFα-gemedieerde ontsteking.
De hier beschreven aanpak werd opgestart om te testen van het effect van TNFα-gemedieerde ontsteking op de regulering van autophagy in menselijke trophoblasts. Trophoblasts van zwaarlijvige zwangerschappen met mannelijke foetussen tentoonstelling verstoord autophagic omzet of autophagosome rijping13. Vallen proteïnen aan genaamd Rubicon (RUN domein eiwit Beclin1-interactie en cysteïne-rijke bevatten), die is gelokaliseerd in de lysosomen en laat Endosomen, is onlangs beschreven als een “rem” in het proces autophagic omzet omdat het functioneert als een negatief regulator van14,15van de rijping van de autophagosome. In feite, is Rubicon een zeldzaam voorbeeld van een eiwit dat weerhoudt autophagy, waardoor het een waardevolle therapeutisch doel. Zeer weinig informatie is beschikbaar over de pathofysiologische betekenis van Rubicon, met uitzondering van haar rollen in de ingeboren immune reactie op microbials16,17 en cardiomyocyte bescherming18. Met het protocol beschreven hier, het komt voor dat Rubicon upregulated in vrouwelijke primaire trophoblasts in reactie op behandeling is met toenemende concentraties van TNFα tot 250 pg/mL. De regulering van de Rubicon kan een rol spelen in hoe vrouwelijke foetussen fare beter dan mannetjes in zwangerschappen met moeders obesitas. Recapitulerend ontsteking geassocieerd met moeders obesitas ex vivo door blootstelling van menselijke trophoblasts aan exogene TNFα biedt een platform voor het bestuderen van de effecten van de zwaarlijvige uteriene milieu over de regulering van de kritische trajecten in trophoblasts en bij uitbreiding, placenta functie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De placenta, verantwoordelijk voor de regulering van de groei van de foetus, vertoont gecompromitteerde functie in de zwaarlijvige milieu-6. Ondanks de hoge metabole eisen van trophoblasts vertonen placentas met moeders obesitas disfunctionele mitochondriale ademhaling6,19. Veranderingen in de placenta metabolisme kunnen bijdragen aan de toename van complicaties en negatieve foetale effecten waargenomen in zwaarlijvige zwangerschappen<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken vrouwen die gedoneerd hun placentas voor dit onderzoek. Wij danken ook de arbeid en de afdeling van de levering bij OHSU en de moeders en foetale onderzoeksteam voor de coördinatie van de verzameling van placentas. Wij zijn dankbaar Eric Wang, Ph.D., en Kelly Kuo, MD voor ondersteuning en helpen met experimentele methoden en optimalisatie.
Dit werk werd gefinancierd door de NIH HD076259A (AM) en AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells’ calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -. S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -. S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
