Summary
Her præsenterer vi teknikker til at måle roede blodlegemer deformability og cellulære heterogenitet af ektacytometry. Disse teknikker anvendes til generelle undersøgelser af roede blodlegemer deformability og specifikke undersøgelser af blodsygdomme karakteriseret ved tilstedeværelsen af både stive og deformerbare røde blodlegemer i cirkulation, såsom seglcelleanæmi.
Abstract
Nedsat rød celle deformability er karakteristisk for flere lidelser. I nogle tilfælde kan omfanget af defekte deformability forudsige sværhedsgraden af sygdommen eller forekomsten af alvorlige komplikationer. Ektacytometry bruger laser diffraktion viscometry for at måle deformability af røde blodlegemer enten stigende shear stress eller en osmotisk gradient på en konstant værdi på anvendt shear stress. Direkte deformability målinger er imidlertid vanskeligt at fortolke når måling heterogene blod, der er karakteriseret ved tilstedeværelsen af både stive og deformerbare røde blodlegemer. Dette er på grund af stive celler manglende evne til korrekt tilpasse svar på shear stress og resultater i en forvrænget diffraktionsmønster præget af en overdreven fald i tilsyneladende deformability. Måling af graden af forvrængning giver en indikator af heterogenitet af erytrocytter i blodet. I seglcelleanæmi, er dette korreleret med den procentdel af stive celler, som afspejler den hæmoglobin koncentration og hæmoglobin sammensætning af erytrocytter. Ud over måling deformability, giver osmotisk gradient ektacytometry oplysninger om den osmotiske skrøbelighed og hydrering status af erytrocytter. Disse parametre også afspejle hæmoglobin sammensætningen af røde blodlegemer fra seglcelle patienter. Ektacytometry måler deformability i populationer af røde blodlegemer og ikke, derfor giver oplysninger om deformability eller mekaniske egenskaber af individuelle erytrocytter. Uanset, er målet med de teknikker, der er beskrevet heri at give en bekvem og pålidelig metode til måling af deformability og cellulære heterogenitet af blod. Disse teknikker kan være nyttig til overvågning af tidsmæssige ændringer, samt sygdomsprogression og respons til terapeutisk intervention i flere lidelser. Seglcelle anæmi er en vel karakteriseret eksempel. Andre potentielle forstyrrelser, hvor målinger af roede blodlegemer deformability og/eller heterogenitet er af interesse omfatter opbevaring af blodet, diabetes, Plasmodium infektion, jernmangel, og hæmolytisk Anæmier skyldes membran defekter.
Introduction
Ektacytometry giver en praktisk foranstaltning af roede blodlegemer deformability som svar på ændringer i shear stress (målt i PA (Pa)) eller suspension medium osmolalitet. Relevante parametre af roede blodlegemer deformability omfatter det maksimale brudforlængelse indeks (EI Max), et mål for den maksimale deformability af røde blodlegemer som reaktion på stigende shear stress, og shear stress ½ (SS ½), shear stress kræves for at opnå halvdelen maksimal deformability. 1 osmotisk gradient ektacytometry har flere informative parametre. Disse omfatter brudforlængelse indeks minimum (EI Min), en foranstaltning af overflade-til-volumen forhold og osmolalitet som det sker (O Min), som er en foranstaltning af osmotisk skrøbelighed. EI Max og osmolalitet som det sker (O (EI Max)) indeholder oplysninger om membran fleksibilitet og celle areal. Halv maksimal brudforlængelse i den hypertonisk arm af den osmotiske gradient er repræsenteret ved EI hyper. EI hyper og osmolalitet hvor den forekommer, O hyper, give oplysninger om den intracellulære viskositet af de roede blodlegemer, som bestemmes af hæmoglobin koncentration. 2 , 3 måling deformability i heterogene blod kompliceres af det faktum, at stive celler, såsom sickled røde blodlegemer, ikke korrekt tilpasse med retning af flow som deformerbare celler som reaktion på stigende shear stress. I stedet for at producere en karakteristisk elliptisk diffraktion billede, producerer stive celler en sfærisk mønster, hvilket resulterer i en diamant-formede diffraktionsmønster når overlejret på ellipsen produceret af deformerbare celler. 4 , 5 , 6 den sfæriske mønster har vist sig at svare til uigenkaldeligt sickled celler ved at udføre ektacytometry på isolerede fraktioner af celler efter tæthed centrifugering. 6 brudforlængelse indeks beregningen omfatter foranstaltninger både lange og korte akse af ellipse; en diamantform derfor producerer et tydeligt fald i brudforlængelse ved at øge bredden på den korte akse. 7 det er tidligere påvist, graden af diffraktion mønster forvrængning er korreleret med både procentdelen af segl hæmoglobin (HB) og procentdelen af sickled celler i blodet fra patienter med seglcelle anæmi. 5 graden af diffraktion mønster forvrængning kan opnås ved komplekse matematiske analyser. 8 det kan også opnås ved at justere åbning af kamera blænden på ektacytometer eller den grå niveau af tilpasningssoftware at ændre diffraktion mønster højde. 5 dog oplysninger om, hvordan man justere det grå niveau er ikke veldefineret og kamera blænde er ikke umiddelbart tilgængelig på den nyeste generation af de kommercielt tilgængelige ektacytometer. For at omgå disse problemer, kan lettilgængeligt kamera gevinst bruges til at justere diffraktion mønster højder. 9 ved hjælp af denne metode til at anslå cellulære heterogenitet, kan graden af diffraktion mønster forvrængning være korreleret med procentdelen af føtalt hæmoglobin i blodet hos patienter med seglcelle anæmi. 10 flere osmotisk gradient ektacytometry parametre er ligeledes korreleret med procentdelen af føtal eller seglcelle hæmoglobin i blodet fra patienter med seglcelle anæmi. Diffraktion mønster forvrængning korrelationer sandsynligvis afspejle bidrag af hæmoglobin sammensætning til procentdelen af stive, ikke-deformerbare celler. Af yderligere interesse gennemgår hele osmotisk gradient ektacytometry profil bifasisk ændringer, der svarer til procentdelen af tætte celler i omsætning under seglcelle krise. 11
Ektacytometry er ligeledes nyttig i studiet af flere andre lidelser. Osmotisk gradient ektacytometry er diagnostisk for nedarvede rød celle membran lidelser, såsom arvelige spherocytosis, arvelig elliptocytosis og arvelige pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 nedsat deformability opstår i jernmangel. 15 karakterisering af "opbevaring læsion" blod har ansat ektacytometry og fremtidige studier undersøger både arten af læsionen og tiltag til at forhindre dens dannelse under opbevaring af krænges blod er tilbøjelige til at drage fordel af den teknikker præsenteret her. 16 nedsat red cell deformability er også blevet korreleret med mikrovaskulære sygdom i diabetes. 17 nylige undersøgelser forbinder hyperglykæmi, roede blodlegemer Ascorbat koncentrationer og osmotisk skrøbelighed tyder disse faktorer kan være vigtigt i udviklingen af mikrovaskulære sygdom. 18 Ektacytometry undersøgelser er i øjeblikket undervejs at undersøge denne hypotese (Parows og Levine, upublicerede data). Blod fase malaria infektion er en anden interessant avenue af roede blodlegemer deformability undersøgelser. Cellulære deformability af Plasmodium falciparum inficeret røde blodlegemer falder drastisk i løbet af 48 timer af intracellulære modning af parasitten fra ring scenen til schizont fase. Tyder på, at denne nedsat deformability tilbageføres ved modning af parasitten. Tilbageførslen falder sammen med udgivelsen af inficerede Erytrocytterne i omløb. Nedsat deformability menes at være medieret af Plasmodium proteiner, at fremmer binding af røde blodlegemer. 19 disse undersøgelser repræsenterer et lille udsnit af klinisk vigtige betingelser hvor måling erytrocyt deformability og osmotisk gradient parametre er relevante. Flere yderligere områder af undersøgelsen findes.
Alternative teknikker til måling af roede blodlegemer deformability omfatter optiske pincet (også kendt som laser fælder), som bruger de fysiske egenskaber af fotoner til at strække enkelt røde celler i en eller flere retninger. 20 denne teknik har fordelen at måle deformability af enkelt erytrocytter, men nogle usikkerhed i kraft kalibrering har produceret betydelig variation på tværs af undersøgelser 21 og analyse af data kan være arbejdskrævende medmindre automatiseret. 22 mikropipette aspiration, som bruger undertryk til Aspirér en erytrocyt i en mikropipette, er også blevet brugt til at måle deformability af røde blodlegemer. 7 , 23 flere målinger, såsom den tryk til Aspirér cellen rød er muligt med hver foranstaltning forskellige kendetegn, de røde blodlegemer. 23 atomic force mikroskopi er en høj opløsning teknik, der måler membran stivhed af kvantificere laser stråle afbøjning som indikator af cantilever afbøjning langs overfladen af en rød celle. 24 disse teknikker giver oplysninger om individuelle erytrocytter, er ikke let tilpasses til at måle ændringer i populationer af røde blodlegemer, og generelt kræver betydelige tekniske ekspertise.
Lyst til at prøve både enkelte og populationer af celler samtidigt har ført til fremskridt inden for automation og udviklingen af mikrofluidik og array-baserede metoder. Ligesom ektacytometry, rheoscopy måler deformability som en funktion af shear stress, men billeder er erhvervet direkte via mikroskop. 25 for højere gennem læg analyser, automatiseret celle imaging har været ansat til at producere deformability distributioner ved hjælp af rheoscope. 26 cellulære heterogenitet kan kvantificeres ved denne metode, hvis der foreligger data fra en sund kontrol genstand. 27 mikrofluidik teknikker også giver mulighed for højt gennem læg analyser af enkelt celler; flere designs ved hjælp af tilpasninger af filtrering,28 celle transit analyzers,29 , som måler den tid, der kræves for en erytrocyt flow gennem en micropore og alternativer, der måler det pres der kræves for erytrocyt transit snarere end tiden 30 er blevet udviklet. En anden platform for høj gennem læg analyse af enkelte celler er enkelt celle microchamber array chip, som har den ekstra fordel giver mulighed for downstream fluorescens-baserede karakterisering af celler. 31 selvom hver af disse teknikker er potentielt nyttige og muligvis er overlegen i forhold til særlige anvendelser, de komparative fordele af ektacytometry omfatter følsomhed, brugervenlighed, og præcision. 32 den nyeste generation af kommercielt tilgængelig ektacytometers også besidder stor alsidighed i antallet af assays, der kan udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle emner i denne undersøgelse gav skriftlig informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og de nationale institutter for institutionelle anmeldelse Sundhedsstyrelsen godkendt protokoller.
1. drejning på ektacytometer
- Tilslut slangen fra den rengøringsmiddel til lav og høj osmolar polyvinylpyrrolidon (PVP) løsninger. Vær omhyggelig med at forbinde 0 osmolar røret til den lave osmolar løsning og 500 osmolar røret til den høje osmolar løsning.
Bemærk: Lav osmolar PVP løsning bør have en osmolalitet mellem 35 og 55 milliosmoles pr. kilogram (mOsm/kg), en pH-værdi på 7,25-7,45 ved 25 ° C og en viskositet mellem 27,0 og 33.0 centipoise (cP) på 37.0 ± 0,5 ° C. Høj osmolar PVP løsning bør have en osmolalitet mellem 764 og 804 mOsm/kg, en pH på 7,25-7,45 ved 25 ° C og en viskositet foranstaltning af 27,0-33,0 cP på 37.0 ° 0,5 ° C. - Sikre, at bob er sænket helt ind i kop. Starter softwaren og prime maskinen (Hardware Check | Instrument IO). Tillad instrument til at gennemføre priming cyklus. Når den er færdigafkølet, løfte bob ud af koppen og helt tørre bob og cup med en lav lint rengøring væv.
Bemærk: Resterende vand vil lyse røde blodlegemer, producerer indblanding.
2. måling af deformability som funktion af stigende shear stress
- Få blod (mindre end 1 mL er tilstrækkelige til at udføre disse teknikker med replikater) i hætteglas indeholdende en passende antikoagulant.
Bemærk: EDTA foretrækkes frem for heparin, fordi det har mindre indflydelse på hemorheological parametre. 33 holde blodet ved stuetemperatur, hvis målingerne udføres indenfor 6 timer efter blod tegne. - Forsigtigt blande hele blodprøven før testning af invertere hætteglasset flere gange. Tilføj 25 µL fuldblod til 5 mL af iso-osmolar PVP løsning af pipettering, cap hætteglasset og blandes forsigtigt ved at invertere flere gange. Iso-osmolar PVP løsning bør have en osmolalitet mellem 284 og 304 mOsm/kg, en pH på 7,3-7.4 ved 25 ° C og en viskositet på 27,0-33,0 cP på 37.0 ± 0,5 ° C.
- På software skal du vælge deformability i hovedmenuen. Opret en ny analyse og tilføje eksperimentelle detaljer (Deformability | Tilføje ønskede oplysninger | Okay).
- Løft låget til ektacytometer, kontrollere, at bob er fuldt sænkes ned i kop og koppen er at dreje.
- Tilsættes 1 mL PVP blod ind i rummet mellem cup og bob af pipettering.
- Løft bob lidt for at nedbringe prøver. Vent, indtil alle bobler er flyttet ud af løsningen, så luk låget til ektacytometer. Hvis det er nødvendigt, skal du trykke på knappen aspiration til at fjerne boblerne.
- Justere gevinst til 200 ved at flytte langs rullepanelet på software (se note). Når temperaturen er stabil ved 37 ° C og diffraktion billedet er stabil, tryk på start (Start).
Bemærk: For mange undersøgelser, kan en god diffraktion billede fås fra sunde blod (hæmoglobin koncentration > 12,0 g / dL, betyder corpuscular volumen af 80-96 fL og gennemsnitlig corpuscular hæmoglobin koncentrationen af 33-36 g/dL) med kamera gevinst indstillet til 200. For studier af blod fra seglcelle anæmi, er justere kamera gevinst for at generere en 4,5 cm diffraktion billede blevet foreslået som standardindstilling til at tillade sammenligning af resultater på tværs af undersøgelser og laboratorier. 9 - Observere diffraktion mønstre som data erhvervelse skrider til at sikre, at de forbliver cirkulært, elliptisk eller diamant formet. Når dataopsamling er komplet, gemme eller udskrive rapporten (fil | Gemme eller fil | Print). EI Max og SS ½ værdier vil blive rapporteret automatisk, sammen med brudforlængelse indekser svarer til brugerangivne eller standard shear understreger. Data vil også blive gemt automatisk af softwaren.
- Ved udgangen, skal du trykke på indstillingen ren på dialogboksen på computerskærmen (ren). Efter prøven er indsugning, skyl mellemrummet mellem cup og bob ved sprøjtning deioniseret vand ind i rummet, mens instrumentet forbliver i den rene cyklus. Når den rene cyklus er komplet, løfte bob ud af koppen og helt tørre bob og cup med en lav lint rengøring væv (kritisk: resterende vand vil lyse røde blodlegemer, producerer interferens).
- Klik på knappen hovedmenu på softwaren til at vende tilbage til hovedsiden (Hovedmenu).
3. måling af cellulære heterogenitet
- Forsigtigt blande hele blodprøven før testning af invertere hætteglasset flere gange. Med pipette overfoeres 25 µL fuldblod til en ny 5 mL hætteglas af iso-osmolar PVP løsning, cap hætteglasset og blandes forsigtigt ved at invertere indtil blandingen er homogen.
- Vælge deformability i hovedmenuen. Opret en ny analyse og tilføje eksperimentelle detaljer (Deformability | Tilføje ønskede oplysninger | Okay).
- Løft låget til ektacytometer, kontrollere, at bob er fuldt sænkes ned i kop og koppen er at dreje.
- Afpipetteres 1 mL af opløsningen PVP blod ind i rummet mellem cup og bob.
- Vent, indtil alle bobler er flyttet ud af løsningen, så luk låget til ektacytometer.
- Sikre, at en stabil diffraktion billede er til stede på skærmen. Justere kamera gevinst ved at flytte pil langs rullepanelet på software, indtil det producerer en 3,8 cm diffraktion højde. Bruge en lineal til at kontrollere højden af billedet på computerskærmen.
- Når temperaturen er stabil ved 37 ° C og diffraktion billedet er stabil, tryk på start (Start).
- Observere diffraktion mønstre som data erhvervelse skrider til at sikre, at de forbliver cirkulære, elliptiske eller diamantformede. Når dataopsamling er komplet, gemme eller udskrive rapporten (fil | Gemme eller fil | Print).
- Ved udgangen, skal du trykke på indstillingen ren på dialogboksen på computerskærmen (ren). Efter prøven er indsugning, skyl mellemrummet mellem cup og bob ved sprøjtning deioniseret vand fra en sprøjte flaske ind i det, mens instrumentet forbliver i den rene cyklus. Når den rene cyklus er komplet, løfte bob ud af koppen og helt tørre bob og cup med en lav lint rengøring væv (kritisk: resterende vand vil lyse røde blodlegemer, producerer interferens).
- Gentag trin 2.1-2.5 og justere kamera gevinst for at få en 4,5 cm diffraktion mønster højde (trin 2.2).
- Gentag trin 2.1-2.5 og justere kamera gevinst for at få en 5,4 cm diffraktion mønster højde (trin 2.2).
- I slutningen, skal du klikke på knappen hovedmenuen til at vende tilbage til hovedsiden af software (Hovedmenu).
- For at bestemme graden af diffraktion mønster forvrængning baseret på EI Max som en procentdel, skal du bruge følgende ligning (den samme ligning kan der udføres med data fra 4,5 cm diffraktion mønster højde, hvis det ønskes):
- På samme måde, for at bestemme graden af diffraktion mønster forvrængning baseret på SS1/2 Brug den samme ligning med værdien rapporterede SS1/2:
4. osmotisk gradient ektacytometry
- Få prøve, som beskrevet i punkt 1.1. Bland forsigtigt hele blodprøve før testning af invertere flere gange. Tilføje 250 µL fuldblod til 5 mL iso-osmolar PVP hætteglas af pipettering, cap hætteglasset og blandes forsigtigt ved at invertere indtil blandingen er homogen.
- Vælg osmoscan hovedmenuen (Osmoscan). Placer hætteglas indeholdende blod PVP løsning under nålen på venstre side af maskinen. Sænke nålen, indtil det rører bunden af hætteglasset. Sørg for slangesættet er korrekt tilsluttet til lav- og osmolar løsninger til gradient produktion. Luk låget til ektacytometer og åbne døren på den nederste halvdel, så du kan se blodet ind i slangen.
- Tryk på ny analyse og type i eksperimentel detaljer (Osmoscan | Ny analyse | Angiv ønskede oplysninger | Okay). Justere kamera gevinst til 200 ved at flytte kontrollere det på software og lad maskinen køre, indtil blodet ses ind i cup fra slangen under instrumentet.
- Når blodet har indtastet cup og en stabil diffraktion mønster billede er på computerskærmen, begynde dataopsamling ved at trykke på start nu knap i dialogboksen (Start nu).
- Tillade ektacytometer at erhverve data op til ca. 500 mOsm/kg, så stop instrumentet. Gemme eller udskrive rapport (fil | Gemme eller fil | Print). Data gemmes også automatisk.
- Fjerne den gamle PVP-blod hætteglas. Erstatte det med en ren hætteglas indeholdende deioniseret vand. Læg det under nålen, bringe nålen, så det rører bunden af hætteglasset, og tryk på knappen skylles i dialogboksen for at skylle den gradient system (skyl).
- Når skylles er færdig, skal du trykke på indstillingen ren på dialogboksen på computerskærmen (ren). Når den rene cyklus er komplet, løfte bob ud af koppen og helt tørre bob og cup med en lav lint rengøring væv (kritisk: resterende vand vil lyse røde blodlegemer, producerer interferens).
Bemærk: Osmoscan rapport indeholder brudforlængelse indekser på tværs af den osmotiske gradient. EI Min O (EI Min), EI Max, O (EI Max), EI hyper og O hyper genereres automatisk og medtaget i rapporten. Rækken af osmotisk gradient ektacytometry parametre fra blod fra 9 raske frivillige er: EI Min 0,12-0.196 arbitrære enheder (a.u.); O Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 a.u.; O (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI hyper 0.278-0.286; O Hyper 454-505 mOsm/kg.
5. slå ektacytometer
- Ren instrumentet korrekt, før den lukkes.
- For at gøre dette, Tilslut slangen fra lav- og osmolar løsninger til y-adapter fører til rengøring løsning. Placere et hætteglas indeholdende rengøring løsning under nålen på venstre side af maskinen og sænke nålen, indtil det rører bunden af hætteglasset. Sikre, at bob er sænket helt ind i kop.
- Tæt software, og tryk på start på slutningen af dag ren dialogboksen på computerskærmen (tæt | Start). Tillad instrument til at bladre gennem rengøring helt.
- Afbryde slanger til affald flasken og fjerne det fra instrument til at skille sig af med affald. Tørre bob helt. Sluk maskinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ektacytometry resultater er beskrevet i dette håndskrift kan bruges til at måle red cell deformability i enhver tilstand. En skematisk for det generelt, der er oprettet af en ektacytometer er vist i figur 1. Homogene befolkninger af erytrocytter vil producere en elliptisk diffraktionsmønster som reaktion på stigende shear stress, der kan bruges til at beregne brudforlængelse index som vist i figur 2. Der forekommer diffraktion mønster forvrængning i heterogene blodprøver, fordi stive røde blodlegemer ikke justeres korrekt med deformerbare celler og producerer en sfærisk mønster at overlays ellipsen resulterer i en diamant formet diffraktionsmønster. Denne forvrængede mønster er i stigende grad kan påvises som kamera gevinst er justeret til at generere større diffraktion mønster størrelser som vist i figur 3. Homogen blod populationer, som findes i raske frivillige, ikke producerer forskellige deformability kurver ved forskellige diffraktion størrelser er målt (figur 4A). Derimod viser heterogene blod befolkningsgrupper, såsom blod fra patienter med seglcelle anæmi, betydelige fald i deformability foranstaltninger som en funktion af diffraktion mønster størrelse (figur 4). I segl blod, når graden af diffraktion mønster forvrængning måles som funktion af EI Max, er det korreleret med HbS (figur 5A) og voksne hæmoglobin variant, HbA2 (figur 5 c). Transfusion korrigerer forvrængning, som det fremgår af dens inverse forhold til procentdelen af normale voksne hæmoglobin (HbA) i blodet (fig. 5 d). Om graden af diffraktion mønster forvrængning måles som funktion af shear stress ½ (figur 5B) eller som en funktion af EI Max (figur 5E), er det korreleret med føtalt hæmoglobin. Men forholdet er stærkere i førstnævnte end sidstnævnte. Vigtigste osmotiske gradient ektacytometry parametre, som O (EI Max), EI Min og O Min giver yderligere oplysninger om cellulær hydrering, overflade-til-volumen forhold og osmotisk skrøbelighed, henholdsvis. Osmotisk gradient kurver fremstillet af segl blod er karakteristisk venstre-skiftet med markant fald i deformability, der bliver stadig mere udtalt i regionen hypertonisk som vist i figur 6.
Figur 1 . Skematisk af ektacytometer set-up. En ydre cup roterer omkring en stationær bob til genererer shear stress på blod genopslemmes i en PVP løsning af definerede viskositet, der er placeret mellem dem. Et diffraktionsmønster genereres ved hjælp af en laser, der passerer gennem løsningen og diffraktionsmønster vises på en projektionsskærm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Generel oversigt over forholdet mellem diffraktion mønster og brudforlængelse indeks. Diffraktionsmønster fremstillet af sunde blod i svar til shear stress viser den forventede elliptisk mønster. Brudforlængelse indeks (EI) er beregnet ved hjælp af ligningen angivet 7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Cellulære heterogenitet producerer diffraktion mønster forvridninger. Diffraktion mønstre fremstillet af blod fra en seglcelle anæmi patienten når kameraet gevinst er justeret til at producere A) en 3,8 cm diffraktionsmønster, B) en 4,5 cm diffraktionsmønster og C) en 5,4 cm diffraktionsmønster. Deformability kurver viser en gradvis nedgang i tilsyneladende deformability og en tilsvarende stigning i tilsyneladende shear stress ½, angivet af linjer fra den samme blod når kameraet gevinst er justeret til at producere D) 3,8 cm diffraktion mønster, E) diffraktionsmønster 4,5 cm og F) 5,4 cm diffraktionsmønster. [Genoptrykt med tilladelse fra Parows mfl. 10]. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Diffraktion mønster forvridninger producere et tydeligt fald i deformability på tværs af en vifte af selvdestruerende understreges i blod fra patienter med seglcelle anæmi. Sammenligning af deformability kurver genereret fra A) blod fra raske frivillige og B) blod fra patienter med seglcelle anæmi ved at justere kameraet gevinst til at generere en 3,8 cm, 4,5 cm og 5,4 cm diffraktion mønster størrelse. Deformability kurver genereret med blod fra patienter med seglcelle anæmi, men ikke fra raske frivillige, Vis progressive og væsentlige fald i tilsyneladende deformability svar på så lidt som 5 Pa shear stress som en funktion af diffraktion mønster størrelse. [Genoptrykt med tilladelse fra Renoux mfl. 9]. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Grad af diffraktion mønster forvrængning er korreleret med hæmoglobin sammensætning i blod fra patienter med seglcelle anæmi. Lineær regression analyser viser forholdet mellem A) den EI Max-baserede forvrængning i deformability og procentdelen af HbS, B) SS 1/2-baseret forvrængning i deformability og procentdelen af føtalt hæmoglobin (HbF), C) den EI Max-baserede forvrængning i deformability og procentdelen af HbA2, D) den EI Max-baserede forvrængning i deformability og procentdelen af HbA og E) med henblik på direkte sammenligning, de EI Max-baserede forvrængning i deformability og procentdelen af HbF i blod fra patienter med seglcelle anæmi. Pearson korrelationskoefficient, rog tilsvarende p-værdi er angivet. [Genoptrykt med tilladelse fra Parows et al.10]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Blod fra en patient med seglcelle anæmi viser en karakteristisk venstre Skift samtidig med nedsat deformability sammenlignet med blod fra en sund frivillige når analyseret af osmotisk gradient ektacytometry. Blod fra en sund volontøren (-) viser en repræsentativ osmotisk gradient ektacytometry kurve med placeringen af vigtige parametre angivet. Osmotisk gradient værdier fra den sunde frivillige er 0.143 a.u. for EI Min, 146.3 mOsm/kg for O Min, 0.576 a.u. til EI Max og 473 mOsm/kg for O hyper. En repræsentativ osmotisk gradient ektacytometry kurve genereret med blod fra en patient med seglcelle anæmi er overlejret (-). Osmotisk gradient værdier fra seglcelle blod er 0.237 a.u. for EI Min, 110.3 mOsm/kg for O Min, 0.429 a.u. for EI Max og 406 mOsm/kg for O hyper. [Tilpasset med tilladelse fra Parows mfl. 10]. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ektacytometry teknikker beskrevet er ligetil og godt automatiseret, sikre gyldig og reproducerbare resultater. Ikke desto mindre findes nogle kritiske trin. Rette temperaturkontrol af blodet er vigtigt. Opbevaring ved stuetemperatur i mere end otte timer kan påvirke SS ½ værdier. 34 sikring, temperatur af maskinen er stabil ved 37 ° C er også vigtigt, som viskositet af suspending medium er temperatur afhængige. Blod bør være fuldt iltet for at undgå nedsat deformability som følge af ikke-iltet eller delvist iltet prøver, medmindre disse er eksperimenterende parametre af interesse. 35 fra instrumentation ordentlig rengøring af instrumentet er afgørende for at sikre, at der er ingen PVP tilbage i slangen eller Indgangspunktet i bob, som det vil hærde ved tørring og blok flydende flow gennem instrumentet. Opmærksom på disse detaljer vil fremme præcise resultater og holde instrumentet i god stand, kører.
Kvantificering af cellulære heterogenitet kan kræve modifikation. I diffraktionsmønster 3,8 cm kan nogle prøver viser en bratte fald i brudforlængelse indeks på de højeste shear belastninger. Dette kan lejlighedsvis overvindes ved at gentage måling med en frisk prøve. Ellers, graden af diffraktion mønster forvrængning kan måles ved hjælp af indeksværdien brudforlængelse fra en lavere shear stress eller 4,5 cm diffraktionsmønster kan bruges. 9 det kan også være vanskeligt at opnå en 3,8 cm diffraktionsmønster fra sunde blod fordi længdeaksen på ellipsen er alt for længe selv ved de laveste kamera forstærkning. Igen, 4,5 cm diffraktion mønster data kan anvendes til at omgå dette problem. Den værdi, der er valgt skal, naturligvis, holdes konstant på tværs af eksperimentet, som sammenligninger er kun muligt fra data beregnet ved hjælp af de samme data punkt og diffraktion mønster størrelse. Som de cellulære heterogenitet foranstaltninger er afhængige af instrument oprettet, intern validering kan fås ved at måle diffraktion mønster forvridninger på isolerede celle fraktioner, eller præcist defineret blandinger af brøker, følgende tæthed centrifugering som beskrevet ovenfor. 6
Det er vigtigt at bemærke, at mange ektacytometry parametre er følsomme overfor patienten karakteristika. Eksempler i seglcelle anæmi alpha globin status,36 MCV 37 og transfusion. 10 derfor, kliniske undersøgelser skal udformes omhyggeligt, og disse relationer skal regnskabsføres ved fortolkningen af ektacytometry data.
En anden vigtig advarsel er, at der ikke er en direkte generelle forhold mellem reduceret ektacytometry foranstaltninger og reduktion af røde blodlegemer overlevelse. Asymptomatisk betingelser med alvorligt nedsat deformability, såsom sydøstasiatiske ovalocytosis, eksisterer. 38 men deformability målinger af enhver teknik er komplekse og afhængige af celle areal til volumen ratio (kugleform), cytoplasmatisk viskositet (cellulære hæmoglobin koncentration) og membran stivhed. Red cell reologi er ligeledes indviklet, og der er ikke en teknik, der kan reproducere kompleksiteten af fysiologisk blodgennemstrømningen i forskellige vaskulære senge. Ektacytometry giver ikke desto mindre vigtigt indsigt i ændrede roede blodlegemer deformability og reologi.
Den primære begrænsning af ektacytometry er den manglende evne til at måle deformability i enkelte celler. Således i seglcelle anæmi er der ingen måde at bestemme bidrag af føtalt hæmoglobin, som har en heterocellular fordeling på deformability af en bestemt erytrocyt. 10 ligeledes i en pulje af Plasmodium inficeret blod fra en patient der er ingen måde at bestemme indflydelsen af parasitten modenhed inden for en bestemt rød blod celle. 19 fremtidsforskning sammenligne ektacytometery resultater med dem, der opnås ved hjælp af metoder hensigtsmæssigt til individuelle celler ville være værdifuldt. Uanset denne begrænsning giver ektacytometry en bekvem og følsomme foranstaltning af de rheologiske egenskaber af erytrocytter og heterogenitet af blod populationer. Disse data er vigtige i studiet af flere sygdomme og er ofte af klinisk relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af murene forskningsprogrammet i de nationale institutter for Diabetes, mave og nyresygdomme og National Heart, Lung og Blood Institute of National Institutes of Health. Holdningerne heri er alene ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
