Summary
Целевых генов редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 значительно облегчило понимание биологических функций генов. Здесь мы используем методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 модель calreticulin мутации в cytokine зависимых гемопоэтических клеток с целью изучения их онкогенного действия.
Abstract
Кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-это система адаптивного иммунитета в прокариотах, был многоцелевых учеными для создания РНК руководствуясь nucleases, таких как связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) 9 для конкретных участков генома эукариот редактирования. Геном инженерии, Cas9 используется для эффективно, легко и надежно изменения эндогенного гены во многих линий обеспечить соответствующие mammalian клетки и организмы. Здесь мы покажем пример как использовать методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 чтобы понять биологические функции специфических генетических мутаций. Мы модель calreticulin (CALR) мутации мышиных интерлейкина-3 (mIL-3) зависит от pro-B клеток (Ba/F3) путем доставки одного руководство РНК (sgRNAs) ориентация эндогенный Локус Calr в конкретном регионе, где вставки или удаления (indel ) CALR мутации происходят в больных с миелопролиферативных новообразования (MPN), тип рака крови. SgRNAs создать двойной нити перерывы (DSBs) в регионе целевых, которые ремонтируются к концу номера гомологичных присоединения (NHEJ) дать indels различных размеров. Затем мы используем стандартного анализа Сотовый трансформации Ba/F3 чтобы понять эффект физиологического уровня выражения Calr перегласовок на кроветворную Сотовый трансформации. Этот подход может быть применен к другим генам для изучения их биологические функции в различных линий клеток млекопитающих.
Introduction
Технология ТРИФОСФАТЫ/Cas9 недавно революцию, изменения целевых генома в живых клеток и организмов. Она стала чрезвычайно мощный инструмент для биомедицинских исследований и в настоящее время используются в качестве возможности для лечения генетических заболеваний1. Основой для всех инструментов редактирования генома опирается на создание нуклеиназы индуцированной ДНК двойной мель перерыв (DSB) в геномной локусе изменение. DSBs могут быть отремонтированы, не гомологичных конец присоединение (NHEJ) или ориентированные на гомологии ремонт (HDR)2,3. Преимущество Cas9 Нуклеаза над другими генома, инженерных nucleases, таких как цинк палец nucleases (ZFNs) и транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) является его зависимость от РНК для ориентации нуклеиназы к желаемой последовательности ДНК, по сравнению для взаимодействий протеин дна, в ZFNs и Таленс2,3.
После открытия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Нуклеаза путь как адаптивной иммунной системы в прокариотических клеток4,5много усилий прошла в адаптации путь для использования в mammalian клетки линии и модель организмов2, 3. как инструмент для редактирования гена, путь ТРИФОСФАТЫ/Cas9 использует два основных компонента: Streptococcus pyogenes (Sp), полученных Cas9 Нуклеаза и sgRNAs ориентации гена интереса2,3. SgRNA состоит из 20 нуклеотидов, прямые Cas9 для определенного сайта на геном через РНК-ДНК пары взаимодополняемости2,3. Целевой сайт sgRNA должны лежать рядом прилегающих мотив (PAM) сайт protospacer в виде 5' NGG, который признан SpCas9 нуклеиназы. С помощью этих инструментов Cas9 могут быть направлены в любой последовательности ДНК, разработав sgRNAs этой целевой области интереса. В дополнение к Sp производным Cas9, есть дополнительные варианты для Cas9 с различными функциями в зависимости от конкретного приложения. К примеру есть варианты Cas9 с более высокой специфичности для редактирования на цель или потенциала сингл нить расщепления ДНК, уменьшение поперечного сечения6,7. Кроме того каталитически неактивных Cas9 недавно была разработана для регуляцию8. Теперь ученые использовали ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для различных приложений, таких как ген knockin и нокаут для изучения биологических функций и генов9, функция потерь и усиления функции библиотеки экраны10 Разработка модели организмов11.
В этом протоколе мы сочетаем методологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 с Пробирной Сотовый трансформации Ба/F3 чтобы понять биологические функции CALR перегласовок. BA/F3 клеток являются мышиных Ил-3 зависимых гемопоэтических клеток линии, которая может быть оказана Ил-3 независимых выражение определенных онкогенов как BCR-ABL12. Для того чтобы понять ли мутантов calreticulin может превратить Ba/F3 клеток цитокина независимого роста, мы ориентированы Эксон 9 эндогенного Calr локус, используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представить indel мутации и затем удалились Ил-3 от клетки, чтобы применить положительный выбор давление, с целью изложив получить из функция CALR мутации в MPN пациентов. Протокол включает в себя дизайн, клонирование и доставки sgRNAs, развитие стабильных Cas9 выражая клеток и скрининга для ТРИФОСФАТЫ на цель гена редактирования. Этот протокол может применяться для различных генов и различных цитокинов зависимых клеток линии интерес и является особенно ценным в области моделирования и изучение биологической функции генов, участвующих в рак.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA дизайн с использованием онлайн инструменты13
-
Дизайн sgRNAs ориентации гена интереса, с помощью бесплатных онлайн инструментов.
- Скопируйте и вставьте NCBI ссылка последовательности гена интереса в широкой институт sgRNA дизайнер веб-инструмент: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
Примечание: Этот инструмент идентифицирует sgRNA последовательности с расщепления сайтов в пределах экзонов и те, которые охватывают границы Интрон/экзона но все же прилепится в пределах экзона. - Скачать и открыть выходной текстовый файл в excel.
- Фокус на столбцы заполняются sgRNA последовательностей и контекст sgRNA последовательности. Обратите внимание, что не содержат последовательности sgRNA protospacer рядом мотив (PAM), но в контексте последовательности делать.
- Обратите внимание, что показатель эффективности на цели перечислены Оценка эффективности предсказал расщепление в масштабе от 0 до 1, где показатель 1 обозначает более высокой эффективности расщепления.
- Используйте функцию «вид» excel либо заказать целей, оценка эффективности или расположение внутри ген целевого объекта через колонку «% целевой Cut».
Примечание: Сортировка по расположению в пределах ген полезен для выявления sgRNAs, определенного домена или экзона интерес. - Выберите 3-6 sgRNAs, которые целевые области интересов с высокой (> 0,6) на цели оценки эффективности. Это может быть полезно знать, какие виды мутации могут быть ответственны за фенотипа желаемого (см. рис. 1 , объясняя нацеленности стратегия, используемая для calreticulin).
Примечание: sgRNAs ниже предлагается оценка порога 0.6 эффективность следует рассматривать при недостатке других хороших кандидатов. - Используйте средство web анализ gRNA MIT экран для потенциальных эффектов пробить (http://crispr.mit.edu/). Для каждого sgRNA выбран выполните последовательности целевых объектов (включая PAM).
Примечание: Институт широкой sgRNA дизайнер веб-инструмент может также использоваться экран-целевого воздействия (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Обратите внимание, что средство анализа MIT sgRNA забил каждый sgRNA по шкале от 1-100, где 100 баллов обозначает выше специфика. Оценка более чем 70 идеален и представляет sgRNA с минимальными последствиями пробить. Этот сайт также генерирует список хитов пробить с их расположения в геноме и сколько не соответствует каждый из них с руководством кандидата.
Примечание: Пробить хиты с четырьмя несоответствия или более, считаются безопасной14. Пробить хиты с менее чем четырьмя несоответствия может быть проблематичным, если они попадают в экзонов14.
- Обратите внимание, что средство анализа MIT sgRNA забил каждый sgRNA по шкале от 1-100, где 100 баллов обозначает выше специфика. Оценка более чем 70 идеален и представляет sgRNA с минимальными последствиями пробить. Этот сайт также генерирует список хитов пробить с их расположения в геноме и сколько не соответствует каждый из них с руководством кандидата.
- Выберите 2-3 sgRNAs который целевой различных местах в пределах региона интерес для целевых генов, и которые имеют самые высокие оценки эффективности и пробить парных расщепления (см. таблицу 1 для sgRNA последовательностей, ориентация Эксон 9 Calr).
Примечание: В зависимости от экспериментальных целей, больший акцент могут быть возложены разные значения, полученные от упомянутых инструментов.
- Скопируйте и вставьте NCBI ссылка последовательности гена интереса в широкой институт sgRNA дизайнер веб-инструмент: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
2. клонирование sgRNA Oligos13
-
Генерировать вперед oligo
- Создайте список последовательностей sgRNA без сайта PAM.
- Добавление G к 5' концу последовательности, если к 5' концу последовательности sgRNA не G.
Примечание: Этот G необходим для максимального уровня транскрипции U6-управляемый sgRNA. Добавление G является необходимой для m1 sgRNA (Таблица 1). - Добавить последовательность «CACC» ' конец 5 G-оптимизированный руководство последовательности (не PAM) (Таблица 2) для того, чтобы генерировать свесы, необходимые для перевязки отожженная oligos в BsmBI усваивается lentiGuide вектор (см. шаг 3).
-
Генерировать обратную oligo
- Реверс дополняют G-оптимизированный руководство последовательности (не PAM).
- Добавление последовательности «AAAC» к 5' концу обратный дополняет Руководство G-оптимизированные последовательности (Таблица 2).
- Порядок разработан oligos от компании синтез праймера.
-
Отжиг и фосфорилировать oligos
- 1 мкл вперед oligo (100 мкм), 1 мкл обратного oligo (100 мкм), 1 мкл 10 x T4 лигирование буфера, 0.5 мкл T4 полинуклеотид киназы (ПНК) и 6,5 мкл H2O для ПЦР-пробирку (всего = 10 мкл).
- Запустите следующую программу в Термоциклер: 37 градусов за 30 мин., 95 ° c за 5 мин, Нагрейте от 95 до 25 на 0,1 ° C/сек.
- Разбавить продукт реакции на 1: 250 H2O.
3. пищеварение lentiGuide-Puro вектор13
-
Дайджест lentiGuide-Puro вектор
- Соберите 50 мкл пищеварение реакции со следующими компонентами: 5 мкг круговой плазмида, 2 мкл (30 единиц) энзима ограничения BsmBI, 5 мкл буфера энзима ограничения и до 50 мкл H2O.
- Запуск реакции втечение 2 ч при температуре 55 ° C. После первого часа добавьте 1 мкл больше энзима ограничения BsmBI.
-
Dephosphorylate вырезать позвоночник
- Добавление 7 мкл буфера реакции фосфатазы и 2 мкл фермента фосфатазы переваривается вектор.
- Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
- ПЦР очистить, вырезать и dephosphorylated позвоночника с использованием коммерческих комплект.
Примечание: Заменить предоставленного розовый цветные столбцы с комплектом алкалический синий цветные столбцы так, как они лучше могут разместиться большой плазмида размеров. Доходность может быть увеличен путем нагревать Элюирующий буфер в блоке 90 градусов тепла до элюции и элюирующие ДНК из столбца дважды в конце (запустить eluted дна от первого элюции обратно через во второй раз).
4. Перевязка ofAnnealed Oligos в переваривается позвоночника-13
- Добавьте 50 нг переваривается позвоночника, 1 мкл отожженных oligo разрежения, 1 мкл 10 x T4 лигирование буфера, 1 мкл лигаза T4 и до 10 мкл H2O для ПЦР-пробирку. Инкубировать 1 час при комнатной температуре
- Преобразование Stbl3 клетки с 2 мкл реакции перешнуровки. Пластины на пластину агар бульон (LB) lysogeny с 100 мкг/мл Ампициллин и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
- Выберите 3 колоний и инокуляции в мини-prep культуру.
-
Проверка правильного oligo вставки
- Выполните алкалический для каждой культуры и последовательности через oligo вставки сайте, начиная с грунтовки в промоутер U6, с использованием коммерческих комплект.
- Выполните midi-prep или макси prep проверить последовательность культуры.
5. поколения клетки lLines стабильно выражая SpCas9
Примечание: Этот протокол включает поставку плазмида pLX_TRC311-Cas9, лентивирусные инфекции. Этот Протокол описан в деталях для мышиных интерлейкина-3 (mIL-3) зависимых pro-B (Ba/F3) клеток, клеток линии подвеска и могут быть адаптированы для других типов клеток, используя предпочитаемый культуры условий для каждого типа клеток. Питательной среды для Ба/F3 клеток состоит из RPMI дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина/L-глютамина и 10 нг/мл мышиных Интерлейкин 3.
-
Transfect ГЭС 293T клетки
- Заполнение ячеек6 ГЭС 293T 3 x 10 на 10 см ткани культуры блюдо. Держите посеян клетки на ночь перед transfection.
Примечание: ГЭС 293T клетки линию адэрентных клеток и обычно используются для производства вирус. Клетки поддерживаются в DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина/L-глютамина. Во время transfection клетки должно быть 80% притока. - Предварительно теплой сокращение сыворотке СМИ (Opti-MEM) и среднего роста.
- Добавьте 500 мкл сокращение сыворотке СМИ, 7 мкг конструкцию pLX_TRC311-Cas9, 4 мкг плазмида pCMV-VSV-G лентивирусные упаковки и 4 мкг лентивирусные упаковки плазмида psPAX2 в трубку
Примечание: Общая ДНК за 10 см блюдо 293T клеток — 15 мкг. - Хорошо перемешайте ДНК и 45 мкл Реагента transfection. Осторожно перемешать и дать постоять 20 минут.
Примечание: Важно использовать сокращение сыворотке СМИ, потому что сыворотка будет тормозить комплекс формирования между трансфекции реагента и плазмидной ДНК. - Аспирационная старой среды в 293T пластины и добавьте 5 мл нового среднего роста.
- Добавьте смесь реагент ДНК и трансфекции мудрым образом падение на 293T пластину. Вихревой мягко и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
- Урожай вирусный supernatants на 24 и 48 h пост transfection. Проходят через 0,22 мкм фильтром и Алиготе в cryovial трубу (1.6/мл и 1,5 мл будет использоваться для инфекции).
- Хранить вирусный супернатант-80 ° c.
Примечание: лентивирусные супернатант может использоваться в течение 6 месяцев. Если возможно, spinfection transductions должны быть выполнены с свежий вирус).
- Заполнение ячеек6 ГЭС 293T 3 x 10 на 10 см ткани культуры блюдо. Держите посеян клетки на ночь перед transfection.
-
Лентивирусные инфекции Ba/F3 клеток
- Оттепель вирусный супернатант на льду, если заморожен.
- Центрифуга клетки на 300 x g на 4 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в концентрации 3 х 106 клеток/мл.
- Ресуспензированы клетки, 1,5 мл вирусных супернатанта, 4 мкл Полибрен 500 мкл (фондовой: 2 мг/мл) и 10 нг/мл m-уровня IL3 в пластине 6-ну тканевые культуры. Убедитесь в том включить неинфицированных хорошо с 1,5 мл СМИ вместо вирусных супернатанта как элемент управления.
Примечание: Количество вирусных супернатант добавил должна соответствовать кратности инфекции (МВД) < 1. - Центрифуга пластину на 440 x g для 120 минут при 37 ° C.
- Возьмите пластину из центрифуги и место в 37 ° C и 5% CO2 инкубатора и позволяют выращивать на ночь.
- Спин вниз клетки после 24 часов и Ресуспензируйте с 5 мл свежей теплой СМИ в пластине 6-хорошо.
-
Выбор Cas9 инфицированных клеток
- Спин вниз клетки и Ресуспензируйте с свежий теплый СМИ с 5 мкг/мл blasticidin, 48 h пост spinfection.
- Выделите ячейки, на 9 дней с blasticidin или до тех пор, пока клетки неинфицированных (отрицательный) управления мертвы.
- После завершения выбора передачи устойчивостью клеток к средству с низкой концентрации blasticidin.
6. репортер Assay для Cas9 деятельности15
- Передают родительской клетки и клетки, стабильно выражая Cas9 с pXPR-011 лентивирусные инфекции (см. шаги 5.1-5.2).
Примечание: Этот вектор содержит GFP и руководство ориентации GFP. Ячейки, содержащие активные Cas9 приведет к сокращению GFP (рис. 2). - Выделите ячейки для 3 дней с 2 мкг/мл puromycin, 48 h пост spinfection.
- Анализировать образцы для экспрессия гена GFP в проточной цитометрии.
Примечание: GFP сокращение 50% или более представляет оптимальное Cas9 активность. Более высокую концентрацию blasticidin выбора могут быть использованы для повышения активности Cas9, если меньше, чем наблюдается снижение на 50%. Не все клеточные линии может терпеть blasticidin отбора. В этом случае использование Cas9 векторов с другими выбор кассеты могут быть необходимы. Кроме того не все клеточные линии может терпеть стабильной выражение Cas9. В этом случае может использоваться переходные transfection Cas9.
7. Spinfection sgRNAs в Cas9 выразить клетки
- Выполните шаги 5.1-5.2 лентивирусные инфекции sgRNAs в клетки интереса.
Примечание: На шаге 5.1.3, замените конструкцию pLX_TRC311-Cas9 lentiGuide-Puro конструкции, проверки из раздела 4. - 48 ч пост spinfection, выделите ячейки в течение 3 дней с 2 мкг/мл puromycin.
- Передача устойчивостью клеток к средству с низкой концентрации антибиотиков и продолжить выбор еще 4 дней для редактирования достаточно.
8. Ba/F3 Сотовый трансформации и позитивного выбора с помощью m-уровня IL3 вывода
Примечание: Этот assay описан для зависимых ячеек Ba/F3 mIL-3, но может быть применен к любой линии цитокина зависимые ячейки.
- Уменьшается экспоненциально растущей ба/F3 клеток выразить ectopically Cas9 и sgRNA интерес.
- Аспирационная супернатант и вымыть клетки с 5 мл из фосфата буфер солевой (PBS).
- Спин вниз клетки и повторите шаг мыть в 8.2 четыре раза (этот шаг гарантирует, что средства массовой информации является бесплатным Ил-3).
- Аспирационная PBS и Ресуспензируйте клетки в 5 мл свежего СМИ без Ил-3.
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или анализатор жизнеспособность клеток.
- Семя ячеек в трех экземплярах в пластине 6-ну тканевой культуры в концентрации 1 х 105 клеток/мл в общем объеме 2 мл свежего СМИ без Ил-3.
- Мониторинг и подсчитать количество ячеек каждые 2 дня в общей сложности 8 дней.
Примечание: Ba/F3 клеток не хватает Ил-3 обычно умирают 2 дней поста Ил-3 голода. Важно включить отрицательный контроль в assay (обычно ненацеливания руководство используется как элемент управления).
9. Скрининг для редактирования ТРИФОСФАТЫ на цель
- Дизайн ТРИФОСФАТЫ скрининг грунтовки вверх и вниз по течению от расщепления сайта sgRNA
Примечание: используйте грунты по крайней мере 100 bp с сайта предсказал расщепление чтобы убедиться, что обнаружение не быть затронуты большой вставки или удаления (indel) на целевом сайте sgRNA. - Изолируйте genomic дна (геномная ДНК) от трансформированных клеток (в конце кривой роста) и клетки pre цитокинов вывода.
Примечание: Всегда включайте клеток, экспрессирующих ненацеливания руководство как элемент управления для редактирования ген. Изоляция геномная ДНК от клеток до и после преобразования будут идентифицировать клоны, которые положительно были выбраны для и пролиферативной преимущество. - Соберите 50 мкл ПЦР со следующими компонентами: 25 мкл 2 x PCR микс, 1 мкл вперед грунтовка (10 мкм), 1 мкл обратного праймера (10 мкм), 50-100 нг геномная ДНК, и H2O до 50 мкл.
Примечание: Многочисленные высококачественные полимеразы могут использоваться на шаге 9.3. - Запуск образцов в Термоциклер, используя следующие параметры: 95° C в течение 1 мин, 30 циклов (94 ° C в течение 1 мин, 52 ° C за 30 сек, 72 ° C за 30 s) и 72 ° C в течение 10 мин. Этот ПЦР оптимизирован для грунтовки Calr , перечисленных в таблице 3. Оптимизация условий PCR для пары праймера, разработан в шаге 9.1, основанный на тестирование на геномная ДНК.
- Запуск 5 мкл образцов на 2% агарозном геле на 10 V/см с помощью 1 x буфера Tris ацетат ЭДТА (ТЭ). Изучение образцов на наличие / отсутствие усиливается группы соответствующий размер для гена интереса.
- Используйте оставшуюся часть реакции PCR (45 мкл) для выполнения очистки ПЦР.
- Клон ампликонов с PCR клонирования комплект в вектор плазмиды. К примеру pGEM T-легко векторов обычно используются.
- Превратите плазмида Stbl3 клетки или другие совместимые клетки и пластину на плиты агара LB с соответствующими антибиотиками. Выберите 10-20 колоний, Мини-prep, каждый из них и при условии каждый клон Сэнгер последовательности характеризовать indels, созданный из ТРИФОСФАТЫ/Cas9 редактирования.
Примечание: При желании, активированных флуоресцированием одной ячейке, сортировки (FACS) могут быть выполнены на основную редактировать населения изолировать клон с конкретным indel. Кроме того может использоваться следующее поколение виртуализации (НГС) методы более надежно определить целевые редактирования с помощью глубокую секвенирование ампликонов ПЦР, охватывающих sgRNA целевого региона. Например отслеживание Indels разложения или ПРИЛИВА может использоваться вместо subcloning для точного определения спектра и частота целевых мутаций, созданные в пуле клеток (https://tide.nki.nl/#about)16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью метода, описанного здесь, Цель этого эксперимента является изучение функциональных последствий внедрения indel мутации на эндогенный Локус Calr на преобразование гемопоэтических клеток. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система используется в качестве инструмента для создания эндогенных Calr мутаций в клетках Ba/F3. Два sgRNAs были выбраны целевые Эксон 9 Calr (рис. 1), в регионе, где вставки или удаления (indel) мутации происходят обычно в CALR-мутант MPN пациентов17,18. Первый sgRNA (m1) был выбран, основываясь на ее декольте высокой эффективности и благоприятные пробить ноты (Таблица 1). Второй sgRNA (м2) был выбран главным образом для его местоположения в пределах Эксон 9 и из-за отсутствия дополнительных sgRNAs в регионе для редактирования с декольте высокой эффективностью и благоприятные пробить ноты (Таблица 1). Два отдельных sgRNAs (m1 или m2) были использованы в отдельных инфекций для обеспечения, что наблюдаемые эффекты были вызваны на целевых генов редактирования. Пробить эффекты вряд ли будет совместно использоваться несколькими независимыми sgRNAs. Ненацеливания управления (схватка) также используется в качестве отрицательного контроля. Набор Cas9 эндонуклеазы к Calr экзона 9 предсказал для создания DSBs в данном локусе. DSBs бы то ремонт NHEJ, который может генерировать indels переменных размеров (рис. 1).
Развивать в vitro ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы в Ba/F3 клеток, клеток, стабильно выражения протеина Cas9 были сделаны лентивирусные опосредованной трансдукции согласно протоколу, описанных выше. Стабильные результаты выражения Cas9 в надежные Cas9 деятельности. Cas9 активность в клетках Ba/F3-Cas9 измерялась pXPR-011, репортер конструкцию, которая содержит GFP и ориентации GFP15руководства. Ячейки, содержащие активные Cas9 приведет к сокращению GFP15. ГПУП была измерена в ячейках с помощью проточной цитометрии. BA/F3-Cas9 ячеек сокращение примерно 76% в GFP, соответствующие надежные Cas9 активности (рис. 2).
Тип 1 цитокинов рецепторов, такие как thrombopoietin рецептор (MPL), рецепторов эритропоэтина (EPOR) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор рецептор (G-ЧСФР) были каждый индивидуально, стабильно выражена в Ba/F3-Cas9 клетки, чтобы определить их кооперативность с мутантов calreticulin в привлечении преобразование Ba/F3 клеток. Затем трансдукции sgRNA конструкций (m1, m2 или схватка (ненацеливания руководство)) проводилась в каждом из Ба/F3 клеточных линий, стабильно выражая Cas9 и рецептор интерес. Клетки, затем были отобраны для 7 дней с puromycin предусмотреть достаточно времени для редактирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ген. Положительный выбор был затем давление, лишая клетками цитокинов (mIL-3). Цель этого давления голода является определить если indels в Calr экзона 9, аналогичные тем, которые наблюдаются в MPN больных, выбраны для, что приводит к цитокинов независимые роста и трансформации Ba/F3 клеток. Кривая роста было проведено в общей сложности 8 дней и клетки были подсчитаны каждые 2 дня для измерения их трансформации (рис. 3)19. Клетки гранулы для экстракции геномной ДНК были собраны до начала роста кривой и в конце кривой роста для проверки для редактирования на цель и следить за indels, что расширение пост цитокина голода (рис. 3)19.
Цитокина независимых рост наблюдался в Calr-ориентированных Ba/F3-MPL-Cas9 клеток (рис. 4B), но не Calr-ориентированных родителей Ba/F3-Cas9 клеток (рис. 4A), или Ba/F3-Cas9 клеток, ectopically выражения EPOR (Рисунок 4 c ) или G-ЧССР (рис. 4 d)19. Чтобы подтвердить, что mIL-3 независимого роста в целевых Calr Ba/F3-MPL-Cas9 клеток, в результате редактирования на целевых генов, клетки были собранный 8 дней поста mIL-3 вывода и геномной ДНК было добыто19. 422 bp региона, охватывающих целевой сайт был усиленный с праймерами, перечисленные в таблице 3. Югу клонирования PCR ампликонов была выполнена и 30 отдельных клонов были отправлены для Сэнгер последовательности. Для m1 или m2 Calr-целевых Ba/F3-MPL-Cas9 клеток, все суб клоны содержится indels различных размеров на предполагаемого разреза сайта (рис. 5)19. 11 из 13 m1 суб клоны были найдены содержит indels, которые привели к + 1 bp фреймшифт мутации (рис. 5), аналогичные тем, которые найдены в больных. Для м2 Calr-целевые клетки, 10 из 17 суб клоны были найдены содержат indels, что привело к + 1 bp frameshifts (рис. 5)19. Эти данные подтверждают, что ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной введение + 1bp фреймшифт перегласовок эндогенного Calr Локус Эксон 9 является достаточно, чтобы придать онкогенного действия Calr19. Последовательность данных на рисунке 5 также предполагает, что введение гетерозиготных + 1bp фреймшифт перегласовок на эндогенный Локус Calr достаточно, чтобы превратить клетки Ba/F3-MPL, согласуется с замечанием что CALR мутации обычно гетерозиготных в MPN пациентов17,18. Так как NHEJ ремонт приводит к высокой гетерогенность между indels, одну ячейку Сортировка изолировать клон интерес может быть выполнена. Это позволило бы исследователя для изучения последствий специфических мутаций, созданные ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Рисунок 1: Схема ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования ориентации экзона 9 Calr. Два sgRNAs были разработаны для целевой сайт в регионе Эксон 9 Calr мыши, соответствующий, ориентированные на + 1bp фреймшифт мутации в человека MPN (красная полоса). Последовательности с ПАМС (синий) показываются, и ожидаемые сайты расщепления по Cas9 обозначаются красными треугольниками. DSBs порожденных ТРИФОСФАТЫ/Cas9 то ремонт NHEJ, который, как ожидается, генерировать indels переменной длины19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Cas9 деятельности пробирного. Родительский Ba/F3 клеток и Ba/F3 клеток, экспрессирующих Cas9 были преобразованы с pXPR-011 для измерения активности Cas9. Снижение GFP коррелирует с повышенной активностью Cas9. Родительский Ba/F3 клеток являются ~ 100%, FITC + по сравнению с Ba/F3-Cas9 клеток, где FITC уменьшается ~ 76%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: временная шкала для инфекции и подбор sgRNAs в клетках Ba/F3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Введение + 1 bp фреймшифт перегласовок в эндогенный Локус Calr достаточно, чтобы придать онкогенного действия Calr. Кривые роста (A-D) в родительский Ba/F3-Cas9 клеток (A) Ba/F3-MPL-Cas9 клетки (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 (C), и Ba/F3-G-ЧССР-Cas9 клетки (D) демонстрирует Ил-3 независимого роста в целевых Calr Ba / F3-MPL-Cas9 клетки только19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Проверка последовательности Сэнгер. Подтверждение на цель редактирования эндогенного Calr (Эксон 9) в клетках Ba/F3-MPL. + 1 bp фреймшифт перегласовок указаны в черный19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Целевого гена | sgRNA ID | Последовательности целевых объектов (5' к 3') | Стрэнд | Расщепление эффективность | Целевой показатель | ||
| Calr | M1 | AGAGGACAAGAAGCGTAAAGобщ | + | 0,7 | 70 | ||
| Calr | м2 | GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGобщ | + | 0,3 | 28 | ||
Таблица 1:20-mer protospacer последовательностей, включая PAM сайта (выделены полужирным шрифтом) для двух на Эксон 9 Calr sgRNAs 19.
| Грунтовка ID | Последовательность (5' к 3') |
| M1-F | CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG |
| M1-R | AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC |
| m2-F | CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG |
| m2-R | AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC |
Таблица 2: Protospacer последовательностей и их обратный дополняет с «CACC» и «AAAC» добавлены для клонирования в вектор pLenti Путеводитель, с помощью энзима ограничения BsmBI 19.
| Грунтовка ID | Последовательность (5' к 3') |
| Calr_Fwd | ACCACCTGTCTTTCCGTTCT |
| Calr_Rev | GGCCTCTACAGCTCATCCTT |
Таблица 3: ТРИФОСФАТЫ скрининг праймеры PCR вверх и вниз по течению от расщепления сайта sgRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы продемонстрировать использование ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования для изучения биологической функции CALR перегласовок в гемопоэтических клеток. Успех этого протокола сильно зависит от нескольких факторов. Во-первых важно знать, какие виды мутации могут быть ответственны за фенотип, которая пожелана. В этом протоколе индикация является преобразование Ba/F3 клеток mIL-3 независимости и типы мутаций являются indels в Эксон 9 CALR. Однако если желаемый мутация-это замена одной пары, то HDR-опосредованной ремонта является предпочтительным методом потому, что он может представить точные точечные мутации или вставки из одной пряди или двуцепочечной ДНК доноров шаблон2, 3. Если желательно Нокаут гена, то создание крупномасштабных геномной удалений, ориентация начале кодирования экзонов предпочитали20.
Во-вторых линия клетки должны быть cytokine зависимых для позитивного отбора давления пост цитокина вывода. Важно отметить, что не все линии клетки могут терпеть стабильной выражение Cas9 (см. шаг 6.3). Это может быть вызвано blasticidin выбор, который не допускается на всех клеточных линий. В этом случае выбор других Cas9 конструкций с различными отбора кассеты может быть необходимым. Предостережение с помощью цитокинов зависимой клеточных линий, таких как Ba/F3 клеток является, что они чувствительны к спонтанной цитокина независимого роста, иногда в результате приобретения мутаций в гене ectopically выразил интерес после цитокина Снятие21. Соответственно требуется использование соответствующих механизмов контроля для того, чтобы быть уверенным в том, что наблюдаемые сотовой преобразование связано на цель ТРИФОСФАТЫ гена редактирования. В этом протоколе, мы не наблюдали Сотовый трансформации в Ba/F3-MPL преобразованы с помощью элемента управления sgRNA ненацеливания или в Ba/F3-EPOR и Ba/F3-GCSFR ячейки преобразованы с Calr-ориентированных sgRNAs. Это обеспечивает дальнейшее уверенность, что сотовый трансформации в Ba/F3-MPL клеток является результатом на цель редактирования эндогенный Локус Calr .
В этом протоколе репарации ДНК, NHEJ вводит indels переменных размеров, как показано на рисунке 5. Анализ Сэнгером что последовательность была выполнена на подвыборки массовых населения отредактированных ячеек для того, чтобы искать расширения indels, привести к + 1 bp фреймшифт перегласовок пост цитокина вывода. Следующее поколение, последовательности, упомянутый в шаге 9,9 является более надежным способом определить целевые редактирования для сыпучих клеточных популяций. Если анализ на конкретных клон, то одну ячейку Сортировка массовых населения не требуется. Одну ячейку Сортировка выгодно в понимании биологический эффект результатом определенного типа мутации и является полезным, когда цель заключается в том, чтобы понять разницу между двумя различными типами мутаций.
Одна из проблем с системой ТРИФОСФАТЫ/Cas9 — пробить эффекты, которые являются расщепления события за пределами целевого региона. Чтобы оценить специфику ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы и убедитесь, что преобразованный населения не содержат любые эффекты пробить, ведущих к наблюдаемым трансформации, нам придется рассмотреть ли изменения генома произошел за пределами региона интерес. Это может быть сделано путем поиска доказательств Cas9/NHEJ-driven изменения генома на потенциал геномной локусов пробить с значительным последовательность сходства к намеченной цели. Для этого следующее поколение последовательности может также использоваться для количественной оценки частоты пробить эффектов в указанных местах вдоль генома. Чтобы уменьшить вероятность-целевого воздействия, различные факторы могут быть включены в протокол. Как упомянуто в результаты, изучая несколько sgRNAs ориентации региона интерес гарантирует, что фенотип результат на турнире. Кроме того недавние исследования показали, что усеченный sgRNAs с 17 нуклеотидов может снизить частоту пробить расщепления события22. Кроме того длительное воздействие Cas9 от стабильной выражение может привести к более высокой частоте-целевого воздействия. Важно отметить, что системы двойной вектор, содержащий Cas9 и sgRNA могут использоваться в протоколе вместо стабильного выражение Cas9; Однако эти векторы, как правило, быть очень большими и приводят к низкой лентивирусные титр и снижению эффективности инфекции. В результате могут использоваться временные transfection Cas9 конструкции в клетках, nucleofection. Недавние сообщения также разработали конструкции Cas9 с более высокой точностью для редактирования на цель, такие, как eSpCas9 построить6.
В целом эффективной, недорогой и надежный генома инженерных инструментов, что позволяет для изучения генетических мутаций на уровнях физиологическое выражение представляет ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Здесь мы используем ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования как надежный и эффективный метод для углубления понимания функциональных последствий CALR мутации в гемопоэтических клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH (R01HL131835), премии клинический исследователь Damon Раньон и Старр рака консорциума.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al.
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
