Summary
Her presenterer vi teknikker for å måle røde celle deformability og mobilnettet heterogenitet av ektacytometry. Disse teknikkene gjelder for generelle undersøkelser av røde celle deformability og spesifikke undersøkelser av blodsykdommer preget av tilstedeværelsen av både stive og deformerbare røde celler i omløp, slik som sigd celle anemi.
Abstract
Redusert røde celle deformability er karakteristisk for flere lidelser. I noen tilfeller kan omfanget av defekte deformability forutsi alvorlighetsgraden av sykdommen eller forekomsten av alvorlige komplikasjoner. Ektacytometry bruker laser Diffraksjon viscometry for å måle deformability av røde blodlegemer økende skjæring stress eller en osmotisk gradient i en konstant verdi på brukt skjæring stress. Men er direkte deformability mål vanskelige å tolke måle heterogene blod som er preget av tilstedeværelsen av både stive og deformerbare røde celler. Dette skyldes manglende evne til stive celler til riktig justere svar skjæring stress og resultater i et forvrengt Diffraksjon mønster preget av en overdrevet nedgang i tilsynelatende deformability. Måling av graden av forvrengning gir en indikator på heterogenitet av erytrocytter i blodet. I sigdcelleanemi, er dette korrelert med andelen stive celler, som gjenspeiler hemoglobin konsentrasjon og hemoglobin sammensetningen av Målestørrelsen på erytrocytter. I tillegg til å måle deformability, gir osmotisk gradient ektacytometry informasjon om osmotisk skjørhet og hydration status erytrocytter. Disse parameterne også gjenspeile sammensetningen hemoglobin i røde blod celler fra sigd celle pasienter. Ektacytometry måler deformability bestander av røde celler og ikke, derfor gir informasjon på deformability eller mekaniske egenskaper av personlige erytrocytter. Uansett, er målet teknikkene som beskrives her en praktisk og pålitelig metode for å måle deformability og mobilnettet heterogenitet av blod. Disse teknikkene kan være nyttig for overvåking tidsmessige endringer, samt sykdomsprogresjon og respons på terapeutisk intervensjon i flere lidelser. Sigd celle anemi er et godt karakterisert eksempel. Andre potensielle lidelser der målinger av røde celle deformability og/eller heterogenitet er av interesse inkluderer blod oppbevaring, diabetes, Plasmodium infeksjon, jernmangel og Hemolytisk-anemias på grunn av membran feil.
Introduction
Ektacytometry gir en praktisk mål på røde celle deformability svar på endringer i skjæring stress (målt i Pascal (Pa)) eller suspendere middels osmolality. Relevante parametere av røde celle deformability inkluderer maksimal forlengelse indeksen (EI Max), et mål for den maksimale deformability for en rød-celle som svar på økende skjæring stress, og skjæring stress ½ (SS ½), skjæring stress kreves for å oppnå halv maksimal deformability. 1 osmotisk gradient ektacytometry har flere informativ parametere. Disse inkluderer forlengelse indeksen minimum (EI Min), et mål på overflaten til volumkontrollen og osmolality der det oppstår (O Min), som er et mål på osmotisk skjørhet. EI Max og osmolality der det oppstår (O (EI Max)) gir informasjon om membran fleksibilitet og celle areal. Halv maksimal forlengelse i hypertonic armen på osmotisk graderingen representeres av EI hyper. EI hyper og osmolality som det skjer, O hyper, gir informasjon om intracellulær viskositeten av red cellen som bestemmes av hemoglobin konsentrasjon. 2 , 3 måle deformability i heterogene blod er komplisert av det faktum at stive celler, for eksempel sickled røde blod celler, ikke riktig høyrejusteres med retningen av flyt som deformerbare celler som svar på økende skjæring stress. I stedet for å produsere et karakteristisk elliptiske Diffraksjon bilde, produsere stive cellene en sfærisk mønster som resulterer i et rombeformet Diffraksjon mønster når kledde på ellipsen produsert av deformerbare celler. 4 , 5 , 6 sfærisk mønsteret har vist tilsvare irreversibelt sickled celler ved å utføre ektacytometry på isolerte deler av cellene etter tetthet sentrifugering. 6 indeksberegning forlengelse inneholder tiltak av både lange og korte aksen av ellipsen; en rombefiguren gir derfor en åpenbar nedgang i forlengelse ved å øke bredden på kort aksen. 7 det har tidligere vist at graden av Diffraksjon mønster forvrengning er korrelert med både andelen sigd hemoglobin (HbS) og andelen av sickled celler i blodet fra pasienter med sigd celle anemi. 5 graden av Diffraksjon mønster forvrengning kan fås ved komplekse matematiske analyser. 8 det kan også fås ved å justere åpningen av kameraet blenderåpningen på ektacytometer eller den grå nivået av passende programvare å endre Diffraksjon mønster høyden. 5 men detaljer om hvordan du justerer den grå nivået er ikke godt definert og kameraet blenderåpning er ikke tilgjengelig på den nyeste generasjonen av det kommersielt tilgjengelige ektacytometer. For å omgå disse problemene, kan lett tilgjengelig kameraet gevinst brukes til å justere Diffraksjon mønster høyder. 9 benytter denne metoden for å anslå mobilnettet heterogenitet, kan graden av Diffraksjon mønster forvrengning være korrelert med prosentandelen av fetal hemoglobin i blodet av pasienter med sigd celle anemi. 10 flere osmotisk gradient ektacytometry parametere er likeledes korrelert med andelen fosterets eller sickle hemoglobin i blodet fra pasienter med sigd celle anemi. Diffraksjon mønster forvrengning sammenhenger sannsynligvis gjenspeiler bidrag av hemoglobin sammensetning stive, ikke-deformerbare celler prosenten. Ytterligere rundt gjennomgår hele osmotisk gradient ektacytometry profilen bifasisk endringer som tilsvarer andelen tette celler i sirkulasjon under sigd celle krisen. 11
Ektacytometry er også nyttig i studiet av flere andre lidelser. Osmotisk gradient ektacytometry er diagnostiske for arvet røde celle membran lidelser, som arvelig spherocytosis, arvelige elliptocytosis og arvelige pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 reduseres deformability oppstår i jernmangel. 15 karakteristikk av "lagring lesjonen" blod har ansatt ektacytometry og fremtidige studier undersøker både natur lesjonen og risikoreduksjon dannelsen under lagring av banked blod er sannsynlig å dra nytte av den teknikker som presenteres her. 16 reduseres røde celle deformability har også vært korrelert med mikrovaskulær sykdom i diabetes. 17 nyere studier knytte hyperglykemi, røde celle ascorbate konsentrasjoner og osmotisk skjørhet tyder disse faktorer kan være viktige i utviklingen av mikrovaskulær sykdom. 18 Ektacytometry studier er nå underveis for å undersøke denne hypotesen (Parrow og Levine, upubliserte data). Blod scenen malarial infeksjon er en annen interessant avenue røde celle deformability undersøkelser. Mobilnettet deformability av Plasmodium falciparum infisert røde blodlegemer reduseres dramatisk i løpet av 48 timer av intracellulær modning av parasitten ring scenen schizont scenen. Bevis indikerer at denne redusert deformability tilbakeføres ved modning av parasitten. Reversering sammenfaller med utgivelsen av infiserte røde celler i sirkulasjonen. Redusert deformability antas å være formidlet av Plasmodium proteiner som fremmer lagring av red cellen. 19 disse studiene representerer et lite utvalg av klinisk viktige forhold der måling røde blodlegemer deformability og osmotisk gradient parametere er relevante. Det finnes flere flere områder av studien.
Alternative teknikker for måling av røde celle deformability inkluderer optiske pinsett (også kjent som laser feller) som bruker fysiske egenskaper av fotoner for å strekke enkelt røde celler i én eller flere retninger. 20 denne teknikken har fordelen av å måle deformability av enkelt erytrocytter, men noen usikkerhet i kraft kalibrering har produsert betydelig variasjon over studier 21 og dataanalyse kan være arbeidskrevende med mindre automatisert. 22 brønnene aspirasjon, som bruker negative trykket inneholder en røde blodlegemer i brønnene, har også blitt brukt til å måle deformability av røde celler. 7 , 23 flere målinger, som presset kreves for å Sug opp den røde cellen, er mulig med hvert mål definere ulike egenskaper for red cellen. 23 atomic force mikroskopi er en høy oppløsning teknikk som måler membran stivhet av kvantifisere laser strålen nedbøyning som indikator av cantilever nedbøyning langs overflaten av en rød-celle. 24 disse teknikkene gir informasjon om individuelle erytrocytter, ikke er tilpasset enkelt for å måle endringer bestander av røde blodceller, og generelt krever omfattende tekniske ekspertise.
Lyst til å prøve både individuelle og grupper av celler samtidig har ført til fremskritt innen automatisering og utvikling av microfluidics og matrise-baserte metoder. Som ektacytometry, rheoscopy måler deformability som en funksjon av skjæring stress, men bildene er ervervet direkte via mikroskop. 25 for høyere lakkeringsverksteder analyser, automatisert celle bildebehandling har vært ansatt å produsere deformability distribusjoner bruke rheoscope. 26 cellular heterogenitet kan kvantifiseres ved denne metoden hvis data fra en sunn kontroll faget. 27 Microfluidics teknikker også gi rom for høy lakkeringsverksteder analyser av enkeltceller; flere design med tilpasninger av filtrering,28 celle transitt analyserer,29 som måler tiden som kreves for en røde blodlegemer flyt gjennom en micropore og alternativer som måler trykket nødvendig for røde blodlegemer transitt heller enn tiden 30 er utviklet. En annen plattform for høy lakkeringsverksteder analyse av individuelle celler er enkelt celle microchamber matrise chip, som har fordelen av muliggjør nedstrøms fluorescens-baserte karakteristikk av cellene. 31 selv om hver av disse teknikkene er potensielt nyttig og kan være overlegen for bestemte programmer, den komparative fortrinn i ektacytometry inneholder følsomhet, brukervennlighet, og presisjon. 32 siste generasjon av kommersielt tilgjengelige ektacytometers har betydelig allsidighet av analyser som kan utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle fag i denne studien ga skriftlig samtykke i henhold til erklæringen i Helsinki og nasjonale institutter for helse institusjonelle Review Board godkjent protokollene.
1. slå på ektacytometer
- Koble slangen fra rengjøringsmiddel til lav og høy osmolar polyvinylpyrrolidone (PVP) løsninger. Pass på å koble 0 osmolar røret til lav osmolar løsning og 500 osmolar røret til høy osmolar løsning.
Merk: Lav osmolar PVP løsningen bør ha en osmolality mellom 35 og 55 milliosmoles per kilo (mOsm/kg), pH i 7.25-7.45 ved 25 ° C og viskositet mellom 27,0 og 33.0 centipoises (cP) på 37.0 ± 0,5 ° C. Høy osmolar PVP løsningen bør ha en osmolality mellom 764 og 804 mOsm/kg, en pH på 7.25-7.45 ved 25 ° C og litt viskositet 27,0-33.0 cP ved 37.0 ° 0,5 ° C. - Kontroller at bob senkes helt inn i koppen. Starter programvaren og prime maskinen (maskinvare når | Instrument IO). For at maskinen skal fullføre grunning syklusen. Når syklusen er fullført, løft bob beger og tørke helt bob og cup med en lav lo rengjøring vev.
Merk: Gjenværende vann vil lyse røde celler, produsere forstyrrelser.
2. måle deformability som en funksjon av økende skjæring stress
- Få blod (mindre enn 1 mL er tilstrekkelig til å utføre disse teknikker med replikerer) i hetteglass med en passende antikoagulerende.
Merk: EDTA er foretrukket over heparin fordi den har mindre innflytelse over hemorheological parametere. 33 holde blod ved romtemperatur hvis mål utføres innen seks timer fra blod tegne. - Bland forsiktig hele blodprøve før testing ved å snu ampullen flere ganger. Legge til 25 µL av fullblod 5 mL av iso-osmolar PVP løsning av pipettering, cap ampullen og bland forsiktig ved å snu flere ganger. Iso-osmolar PVP løsningen bør ha en osmolality mellom 284 og 304 mOsm/kg, en pH på 7,3-7.4 ved 25 ° C og en viskositet på 27,0-33.0 cP på 37.0 ± 0,5 ° C.
- Velg deformability fra hovedmenyen på programvaren. Opprett en ny analyse og legge eksperimentelle detaljer (Deformability | Legg til ønskede detaljer | OK).
- Løft lokket til ektacytometer, kontroller at bob senkes fullt i kopp og koppen dreier.
- Legge til 1 mL av PVP blod løsning i mellomrommet mellom koppen og bob av pipettering.
- Løft bob litt for å få prøver ned. Vent til alle bobler har flyttet ut av løsningen, og deretter lukker du lokket på ektacytometer. Hvis nødvendig, trykk aspirasjon å fjerne bobler.
- Justere forsterkningen til 200 ved pilen langs rullefeltet på programvaren (se merknad). Når temperaturen er stabilt på 37 ° C og Diffraksjon bildet er stabil, trykk start (Start).
Merk: For mange studier, kan en god Diffraksjon bilde fås fra frisk blod (hemoglobin konsentrasjon > 12,0 g / dL, gjennomsnittlig corpuscular volumet av 80-96 fL og mener corpuscular hemoglobin konsentrasjoner av 33-36 g/dL) med kameraet gevinst satt til 200. For studier av blod fra sigdcelleanemi, har justere kameraet gevinst for å generere en 4,5 cm Diffraksjon bilde blitt foreslått som standardinnstillingen slik at sammenligning av resultatene på tvers av studier og laboratorier. 9 - Observere Diffraksjon mønstre som data oppkjøpet utvikler sikre at de forblir sirkulære, elliptiske eller diamant formet. Når datainnsamling er fullført, lagre eller skrive ut rapporten (filen | Lagre eller fil | Utskrift). EI Max og SS ½ verdier skal rapporteres automatisk sammen med forlengelse indekser tilsvarer brukerdefinert eller standard skråstille påkjenninger. Dataene lagres også automatisk av programvaren.
- På slutten, trykker du alternativet ren på dialogboks på skjermen (ren). Når prøven er pustende, skyll avstanden mellom koppen og bob av squirting deionisert vann inn i rommet mens maskinen er i rene syklus. Når rene syklus er fullført, løft bob beger og tørke helt bob og cup med en lav lo rengjøring vev (kritisk: gjenværende vann vil lyse røde celler, produsere forstyrrelser).
- Klikk på knappen Hovedmeny på programvare å gå tilbake til hovedsiden (Hovedmenyen).
3. måle mobilnettet heterogenitet
- Bland forsiktig hele blodprøve før testing ved å snu ampullen flere ganger. Pipetter 25 µL av hele blod til en ny 5 mL medisinglass av iso-osmolar PVP løsning, cap ampullen og bland forsiktig ved å snu til blandingen er homogen.
- Velg deformability fra hovedmenyen. Opprett en ny analyse og legge eksperimentelle detaljer (Deformability | Legg til ønskede detaljer | OK).
- Løft lokket til ektacytometer, kontroller at bob senkes fullt i kopp og koppen dreier.
- Pipetter 1 mL av PVP blod løsningen i mellomrommet mellom koppen og bob.
- Vent til alle bobler har flyttet ut av løsningen, og deretter lukker du lokket på ektacytometer.
- Kontroller at det finnes en stabil Diffraksjon bildet på skjermen. Justere kameraet gevinst ved å flytte pilen langs rullefeltet på programvaren til den produserer en 3,8 cm Diffraksjon høyde. Bruk en linjal høyden på bildet på skjermen.
- Når temperaturen er stabilt på 37 ° C og Diffraksjon bildet er stabil, trykk start (Start).
- Observer Diffraksjon mønstre som data oppkjøpet utvikler sikre at de forblir sirkulær, elliptiske eller diamant-formet. Når datainnsamling er fullført, lagre eller skrive ut rapporten (filen | Lagre eller | Utskrift).
- På slutten, trykker du alternativet ren på dialogboks på skjermen (ren). Når prøven er pustende, skyll avstanden mellom koppen og bob av squirting deionisert vann fra en sprøyting flasken inn i det mens maskinen er i rene syklus. Når rene syklus er fullført, løft bob beger og tørke helt bob og cup med en lav lo rengjøring vev (kritisk: gjenværende vann vil lyse røde celler, produsere forstyrrelser).
- Gjenta trinn 2.1-2.5 og justere kameraet gevinst for å få en 4,5 cm Diffraksjon mønster høyde (trinn 2.2).
- Gjenta trinn 2.1-2.5 og justere kameraet gevinst for å få en 5.4 cm Diffraksjon mønster høyde (trinn 2.2).
- På slutten, klikker du på hovedmenyen for å gå tilbake til hovedsiden for programvaren (hovedmenyen).
- For å avgjøre graden av Diffraksjon mønster forvrengningen basert på EI Max prosentvis, bruk denne formelen (samme ligningen kan utføres med dataene fra 4,5 cm Diffraksjon mønster høyden hvis ønskelig):
- Tilsvarende for å fastslå graden av Diffraksjon basert mønster forvrengning på SS1/2 Bruk samme ligningen med rapporterte SS1/2 verdien:
4. osmotisk gradient ektacytometry
- Få eksempler som beskrevet i 1.1. Bland forsiktig hele blodprøve før testing ved å snu flere ganger. Legge til 250 µL av fullblod 5 mL iso-osmolar PVP medisinglass av pipettering, cap ampullen og bland forsiktig ved å snu til blandingen er homogen.
- Velg osmoscan fra hovedmenyen (Osmoscan). Plasser hetteglass med blod PVP løsning under nålen på venstre side av maskinen. Senk nålen til det berører bunnen av ampullen. Kontroller at slangen er riktig koblet til de lave og høye osmolar løsningene for gradient produksjon. Lukker du lokket på ektacytometer og åpne døren til den nedre delen slik at du kan se blod inn slangen.
- Trykk ny analyse og type i eksperimentell detaljer (Osmoscan | Ny analyse | Angi ønsket informasjon | OK). Justere kameraet gevinsten til 200 ved å flytte pilen kontrollere den på programvare og lar maskinen kjøre til blod er sett inn koppen fra slangen under instrumentet.
- Når blodet har angitt koppen og en stabil Diffraksjon mønster bildet på skjermen, begynne datainnsamling ved å trykke start nå-knappen på dialogboksen (Start nå).
- Tillate ektacytometer å skaffe data inntil ca 500 mOsm/kg og deretter stoppe instrumentet. Lagre eller skrive ut rapporten (filen | Lagre eller fil | Utskrift). Dataene lagres også automatisk.
- Fjern gamle PVP-blod ampullen. Erstatte den med en ren ampullen inneholder deionisert vann. Plasser den under nålen, få nålen ned slik at den berører bunnen av ampullen og trykk skyll i dialogboksen skylle gradient systemet (skylling).
- Når skylling er fullført, trykk rene alternativet i dialogboksen på dataskjermen (ren). Når rene syklus er fullført, løft bob beger og tørke helt bob og cup med en lav lo rengjøring vev (kritisk: gjenværende vann vil lyse røde celler, produsere forstyrrelser).
Merk: Osmoscan rapporten inneholder forlengelse indekser over osmotisk forløpningen. EI Min, O (EI Min), EI Max, O (EI Max), EI hyper og O hyper genereres automatisk og tas med i rapporten. Osmotisk gradient ektacytometry parametere fra blod fra 9 friske frivillige er: EI Min 0,12-0.196 vilkårlig enheter (a.u.); O Min 117 144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 a.u.; O (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI hyper 0.278-0.286; O Hyper 454-505 mOsm/kg.
5. slå på ektacytometer
- Rengjør apparatet riktig før den lukkes.
- Dette gjør koble slangen fra lav og høy osmolar løsninger til y-adapteren fører til rengjøringsmiddel. Plasser ampuller som inneholder rengjøringsmiddel under nålen på venstre side av maskinen og lavere nålen til det berører bunnen av ampullen. Kontroller at bob senkes helt inn i koppen.
- Lukk programvaren og trykk start på slutten av dagen ren dialogboksen på dataskjermen (nær | Starte). For at maskinen skal gå gjennom rengjøring helt.
- Koble slangen til avfall flasken og fjerne den fra apparatet forkaste avfall. Tørke bob. Slå av terminalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ektacytometry resultatene som beskrives i dette manuskriptet kan brukes til å måle røde celle deformability i en tilstand. En skjematisk av generelle satt opp av en ektacytometer er vist i figur 1. Homogen bestander av erytrocytter vil produsere en elliptisk Diffraksjon mønster som svar på økende skjæring stress som kan brukes til å beregne forlengelse indeksen som vist i figur 2. Diffraksjon mønster forvrengningen forekommer i heterogene blodprøver fordi stive røde cellene ikke justert riktig med deformerbare celler og produserer en sfærisk mønster at overlegg ellipsen som resulterer i en diamant formet Diffraksjon mønster. Dette forvridde mønsteret er stadig mer synlig som kameraet gevinsten er justert for å generere større Diffraksjon mønster størrelser som vist i Figur 3. Homogen blod befolkninger, som finnes i friske frivillige, ikke produserer ulike deformability kurver ulike Diffraksjon størrelser er målt (figur 4A). Derimot viser heterogene blod bestander, som blod fra pasienter med sigd celle anemi, signifikant nedgang i deformability tiltak som en funksjon av Diffraksjon mønsterstørrelsen (Figur 4). I sigd blod, når graden av Diffraksjon mønster forvrengning måles som en funksjon av EI Max, er det forbundet med HbS (figur 5A) og voksne hemoglobin varianten, HbA2 (figur 5C). Transfusjon korrigerer forvrengningen, som angitt av det inverse forholdet med prosentandelen av normal voksen hemoglobin (HbA) i blodet (figur 5 d). Om graden av Diffraksjon mønster forvrengning måles som en funksjon av skjæring stress ½ (figur 5B) eller som en funksjon av EI Max (figur 5E), er det forbundet med fetal hemoglobin. Men er forholdet sterkere i tidligere enn den siste. Nøkkel osmotisk gradient ektacytometry parametere, for eksempel O (EI Max), EI Min og O Min inneholder tilleggsinformasjon om mobilnettet hydrering, overflate-til-volum forholdstall og osmotisk skjørhet, henholdsvis. Osmotisk gradient kurver fra sigd blod er karakteristisk venstre-forskjøvet med markert nedgang i deformability som blir stadig mer uttalt i regionen hypertonic som vist i figur 6.
Figur 1 . Skjematisk av ektacytometer oppsett. En ytre cup roterer rundt en stillestående bob å genererer skjæring stress på blod resuspended i en PVP løsning av definerte viskositet som er plassert mellom dem. Et Diffraksjon mønster er generert av en laser som passerer gjennom løsningen og Diffraksjon mønsteret vises på en projeksjonsskjermen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Generell oversikt over forholdet mellom Diffraksjon mønster og forlengelse indeks. Diffraksjon mønster fra frisk blod Svar å ta stress viser forventet elliptiske mønsteret. Forlengelse indeks (EI) beregnes ved hjelp av formelen angitt 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Mobilnettet heterogenitet produserer Diffraksjon mønster skjevheter. Diffraksjon mønstre innhentet fra blod fra en sigdcelleanemi pasient når kameraet gevinsten er justert til å produsere A) en 3,8 cm Diffraksjon mønster, B) en 4,5 cm Diffraksjon mønster og C) en 5.4 cm Diffraksjon mønster. Deformability kurver viser en progressiv nedgang i tilsynelatende deformability og en tilsvarende økning i tilsynelatende skjæring stress ½, angitt av linjene fra samme blodet når kameraet gevinsten er justert til å produsere D) 3,8 cm Diffraksjon mønster, E) 4,5 cm Diffraksjon mønsteret og F) 5.4 cm Diffraksjon mønsteret. [Gjengitt med tillatelse fra Parrow et al. 10]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Diffraksjon mønster skjevheter produsere en tilsynelatende nedgang i deformability gjennom en rekke skjær spenninger i blod fra pasienter med sigd celle anemi. Sammenligning av deformability kurver generert fra A) blod fra friske frivillige og B) blod fra pasienter med sigd celle anemi ved å justere kameraet gevinsten til å generere en 3,8 cm, 4,5 cm og 5.4 cm Diffraksjon mønster størrelse. Deformability kurver generert med blod fra pasienter med sigd celle anemi, men ikke fra friske frivillige, viser progressive og betydelig nedgang i tilsynelatende deformability svar på så lite som 5 Pa skjæring stress som en funksjon av Diffraksjon mønsterstørrelsen. [Gjengitt med tillatelse fra Renoux et al. 9]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Graden av Diffraksjon mønster forvrengning er korrelert med hemoglobin komposisjon i blod fra pasienter med sigd celle anemi. Lineær regresjon analyser viser forholdet mellom A) EI Max-baserte forvrengningen i deformability og andelen HbS, B) SS 1/2-basert forvrengningen i deformability og prosentandelen av fetal hemoglobin (absloutt), C) av EI Max-baserte forvrengning i deformability og andelen av HbA2, D) EI Max-baserte forvrengningen i deformability og andelen av HbA og E) i forbindelse med direkte sammenligning, EI Max-baserte forvrengningen i deformability og andelen absloutt i blod fra pasienter med sigd celle anemi. Pearson-produktmomentkorrelasjonskoeffisienten, rog tilsvarende p-verdi er angitt. [Gjengitt med tillatelse fra Parrow et al.10]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Blod fra en pasient med sigd celle anemi viser en karakteristisk venstre SKIFT samtidig med redusert deformability sammenlignet med blod fra en sunn frivillig når analysert av osmotisk gradient ektacytometry. Blod fra en sunn frivillig (-) viser en representant osmotisk gradient ektacytometry kurve med plasseringen av viktige parametere angitt. Osmotisk gradient verdier fra friske frivillige er 0.143 a.u. i EI Min, 146.3 mOsm/kg for O Min, 0.576 a.u. for EI Max og 473 mOsm/kg for hyper. En representant osmotisk gradient ektacytometry kurve generert med blod fra en pasient med sigd celle anemi er kledde (-). Osmotisk gradient verdier fra sigd celle blod er 0.237 a.u. i EI Min, 110.3 mOsm/kg for O Min, 0.429 a.u. for EI Max og 406 mOsm/kg for hyper. [Tilpasset med tillatelse fra Parrow et al. 10]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ektacytometry teknikkene er enkle og godt automatisert, sikre lovlig og reproduserbar resultater. Likevel, noen viktige trinn finnes. Riktig temperaturkontroll blod er viktig. Lagring ved romtemperatur i mer enn åtte timer kan påvirke SS ½ verdier. 34 sikre at temperaturen på maskinen er stabilt på 37 ° C er også viktig, som viskositet av suspending medium er temperaturen avhengige. Blod skal være fullt oksygenert for å unngå redusert deformability som følge av ikke-oksygenert eller delvis oksygenrikt prøvene, med mindre dette er eksperimentell parametere av interesse. 35 fra synspunkt av instrumentering, skikkelig rengjøring av maskinen er avgjørende for å sikre at det er ingen PVP igjen i slangen eller inngangspunkt av bob som den vil stivne ved tørking og blokkere strømning gjennom instrumentet. Oppmerksomhet til disse detaljene vil fremme nøyaktige resultater og holde maskinen kjører orden.
Kvantifisering av mobilnettet heterogenitet krever modifisering. I 3,8 cm Diffraksjon mønster, kan noen eksempler viser en stupbratt fall i forlengelse indeksen på høyeste skjær påkjenninger. Dette kan noen ganger løses ved å gjenta målingen med et friskt utvalg. Ellers graden av Diffraksjon mønster forvrengning kan måles med en forlengelse indeksverdien fra en lavere skjæring stress eller 4,5 cm Diffraksjon mønsteret kan brukes. 9 det kan også være vanskelig å få et 3,8 cm Diffraksjon mønster fra frisk blod fordi lange aksen av ellipsen er for lenge selv på laveste kameraet gevinst. Igjen, 4,5 cm Diffraksjon mønster data kan brukes til å omgå problemet. Verdien som velges bør selvfølgelig holdes konstant over eksperimentet som sammenligninger er bare mulig fra data beregnet ved bruk av samme data punkt og Diffraksjon mønster størrelse. Som mobilnettet heterogenitet tiltak er avhengig av instrumentet satt opp, interne validering kan fås ved å måle Diffraksjon mønster skjevheter på isolerte celle brøker eller presist definert blandinger av fraksjoner, følgende tetthet sentrifugering som beskrevet tidligere. 6
Det er viktig å merke seg at mange ektacytometry parametere er følsomme for pasienten egenskaper. Alfa globin status,36 MCV 37 og transfusjon er eksempler i sigdcelleanemi. 10 derfor kliniske studier må være utformet og disse relasjonene skal regnskapsføres tolkingen ektacytometry data.
En annen viktig påminnelse er at det ikke er en direkte generell sammenheng mellom reduserte ektacytometry tiltak og reduksjon i røde celle overlevelse. Asymptomatisk forhold med sterkt redusert deformability, for eksempel sørøstasiatiske ovalocytosis, finnes. 38 men deformability målinger av noen teknikk er komplekse og avhengig av cellen arealet volumkontrollen (sphericity), cytoplasmatiske viskositet (mobilnettet hemoglobin konsentrasjon) og membran stivhet. Red cell Reologi er likeledes komplekse, og det er ikke en teknikk tilgjengelig som kan reprodusere kompleksiteten av fysiologiske blodstrøm i ulike vaskulær senger. Ektacytometry gir viktig innsikt i endret røde celle deformability og Reologi.
Den største begrensningen av ektacytometry er manglende evne til å måle deformability i enkeltceller. Dermed i sigdcelleanemi er det ingen måte å finne ut bidrag av fetal hemoglobin, som har en heterocellular distribusjon, på deformability av en bestemt røde blodlegemer. 10 likeledes i en pool av Plasmodium infisert blod fra en pasient det er ingen måte å bestemme påvirkning av parasitten modenhet i en bestemt røde blodlegemer. 19 future studies sammenligne ektacytometery resultatene med de får metoder passende for enkeltceller ville være verdifulle. Uavhengig av denne begrensningen gir ektacytometry en praktisk og følsom reologiske egenskapene til erytrocytter og heterogenitet blod befolkninger. Disse dataene er viktig i studiet av flere lidelser og ofte kliniske relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Intramural forskningsprogrammet i den nasjonale institutter Diabetes, fordøyelseskanal og nyre sykdommer og nasjonale hjertet, lungene og blod Institutt for National Institutes of Health. Synspunktene her er eneansvaret for forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
