Summary
미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.
Abstract
그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (2O●-), 과산화 수소 (H2O2)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O2●/H2O2를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H2O2 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H2O2 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H2O2 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.
Introduction
영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH2)1을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH2 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O2) 복잡 한 41에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O2 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP2를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에 여러 지점에서 전자 중간 형태로 선생님3O2 작용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아에서 생성 된 가장 생물학적으로 관련 선생님은 O2●- H2O2. O2●- 종종 간주 됩니다 미토 콘 드리 아에 의해 형성 된 근 선생님, 비록 그것은 생산의 관련 된 자유 O2●- 및 H2O2의 혼합물 형성 분명 지금 보 플 라빈의 급진적인 화학 그룹4,5. 높은 수준에서 선생님 위험할 수 있습니다, 손상 산화 조6의 결과로 세포 기능에 필요한 생물 학적 성분. 그러나, 낮은 금액에서 미토 콘 드리 아 선생님 중요 한 신호 전달 기능을 성취 한다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아에서 H2O2 릴리스 T-세포 활성화, 스트레스 신호 (예를들면, Nrf2 신호 통로의 유도), 세포 증식 및 분화, 유도 제어에 연루 되어 있다 인슐린 신호 릴리스, 그리고 동작7먹이. 상당한 진행 선생님의 신호 전달 기능을 이해 했다. 그러나, 중요 한 질문은 여전히 남아 있다 관계는 미토 콘 드리 아 효소 역할을 가장 중요 한 소스 및 생산 제어 하는 방법은.
선생님 자료 생산의 사이트에 의해 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다: 1)는 전자 기증의 농도 사이트, 2) 전자 기부 사이트, 3)에 대 한 액세스 산소, 4) 고 농도의 산화 상태 그리고 산화 기판3, 의 종류 8 , 9. 미토 콘 드리 아에서 다른 같은 NADH 및 막 잠재적인 힘의 농도 또한 선생님 생산8,10영향 요인. 예를 들어 O2●-/ H2O2 생산 순화 PDHC 또는 KGDHC의 속도 증가 증가 NADH 가용성5,11. 이 시나리오에서 전자는 흐르는 거꾸로 NADH에서 PDHC 또는 KGDHC, O2●-/ H2O2 생산12에 대 한 사이트의 E3 소 단위에 유행 센터. 마찬가지로, 나드+ 의 KGDHC12에서 선생님 방출 감소 반대의 효과 있다. 따라서, 제어 항목 또는 선생님의 사이트에서 전자의 출구는 얼마나 많은 O2●-/ H2O2 를 형성 변경할 수 있습니다. 예를 들어, PDHC 또는 KGDHC CPI-613, 리 포 산, 결과 거의 90%에 감소 O2●-/ H2O2 생산13아날로그와 E2 소 단위를 차단 합니다. 와 화학 S glutathionylation 촉매, diamide disulfiram, O2●-/H2O2 에 의해 생산 PDHC 또는 KGDHC E에 glutathione의 활용을 통해 거의 폐지는 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 2 소 단위14. PDHC 및 KGDHC의 E2 소 단위를 통해 전자의 흐름 차단에 대 한 트레이드 오프는 (예를 들어, 복잡 한 III) 전자 수송 사슬에 의해 선생님 형성 감소는 NADH 생산 감소 이다. 이 또한 전자 수송 사슬에 의해 ATP 출력을 줄일 수 있습니다. 전반적으로, 선생님 생산의 사이트에 전자 항목을 차단 하는 것은 O2●-/ H2O2 생산을 제어 하는 매우 효과적인 수단 수 있습니다.
미토 콘 드리 아에는 최대 12 잠재적인 O2●-/ H2O2 소스6포함할 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분은 포함 하는 플 라빈 효소 O2●- 및 H2O2의 혼합물을 생성 하는. 다른 기판 및 억제제 조합을의 사용의 호흡기 단지 및 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 역할 고용량 O2●-/ H2O2 에 사이트를 형성 하는 식별에 대 한 허용 다른 조직3. PDHC 및 KGDHC 높은 용량 O2●-/ H2O2 근육과 간 미토 콘 드리 아13,15발광 사이트 역할을 보여왔다. 그러나, 몇 가지 문제가 남아 O2●-/ H2O2 다른 기판 및 억제제 조합에 있는 미토 콘 드리 아에 영향 개별 사이트의 잠재적인 형성의 시험에 관한 효소의 활동입니다. 이것은 원치 않는 쪽 반응 (예를 들어, O2●-/ H2O2 의 효소 이외의 사이트의 형성)의 존재로 인해 오염 생 영양분 (예를 들어,지방산 산) 또는 세포 (예:, peroxisomes 또한 O2●/H2O2를 형성), 그리고 선택도, 부족 억제제의 사용 및/또는 완전히 선생님 생산을 억제 하지 않는 화합물의 사용. 특정 억제제 또한 미토 콘 드리 아 생체 및 전자 흐름의 방향을 변경할 수 있습니다 그리고이 선생님 자료 생산의 다른 사이트에서 변경 하 고 결과 혼동 한다. 절대 릴리스에 대 한 O2●/H2O2 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 요금은 또한 O2●- 및 H2O2 의 높은 농도 때문에 계량 하기 어려운 행렬 및 intermembrane 공간에서 효소를 제거합니다. 따라서, O2●-/ H2O2 릴리스 측정을 방해할 수 있는 모든 경쟁 반응의 제거 때 유용할 수 있습니다 식별 하는 고용량 O2●-/H2O2 사이트를 형성.
여기, 우리는 정화 플 라빈 종속 dehydrogenases에 의해 O2●-/ H2O2 생산과 NADH 형성의 동시 시험을 허용 하는 간단한 방법 제시. 정제 효소를 사용 하 여 원치 않는 선생님 측 반응 형성 및 효소 저하 선생님 제거할 수 있습니다 네이티브 O2●-/ H2O2 생산 속도의 개별 flavoenzymes에 대 한 보다 정확한 측정을 위한 수 있도록. 이 메서드는 O2●-/ H2O2 O2●-/H2O 화면 잠재적인 사이트별 억제제 또는 다른 정화 dehydrogenases의 능력을 형성을 직접 비교를 사용할 수 있습니다. 2 출시입니다. 마지막으로, O2●/H2O2 와 NADH 생산을 동시에 측정의 효소 활동, 선생님 자료 용량 관계의 실시간 평가 대 한 수 있습니다.
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Protocol
1. 화학 물질 고 정화 효소
- 다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H2O2 (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드+, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.
2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획
- 96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다.
참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가. - 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하는 반응 버퍼를 준비 합니다.
참고:이 다른 정제 효소의 물리적 특성에 따라 변경할 수 있습니다. - 효소 활동 분석 실험14,,1617 를 사용 하 여 오염 또는 immunoblot에 의해 순화 KGDHC 또는 PDHC를 검사 또는 Coomassie 얼룩5.
- 표 1에서 작업 솔루션 농도 의하여 반응 버퍼에 모든 시 약을 준비 합니다.
- 모든 시 약 1 mL-20 ° c.에 aliquots로 저장 자동 산화 및 반복된 동결-해 동 자발적인 저하를 방지 하기 위해 100 µ L aliquots에서 pyruvate 및 α ketoglutarate-80 ° C에서 저장 합니다.
- DMSO의 1 mL에 마스터 재고 AUR 시 약을 준비 하 고 반응 버퍼에서 100 µ M을 희석. 스토어 빛 으로부터 보호입니다.
참고: 여기, 100 µ M 작업 솔루션은 2 ~ 3 주마다 신선한 고 빛 으로부터 보호.
3. 분석 결과 서식 파일 설정
- 듀얼 측정 기능으로 단색 microplate 리더에 분석 결과 절차를 설정 합니다.
- "프로토콜"을 선택 하 여 읽기 프로시저를 정의 합니다. 그런 다음 "프로시저"를 클릭 합니다.
- 25 ° c (그림 1A) "온도"를 설정 합니다.
- (그림 1A) 읽기 조건을 설정할 "운동 시작"을 클릭 합니다. 시간 및 읽기 간격/실험의 수를 설정 합니다.
- 클릭 "읽기" (그림 1B).
참고: 샘플 최고의 위치에서 읽는 50의 이득. 시간: 5 분, 간격 30-s 읽기. 채널 1: Resorufin 형광-여기/방출 = 565 nm:600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 채널 2: NADH autofluorescence-여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm. - "읽기", 웰 스 모니터 (예를 들어, a 1-a 4와 B1 B4)을 선택 합니다.
- "키네틱 끝"을 선택 합니다.
4. 표준 곡선
- 시 약을 해 동 하 고 필요할 때까지 얼음에 저장 합니다.
-
NADH 표준 곡선 (그림 2A)
- 반응 버퍼에 0.5-10 m m의 농도 범위에서 NADH에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다.
- 180 µ L 반응 버퍼를 포함 하는 웰 스 솔루션 집중 작업 각 NADH에서 20 µ L aliquots를 추가 합니다. 각 NADH의 최종 농도 잘는 0.05-1 m m.
- "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
참고:이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.
-
AUR 표준 곡선 (그림 2B)
- 반응 버퍼; 과산화 수소의 작업 주식 준비 사진 농도 범위 200-4000 nM에서.
- 각 잘에 반응 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.
- HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 U/mL, 우물에 최종 농도 = 3 U/mL =) 20, 잔디의 µ L (재고 농도 일 250 U/mL, 우물에 최종 농도 = 25 U/mL =), 그리고 AUR의 20 µ L (재고 농도 작업 = 100 µ M 잘에서 최종 농도 = 10 µ M) 각 잘 포함 반응 버퍼를.
- 잘 포함 하는 버퍼 및 분석 실험 시 약 각을 재고 솔루션 작업 각 H2O2 의 20 µ L를 추가 합니다. 최종 반응 볼륨 200 µ L 이며 각 우물에서 H2O2 의 최종 농도 20-400 nM 이다.
- 25 ° c.에서 플레이트 리더에서 1 분에 대 한 번호판을 품 어
- "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 = 565 nm/600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.
5. O2 ●/H2 O2 릴리스 및 KGDHC 및 PDHC에 의해 NADH 생산 측정
- 다른 시 약의 추가의 순서에 대 한 표 1 를 참조 하 여 각 볼륨과 각 작업 솔루션의 농도 추가 잘.
- 각 잘에 반응 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 분석 실험 KMV 또는 CPI-613를 사용 하 여, 각 음을 버퍼의 20 µ L를 추가 합니다.
- PDHC 또는 KGDHC의 20 µ L를 추가 (1 U/mL, 잘 당 최종 농도의 작업 사진 = 0.1 U/mL)을 각 영역.
- 2 분 동안 25 ° C에서 PDHC 및 KGDHC를 품 어.
- KMV의 20 µ L을 추가 (작업 사진 = 100 mM, 최종 농도 = 10 m m) 또는 CPI-613의 20 µ L (재고 농도 작업 = 1.5 m m, 최종 농도 = 150 µ M) (표 2).
참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다. - 25 ° c.에 1 분 동안 품 어
참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다. - HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 단위/mL, 우물에 최종 농도 = = 3 단위/mL) 및 잔디의 20 µ L (재고 농도 일 250 단위/mL, 우물에 최종 농도 = 25 단위/mL =) 각 잘 하.
- 코엔자임 A의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 = 1mm, 최종 농도 = 0.1 m m), 20 TPP의 µ L (재고 농도 작업 = 3 mM, 최종 농도 = 0.3 m m), 고 나드+ 의 20 µ L (재고 농도 작업 = 10 m m, 최종 농도 = 1 m m) 각 w 내 말이 맞지.
- 보호 은박지 덮 음에서 AUR 시 약을 제거 하 고 추가 20 µ L 각 잘.
- Pyruvate의 20 µ L 추가 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m) PDHC 및 α ketoglutarate 웰 스 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m)를 KGDHC를 포함 하는 우물.
- 클릭 "읽기" 운동 측정을 시작 합니다.
6. 데이터 분석
- 키보드에서 'CTRL' 버튼 누른 1 (그림 3A) 채널에 해당 하는 모든 운동 측정을 포함 한 그래프를 생성 하는 우물을 클릭 합니다.
- 상대 형광 단위 (RFU) (그림 3B) 다른 시간 지점에서 측정에 대 한 원시 값에 대해 오른쪽 상단에 있는 보기 아이콘에 "데이터"를 클릭 합니다.
- 분석 (표 3)에 대 한 값을 내보냅니다.
- "그래프" 드롭 다운 메뉴 오른쪽 상단에 (그림 3B) 형광 채널 2와 관련 된 RFU 값에 액세스 하려면 클릭 합니다.
- 채널 2 단계 6.1 6.3 반복 합니다.
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Representative Results
그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H2O2 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H2O2 5 분 동안 각 측정 간격에서 형성의 절대 금액을 확인할 수 있습니다. 이 계산의 예는 표 3에서 제공 됩니다. 에 의해 형성 된 NADH와 H2O2 의 양을 일단 KGDHC 또는 다른 간격 PDHC 결정, 값이 복사 되 고 추가 분석을 위해 그래프/통계 소프트웨어에 입력. 사용 하 여 XY 그래프 유형 분석, NADH (µmol) 및 H2O2 (pmol) KGDHC 또는 PDHC에 의해 형성 된 양의 시간 (그림 4A)의 기능으로 그릴 수 있습니다. 이러한 값을 사용 하 여 기판 산화 동안 NADH와 H2O2 형성의 속도 또한 계산할 수 있습니다. 그림 4B에서 같이, KGDHC 및 PDHC NADH와 H2O2 기능 형성 측면에서 다른 특성을 표시 합니다.
일단 그것은 설립 되었습니다는 KGDHC와 PDHC는 효소 활성 및 NADH와 H2O2 형성을 동시에 추적할 수 있습니다, 선생님 속성 놓고 효소 활동 측정 될 수 있다. 우리는 이후 그들은 매우 기본적인 구조에 동종 선생님 생산5에 대 한 대용량 사이트에 문서화 되어 KGDHC 및 PDHC를 비교 하기로 결정 했습니다. 그림 5 와 그림 6 기질 농도에 NADH와 H2O2 생산의 종속성을 보여 줍니다. PDHC은 NADH와 H2O2 생산의 0.1-0.5에서 최대에 도달 속도와 기판의 낮은 금액으로 쉽게 포화 mM pyruvate. KGDHC, 다른 한편으로, α ketoglutarate (그림 5) 증가 함께 생산 NADH와 H2O2 에 증분 증가 표시 합니다. 이 KGDHC 및 PDHC, 비록 높은 동종 기본 구조에는 얼마나 많은 기판 최대한 선생님 릴리스를 유도 하는 데 필요한 측면에서 다른 키네틱 속성을 보여 줍니다. 그림 5 KGDHC에서 H2O2 릴리스 NADH 생산 및 기판 여부와 강하게 연결 보여 줍니다. 다른 PDHC에는 동일한 운동 특성이 없습니다. KGDHC와 PDHC 또한 NADH 및 O2●-/ H2O2 때 나드+ 농도 변화 능력을 형성 (그림 6)의 측면에서 다.
여 NADH와 H2O2의 동시 측정, 선생님 생산을 위한 잠재적인 사이트 억제제 상영 될 수 있습니다. 이 H2O2 릴리스의 최대한 억제를 유도 하는 데 필요한 억제제의 양을 확인할 수 있습니다. 또한, 동시에 NADH 생산을 측정 하 여 억제제 행동 뿐만 아니라 선생님의 소스 사이트 확인할 수 있습니다. 이전 연구 KMV, α ketoglutarate 아날로그 이다 KGDHC (≥ 90% 억제)13,15에서 선생님 방출 억제에 매우 효과적으로 나타났습니다. 우리는 또한 CPI-613, PDHC 및 KGDHC, E2 소 단위의 dihydrolipoamide를 차단 하는 리 포 산 아날로그 또한 어느 복잡 한 여 선생님 자료를 억제 수 있습니다 보였다 ~ 9013,14. KMV와 CPI-613에 대 한 행동의 사이트는 그림 7에 나와 있습니다. CPI-613 황 분자를 포함 하 고 그것은 따라서 권고 그 thiol 풍부한 감소 시키는 대리인 (dithiothreitol; DTT) 또는 단백질 (알 부 민) 절차13에서 생략 됩니다. 그림 7 에서는 KMV와 CPI-613 NADH와 H2O2 로 KGDHC 제한에 매우 효과적인 둘을 다 보여 줍니다. 마찬가지로, CPI-613 PDHC (그림 7)에서 H2O2 릴리스를 완전히 없 앴 다. 이러한 결과 KMV CPI-613 H2O2 출시에 대 한 매우 효과적인 억제제 및 따라서 고립 된 미토 콘 드리 아와 실험에 적용할 수 있습니다 보여줍니다. 이후 효과의 직접 평가 및 정화 플 라빈 포함 된 dehydrogenases에 다른 억제제의 선택에 대 한 수 있도록 같은 화면 다른 잠재적인 선생님 형성 효소에 대 한 매우 유익한 것입니다. NADH의 동시 측정은 또한 복잡 한 효소 내 선생님의 잠재적인 소스의 예비 식별을 허용의 이점이 있다. 그림 7 매우 PDHC 하 동종은 KGDHC에 대 한 촉매 메커니즘의 묘사를 제공 합니다. 관찰을 KMV와 CPI-613, E1 과 E2 소 단위 KGDHC의 차단, 거의 완전 하 게 폐지 H2O2 와 NADH 생산, E3 소 단위, 가능성이 유행, 선생님 소스 인지 확인 18. CPI-613 PDHC H2O2 릴리스에 대 한 원리 사이트 E3 소 단위18는 확인에 비슷한 효과 발휘. 유사한 접근은 다른 dehydrogenases에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 복잡 한 효소의 다른 부분을 통해 전자의 흐름을 차단 하는 저 해제의 식별을 해야 합니다.
그림 1 : 분석 결과 설치에 대 한 대표적인 스크린 샷. (A) NADH 및 resorufin 형광에 변화의 운동 측정에 대 한 설정 절차의 묘사. (B) 분석 결과 대 한 형광 매개 변수를 설정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : NADH 및 resorufin 형광에 대 한 대표적인 표준 곡선. 커브는 NADH 및 O2●-/ H2O2 생산의 속도 추정 활용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 원시 RFU 데이터에 대 한 대표적인 추적 수집 분석 결과 중. (A) 분석 결과 중 읽기 각 잘 곡선. 플레이트 보기 곡선 CTL 버튼에 각 잘 읽어을 클릭 하 여 생성 됩니다. (B) 데이터 내보내기에 대 한 데이터 대표 RFU 값이 포함 된 테이블을 생성 보기 아래 클릭. 스프레드시트 내보내기 단추 다음 원시 결과 내보내려면 클릭 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 직접 H2 의 비교 O 2 그리고 KGDHC와 PDHC의 NADH 형성 속도. KGDHC와 PDHC의 잠재적인 형성 NADH와 H2O2 의 (A) 동시 측정. (B) H2O2 와 KGDHC와 PDHC에 의해 NADH 형성의 속도의 계산. 두 포함 하는 플 라빈 효소 NADH 및 선생님 생산의 직접 비교 KGDHC 더 많은 H2O2 의 높은 효소 용량에 관련 되어 생성 하는 방법을 보여 줍니다. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : H의 동시 측정 2 O 2 와 NADH 형성 하는 KGDHC 및 PDHC에 의해 요금 다른 기질 농도 산화. 형광의 변화는 최종 기질 농도 0 mM에서 10 mm 다양 했다를 제외 하 고 이전에 설명 된 대로 측정 되었다. 이 접근은 KGDHC 및 PDHC 운동 속성에 H2O2 출시의 종속성을 확인 사용 되었다. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : KGDHC 및 PDHC는 또한 다른 H2 을 표시 O 2 와 NADH 속성 형성 때 나드 + 레벨 변경 됩니다. 나드+ 의 최종 농도가 1 m m 0에서 다양 했다를 제외 하 고 이전에 설명 된 대로 변경 형광에서 측정 되었다. 이 접근은 KGDHC 및 PDHC 운동 속성에 H2O2 출시의 종속성을 확인 사용 되었다. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : NADH와 H2 에 대 한 다른 사이트 억제제의 상영 O 2 생산. (A) 다이어그램 KGDHC와 액션 KMV와 CPI-613의 사이트에 대 한 촉매 주기를 묘사. Note PDHC 동종 촉매 사이클은 제외 하 고는 KMV pyruvate 바인딩 사이트에 대 한 경쟁 하지 않습니다. E1: pyruvate 또는 α ketoglutarate 효소, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide 효소. (B) 효과 KMV와 KGDHC와 PDHC에 의해 생산 NADH와 H2O2 에 CPI-613. 샘플 KMV (10mm) 또는 CPI-613 preincubated 했다 (150 µ M) 및 다음 NADH와 H2O2 생산에 대 한 분석. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 작업 사진 농도 | 잘 추가 볼륨 | 최종 농도에 잘 |
| KGDHC 또는 PDHC | 1 단위/mL | 20 Μ L | 0.1 단위/mL |
| Superoxide dismutase | 단위/250ml | 20 Μ L | 25 단위/mL |
| 양 고추냉이 과산화 효소 | 30 단위/mL | 20 Μ L | 3 단위/mL |
| 티 아민 파이 인산 | 3 m m | 20 Μ L | 0.3 m m |
| 보 효소 A | 1mm | 20 Μ L | 0.1 m m |
| 나드+ | 10 m m | 20 Μ L | 1mm |
| 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine | 100 Μ M | 20 Μ L | 10 Μ M |
| 기판 | 1-100 mM | 20 Μ L | 0.1-10 mM |
표 1: 기본 프로토콜의 예는 O의 측정에 대 한 설정 2 ●- /H 2 O 2 고 순화 된 PDH 또는 KGDH NADH 생산. 20 µ L 각 시 약의 각 잘 하 고 마지막에 추가 됩니다 이후 볼륨/반응 200 µ L, 각 시 약의 최종 농도 10 배 재고 농도 보다는 더 적은 이다 (예를 들어, 반응 혼합물에 있는 나드+ 의 최종 농도 1 m m ). Note 시 약 테이블에서 순서에서 잘에 추가 되어야 한다.
| 억제제 | 대상 |
| 3-메 틸-2-옥 valeric 산 | KGDHC의 소 단위 E1 |
| CPI-613 | Oxo 산 dehydrogenases의 e 2 소 단위 |
표 2: 저 해제 및 그들의 목표의 목록. 행동의 사이트는 그림 8에 그려져 있습니다.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| 시간 | T ° 376,450 | A 1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0: 00시 04분 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0: 00시 34분 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0: 01시 04분 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0: 01시 34분 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0: 02시 04분 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0: 02시 34분 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0: 03시 04분 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0: 03시 34분 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0: 04시 04분 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0: 04시 34분 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0: 05시 04분 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin 형광 | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| 시간 | T ° 565,600 | A 1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0: 00시 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0: 00시 30분 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0: 01시 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0: 01시 30분 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0: 02시 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0: 02시 30분 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0: 03시 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0: 03시 30분 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0: 04시 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0: 04시 30분 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0: 05시 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
표 3: 실험의 집합에서 수집 된 결과 스프레드시트 보기. 실험에서 생성 된 원시 RFU 값 추가 분석을 위해 스프레드시트 내보내집니다. 실험 이전에 생성 하는 표준 곡선을 사용 하 여 스프레드시트에 NADH와 H2O2 생산의 비율을 계산할 수 있습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H2O2 감지 (예, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다) 선생님 자료에 대 한 선택적 경쟁력 억제제의 수 있습니다. 우리의 그룹 및 다른 사람 사용이 메서드 이전 간행물 allosteric 여 선생님의 규칙을 검사와 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육14,16, 산화 환 원 신호 메커니즘 실시 전에 실험 17,,1920.
수정 및 문제 해결:
이 절차는 거의 모든 교육 기관에서 기본 장비를 사용할 수를 사용합니다. 접근 저렴 한 비용 또한 이며 다양 한 공급 업체를 통해 사용할 수 있는 일반적인 화학 물질을 사용 하 여. 비록, 우리는 기본적인 반응 버퍼 자당, HEPES, 마 니 톨, 및 EGTA 구성 된 대부분의 응용 프로그램에서 잘 작동 나타났습니다 버퍼 구성 효소 특성-에 따라 달라질 수 있습니다. Resorufin 형광에 대 한 원시 값은 일반적으로 약 0.1 U/mL를 희석 하는 효소를 방출 하는 선생님에 대 한 50-500 RFU. 값이 높을수록 RFU AUR 시 빛 또는 반복된 동결-해 동에 노출으로 인해 자동 산화 되었습니다 나타낼 수 있습니다. 따라서, AUR 작업 솔루션 대체 되어야 한다 정기적으로 (사용 주파수)에 따라 2 ~ 3 주마다. 효소 준비 또는 변성 불순물 정상 선생님 및 NADH 수치 보다 낮은 될 수 있습니다. 효소 순도 젤 전기 이동 법에 의해 정기적으로 모니터링 해야 합니다. 운동 속성 (킬로미터 및 기판에 대 한 브이 맥스와 나드+) 또한 있어야 구입 또는 효소의 정화 후 즉시 평가 하 고 다음 정기적으로 그 후 모니터링. 분석 결과에 사용 된 시 약의 대부분 안정 되며 여러 freeze-thaw 주기를 받게 될 수 있습니다. Pyruvate와 α ketoglutarate 자동 산화를 피하기 위해-80 ° C에서 100 µ L의 aliquots에 저장 되어야 합니다. O2●-/H2O2 에 PDHC 및 KGDHC (잠재적으로 다른 flavoenzymes) 급진적인 형성17통해 직접 형성 이후 DTT 같은 감소 시키는 대리인을 사용 하지 마십시오. 37 ° C에서 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나, 우리의 그룹 25 ° C에서 이러한 실험 보다 일관성 있는 데이터를 제공 하기 위한 이상적입니다 발견 했다.
기술의 한계:
이 기술은와 관련 된 하나의 주요 장애물은 정화 플 라빈 포함 된 미토 콘 드리 아 효소에 대 한 액세스. 여기,이 기술은 플 라빈 포함 된 미토 콘 드리 아 dehydrogenases의 선생님 자료 용량 및 효소 활동을 직접 비교를 사용할 수 있습니다 입증 상용 KGDHC 및 PDHC를 사용 우리. 그러나, 대부분 선생님 포함 하는 플 라빈 효소를 생산 하지 상업적으로 사용할 수 있으며 실험실에서 정화 해야 합니다. 이 막이이 효소의 일부 고려 도전적 일 수 있다 바운드 또는 미토 콘 드리 아 내 막에 흡수. 선생님을 생성 하는 막 도약 포함 하는 플 라빈 효소의 성공적인 정화에 대 한 새로운 프로토콜 지금 사용할 수 있습니다. 이 포함 복합 정화 방법 나, 복잡 한 II 및 sn-글리세롤-3-인산 효소21,,2223. 따라서 나열 된 선생님 발전기의 대부분 상업적으로 사용할 수 없습니다, 비록 프로토콜 존재 그들의 격리 및 정화. 순화 플 라빈 기반 효소를 사용 하 여 수집 결과의 생리 적인 관련성 한계 이기도 합니다. 따라서, 정제 효소와 함께 수집 결과 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 직물을 사용 하 여 분석 실험과 따라 되어야 합니다. 5 별도 연구는 KGDHC 및 PDHC14,,1617,19,20여 선생님 출시의 규칙에 대 한 메커니즘을 조사 하이 접근을 사용. 예비 선생님 버전 제어에서 산화 환 원 스위치의 역할에 대 한 결과 처음 순화 KGDHC 및 PDHC를 사용 하 여 테스트 하 고 다음 규칙에 대 한 메커니즘 간 및 심장 미토 콘 드리 아 근육 섬유14, 분석 추가 되었다 16,,1720.
기존의 방법에 관하여 의미:
선생님을 측정 자료 미토 콘 드리 아에서 생산의 개별 사이트에서 O2●-/ H2O2 와 항 산화 시스템 그렇지 않으면 이어질 수 있습니다 생산 경쟁 측 반응의 존재로 인해 도전적 일 수 있다 네이티브의 과소입니다. 잠재적인 막 또한 다양 한 사이트에서 선생님 릴리스 요금을 변경할 수 있습니다 그리고 억제제를 사용 하 여 O2●-/ H2O2 형성 측정을 혼동 하는 전자 흐름을 변경할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 동시에 O2●-/ H2O2 와 효소 활동의 기본 속도 사이의 관계를 평가 하는 동안 개별 효소에서 선생님 자료 용량의 직접 평가 가능 이 저렴 한 방법은 미토 콘 드리 아, 세포, 또는 조직 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 플 라빈 포함 된 미토 콘 드리 아 효소에 대 한 네이티브 선생님 출시 요금 비교 하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다. 또한, 여기에 소개 하는 방법은 미리 화면 효과 고립 된 미토 콘 드리 아와 분석을 실시 하기 전에 선생님 릴리스에 대 한 억제제의 선택도를 활용할 수 있습니다.
미래의 응용 프로그램:
여기에 소개 하는 메서드는 PDHC 및 KGDHC14,,1617,19,20선생님 자료 제어를 조사 하기 위한 5 개의 별도 연구에 사용 되었습니다. 이러한 연구에서 억제제 상영 했다 고 선생님 놓고 NADH 생산 속도 정화 효소를 사용 하 여 평가 했다. 정제 효소와 함께 수집 된 결과 다음 고립 된 미토 콘 드리 아를 사용 하 여 확인 했다 고 근육 섬유14,,1617,20permeabilized. 따라서,이 메서드는 네이티브 선생님 릴리스 요금 미토 콘 드리 아, 세포, 근육 섬유에서 공부 하기 위한 미래 연구의 숫자에 적용할 수 있습니다.
프로토콜에 중요 한 단계:
효소 순도 및 키네틱 속성 정기적으로 모니터링 될 해야 합니다. AUR 재고 시 작업 또한 자주 교체 합니다. 이렇게 하면 수집 된 결과 일치. 시 약의 추가의 순서는 성공적인 실험 (표 1)을 실행 하기 위한 중요 한입니다. 억제제는 선생님 출시의 최대 억제를 유도 하는 데 필요한 농도 결정 하기 위해 적정 한다. 이 연구에서 우리는 10mm KMV 선택 150 µ m CPI-613 이후 우리가 이전이 농도 KGDHC 및 PDHC13선생님 릴리스의 최대한 억제 유도 결정 했다.
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Disclosures
공개는 아무 상관이 있다.
Acknowledgments
이 작품은 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에 의해 투자 되었다. 동영상 제작 교육 및 학습 (CITL) 뉴펀들랜드 메모리얼 대학에 혁신을 위한 센터와 공동으로 실시 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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