Summary
多孔体 microcarriers のセル拡張プロトコル 310 マトリックスをシードする灌流型バイオリアクターにおける情報配信システムとしての利用を提案しています。我々 は、細胞の増殖と microcarriers 上で培養した細胞の生存率を決定するさまざまなテクニックがあります。さらに、バイオリアクター培養後の細胞の機能を示します。
Abstract
ティッシュ ・ エンジニア リングは、組織や臓器移植の目的についての需要の増加のためのソリューションを開発に焦点を当てて、有望な分野です。このような組織を生成するプロセスは複雑であり、特定の細胞型、足場、および身体的または生化学的刺激細胞の成長と分化を導くための適切な組み合わせが含まれています。Microcarriers は、以来、彼らはより高い表面に体積比を提供し、二次元の伝統的な方法と比較して体内の状況をもっと密接に模倣、三次元 (3 D) の微小環境のセルを展開する魅力的なツールを表します。組織設計を生成するとき、血管、細胞に酸素と栄養を供給し、廃棄物の除去は重要なビルディング ブロックを構成します。実際には、ほとんどの構成体は血管サポートの欠乏のために注入されて失敗します。本研究ではスピナー フラスコ、バイオリアクター、動的条件の下で遺伝子組換えコラーゲン ベース microcarriers の内皮細胞の拡張のためのプロトコルを提案する、この設定セル実行可能性と機能を決定する方法について述べる。さらに、血管新生目的で必要な追加の取り外し手順携帯配信のための方法を提案する.さらに、我々 は decellularized 生物学的マトリックスの灌流型バイオリアクターの潜在的な細胞血管新生を評価するための戦略を提供します。提示方法の使用は、組織工学実習におけるアプリケーションの大規模な範囲の新しい細胞を用いた治療法の開発につながることを考えています。
Introduction
組織エンジニア リング アプリケーションで一般的な問題の 1 つはの場所で正しい分化型高細胞塊を生成する必要があります。この問題に対処するため microcarriers のアプリケーションは、これまで大規模な世代の皮膚、骨、軟骨、腱1整形外科組織工学などの分野で重要性を増して、1967 年に開始。彼らを許可する付着性文化の取り扱い方法でサスペンション文化2のようなマイクロ三次元 (3 D) 基板上への細胞の拡大によって。それにより細胞は均質な栄養供給や3,4分化はしばしば失われる 2 D で時間をかけて生体内でのより良いメンテナンスにつながる5に接近する細胞マトリックスの相互作用を経験します。最終的に高いセルの利回り6、7、高いガスにつながる - より高い表面-容積比と静的なシステムに8、規制、物理的な文化を対象とする可能性を比較する栄養の為替レート刺激9、および拡張のプロセス7のスケール アップの可能性はさらに利点が。直径、密度、間隙率、表面電荷接着特性10,11などいくつかの機能は、異なる市販マイクロおよびマクロ-キャリアを区別します。しかし、主な利点の 1 つはサイトの欠陥または需要への放射能として潜在的な彼らの配信です。
生産の前レポート12に示す我々 の骨の組織工学におけるマイクロ ・ キャリア技術の応用、新しいマイクロ ・ キャリアの種類を構成した組換えコラーゲンの私ペプチド (RCP、Cellnest として市販)。この新しいマイクロ ・ キャリアは、携帯配信シナリオでは臨床に必要な足場とセル生産のスケール アップ GMP に準拠したことができます。このコンテキストで足場の安定性、劣化率と最適架橋戦略の適切な選択により表面特性のチューニング選択したアプリケーション技術を適応、金利の種類を細胞または組織13をターゲットすることができます。特に、治療上の適用14注射携帯配信システムとしてこのマイクロ ・ キャリアの潜在的な雇用は、それら臨床設定で特に興味深い。
本稿で我々 したがって分離とひと骨髄由来間葉系間質細胞 (hBMSCs) のひと皮膚微小血管内皮細胞 (HDMECs) コラーゲン私、基づく組換えに拡大培養例を示しますペプチド ベースの microcarriers、臨床の現場での配信のための準備。さらに、注入時に細胞生存率の維持に役立つ追加のプロトコルについて述べる。
移植後の細胞生存率は実際に血管新生15,16,17酸素と栄養の交換を保証し、廃棄物の除去を容易に強く依存します。バイオリアクターは、再生組織工学における血管新生課題を克服し、細胞生存率、それにより酸素や栄養素の18を提供する培養液の灌流を維持する方法の 1 つを構成します。ここでは、我々 は、マトリックス、 de novoの血管新生と血管新生に貢献する能力を RCP microcarriers から微小血管内皮細胞の移行機能を評価するための in vitro法を示しています。このマトリックスは、ブタの腸の decellularized セグメント BioVaSc (生物学的血管柄付き足場) 豊富なコラーゲンとエラスチンと呼ばれると栄養動脈が含まれています血管構造とされている流出静脈19を保存着床の問題20の適用されます。
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Protocol
hBMSCs は、変形性関節症患者の大腿骨頭置換術大腿骨頭から分離されました。ヴュルツブルク大学のローカル倫理委員会および患者のインフォームド コンセントの承認の下でプロシージャを行った。主な血管内皮細胞は、少年ドナーの包皮生検から分離された.その法的日付には、書面によるインフォームド コンセントが用意されています。研究は、ヴュルツブルク大学 (投票数 182/10) のローカル倫理委員会によって承認されました。
1. hBMSCs と HDMECs の単離
- ひと骨髄由来間葉系間質細胞 (hBMSCs)
- 海綿骨を大腿骨頭から削除するには、滅菌スプーンを使用します。
注: 海綿状骨は堅く、堅いである皮質骨内の緩みや粒状物質として表示されます。メスを用いた海綿骨のスクラッチ部分に皮質骨から必要があります。 - 2 つの 50 mL チューブに削除された海綿骨を挿入します。海綿骨量人工股関節置換手術中に削除された大腿骨頭の寸法によると 10 mL までが 5 からあります。
- DMEM F12 (DMEM とハム F12 媒体の 1:1 混合物) で洗浄充填中の約 30 ml チューブ。
- 5 のための縦方向の方法で手動で、チューブを振る s 海綿骨から脂肪細胞をさせる。5 分間 300 x g で 22 ° C に遠心します。
- 卒業プラスチック ピペット、脂肪細胞層および残りの上清の約 20 mL を吸引します。海綿骨をカバーする十分な媒体をしましょう。
- DMEM f12 キーの 10 ml チューブを記入し、積極的にセルを出すための 10-15 秒の手によって縦に振る。
- 新しい 50 mL のチューブにチューブから卒業プラスチック ピペットで細胞を懸濁液の 10-15 mL を転送します。
- ステップ 50 mL のチューブで収集された海綿状骨は白まで得られた細胞懸濁液を一緒に分かち合う 1.1.6 から 2-3 回を繰り返します。
- 卒業プラスチック ピペットで細胞懸濁液を 50 mL の管の底に堆積したコラーゲン ペレットを吸引を回避する 2 つの新しいチューブに転送します。
- 5 分間遠心する 300 × g、22 ° C で細胞懸濁液は、卒業プラスチック ピペットで吸引して上澄みを廃棄します。
- 3 管内 DMEM F12 10% FCS 1% ペン/連鎖球菌の 50 μ g/mL アスコルビン酸-2-リン酸の 40 ミリリットルを追加します。この培地 5 mL を各管内細胞ペレットに転送します。チューブの底を激しく点滅させて細胞ペレットを再停止し、細胞懸濁液を管内唯一の媒体に転送します。
- 省略可能: セルをカウントするため細胞を懸濁液 100 μ L を希釈、トリパン ブルーの PBS とし 1:10 トリパン ブルーで最初 1: 100 希釈 DPBS 15 μ、30 μ L に最初の希釈の 15 μ L を追加する、DPBS を取得: トリパン ブルーの比が 1:1。ノイバウアーの標準チェインバーとセルをカウントします。
- 1.1.11 で説明するよう 109セル/175 cm で2 T フラスコ 25 mL の培地に細胞を播きます。また、カウントせずに最大 10 175 cm2細胞培養フラスコで全細胞懸濁液を分割します。この段階では、hBMSCs、それらに移って、赤血球から区別できません。hBMSCs、スパース植民地として表示されます (1-2/フラスコ) 最初の 7 日間のコース上。
- HBMSCs と血液細胞の相互作用を許可するように播種から 4 日後に媒体を変更します。最初のメディア交換後 2-3 日毎に媒体を変更します。卒業プラスチック ピペットと培養液を完全に除去し、洗浄 2 回 DPBS (付着細胞へ DPBS の 10 mL を追加、卒業プラスチック ピペットの DPBS を完全に削除して) 20 mL に追加でメディアの交換を実行します。1.1.11 に記載されている新鮮な媒体。
- 海綿骨を大腿骨頭から削除するには、滅菌スプーンを使用します。
- ひと皮膚微小血管内皮細胞 (HDMECs)
- 皮膚生検を治療し、以前に公開されたプロトコル21によると HDMECs を分離します。簡単に言えば、表皮から真皮の分離後、37 ° C、5% CO2で 40 分のトリプシンの真皮をインキュベートします。培養時間後真皮を含む培地、ペトリ皿に転送、メスを使って各部分をスクラッチします。50 mL プラスチック チューブ 300 x の g および 22 ° C で 5 分間遠心分離して得られた細胞懸濁液を転送します。1.2 104セル/cm2倍の密度でノイバウアー商工会議所と種子を用いた細胞懸濁液をカウントします。完全に毎日他媒体を変更します。
2. セットアップとスピナー フラスコ、RCP microcarriers やバイオリアクターの殺菌
- スピナー フラスコと RCP microcarriers
- 前日実験、セットアップ、スピナー フラスコとオートクレーブによる殺菌のためにそれらを準備します。
注: スピナー フラスコのキャップを野放しにして、可能であれば、直立位置でそれらを殺菌します。- 開梱時の汚染を避けるためにサイドのキャップ周りのアルミ箔とスピナー フラスコを別々 にラップします。滅菌後の汚染のリスクを最小限に抑えるためにオートクレーブ用アルミ箔の層が 1-2 でフラスコをラップします。
- 20 ml DPBS の RCP 多孔体 microcarriers の必要量の重量を量る。
注: 30 mg がスピナー フラスコごと必要です。オートクレーブ (121 ° C で 15 分) による熱殺菌する前に少なくとも 1 時間「メタンハイド レート」させてください。
- 前日実験、セットアップ、スピナー フラスコとオートクレーブによる殺菌のためにそれらを準備します。
- 灌流型バイオリアクター
- 血管柄付き組織等価20を生成する説明バイオリアクター システムを使用します。このバイオリアクターは、マトリックスが配置される容器の中型タンクと圧力のボトルで構成されます。
- 中規模貯留層とシリコン チューブ (図 3を参照) を通じて圧ボトル容器を接続します。キャップを野放しとオートクレーブ ビニール袋に、まあ、閉じる、2 番目のオートクレーブ ビニール袋でこれを置きます。オートクレーブで滅菌します。
- 血管柄付き組織等価20を生成する説明バイオリアクター システムを使用します。このバイオリアクターは、マトリックスが配置される容器の中型タンクと圧力のボトルで構成されます。
3. hBMSCs と RCP 多孔体 microcarriers に HDMECs の文化
注: RCP microcarriers のシードに使用 HDMECs がレンチ ウイルス伝達で RFP でラベル付けされました。このプロトコルは、以前に公開されたプロトコル5後変更されました。
- RCP マクロポーラス microcarriers 底に沈殿し、10 mL の培養液で洗ってみましょう。3 回繰り返します。
- スピナー フラスコ培養培地 10 mL で洗います。
- 8 mL の培養液にスピナー フラスコあたり RCP 多孔体 microcarriers の 30 mg を追加します。細胞を播種する前に、30 分間の 37 ° C および 5% の CO2で RCP microcarriers を含むスピナー フラスコを平衡します。
注: これは滅菌前に RCP microcarriers のおおよその乾燥重量に基づいています。 - スピナー フラスコ培養培地 2 mL にあたり 5 x 105 hBMSCs または HDMECs (3 通路を) 種子します。
- スターラー プレートと開始 5 分 90 rpm、残り 55 分、37 ° C、5% CO2、1 h 静的/動的インキュベーションの合計のための攪拌にスピナー フラスコを配置します。4 回繰り返します。
- スピナー フラスコあたり細胞培養培地 10 mL を追加し、連続 95 rpm で攪拌します。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。
- マイクロ ピペットを使ってサンプルを取る日 1、4、7:333 μ L で DNA のコンテンツ (〜 0.5 mg)、1000 μ L SEM 分析のため (〜 1.5 mg) とライブ/死者の汚損のため 333 μ L (〜 0.5 mg)。
注: これは滅菌前に RCP microcarriers のおおよその乾燥重量に基づいています。 - 一日おきの培養培地 10 mL を変更します。このため、RCP microcarriers 底に沈殿し非常に慎重に 10 mL のピペットの使用と、スピナー フラスコから 10 mL を吸引し、新鮮な培養液 10 mL を追加までを待機します。
- 7 日間の CO2を 37 ° C、5% での 95 rpm に設定攪拌板文化を保ちます。
4. DNA 量、SEM 分析、ライブ死んで染色と発芽アッセイ
- DNA の内容
- マイクロ ピペットを用いて、2 ml プラスチック チューブにスピナー フラスコ (333 μ L の懸濁液に含まれる)、転送 microcarriers の約 0.5 mg を収集します。
注: これは滅菌前に RCP microcarriers のおおよその乾燥重量に基づいています。 - DPBS、1 mL で 1 回洗浄し、上清を吸引します。
- 残り、エアカーテンの DPBS を削除し、以降の正規化用凍結乾燥 microcarriers、重量。
- 少なくとも 6 時間-80 ° C で凍結します。
- 300 μ L パパイン 5 一晩 60 ° C にサンプルをインキュベート U/mL。
- 定量分析 (例えば、PicoGreen dsDNA の試金) の manufacturer´s の指示に従って適切な滴定曲線キットと 520 の蛍光信号の測定を行う発光検出器を用いた nm。
- マイクロ ピペットを用いて、2 ml プラスチック チューブにスピナー フラスコ (333 μ L の懸濁液に含まれる)、転送 microcarriers の約 0.5 mg を収集します。
- 走査電子顕微鏡 (SEM) 分析
- 2 mL プラスチック チューブにそれぞれのスピナー フラスコと転送から ca. microcarriers 1 mg を収集します。
- 一度 DPBS 1 mL で microcarriers を洗ってください。
- DPBS を外し、1 h の 70% エタノール 1 mL で孵化させなさい。
- 上清を除去し、1 時間 80% エタノール 1 mL で孵化させなさい。
- 上清を除去し、1 時間 90% エタノール 1 mL で孵化させなさい。
- 上清を除去、1 h の 100% エタノール 1 mL で孵化させなさい。
- 上清を除去し、ヘキサメチルジシラザンの 10 分の 1 mL で孵化させなさい。
- キャップを開き、化学のフードの下でサンプルの乾燥一晩てみましょう。
- 適切なサポートのサンプルを修正し、確立されたプロトコルに従って、SEM 分析に進みます。
- DAPI と Live/デッド染色
- 細胞、microcarriers の播種後 2、4、および 7 日各スピナー フラスコ転送から 2 mL プラスチック チューブに microcarriers の 0.5 mg を収集します。一度 DPBS 1 mL で洗浄します。
- DAPI
- それらをカバーする十分な 4% パラホルムアルデヒドで 10 分間のサンプルを修正します。
- 一度 DPBS 1 mL で洗浄します。
- ロッキング シェーカー上で 45 分間染色液に室温で孵化させなさい。
- 420 nm 発光フィルターと蛍光顕微鏡に DAPI 蛍光信号を検出し、画像を取得します。
- ライブ/デッド染色
- ライブ/デッド色素溶液の 500 μ L のサンプルをインキュベートします。サンプルを 37 ° c 20 分、光から保護してください。
- 一度 DPBS 1 mL で洗浄します。
- 490 nm 発光フィルターを用いて生細胞の蛍光顕微鏡の 545 nm 発光フィルターと死んだ細胞の蛍光信号を検出します。画像を取得します。
- HDMECs の発芽アッセイ
- ミックス 330 μ コラーゲン R ソリューション 0.4%、0.1% の酢酸の 170 μ L、15 mL プラスチック チューブの中の M199 の 50 μ L。氷の上を保ちます。
- マイクロ ピペットを使って microcarriers (250 μ L) の ~0.375 mg を取る。1.5 mL プラスチック チューブに転送、RCP microcarriers 底に沈殿し、メディアを完全に削除するを待ちます。
注: これは滅菌前に RCP microcarriers のおおよその乾燥重量に基づいています。 - コラーゲン混合物を中和し、RCP microcarriers 混ぜてすぐに必要な水酸化ナトリウム 0.2 N のボリュームを追加します。
注: pH の変化までの混合物に追加することによって水酸化ナトリウム 0.2 N の必要量を事前に確認する (黄色からピンクに)、1 分、その後ゲルを形成する必要がありますのためのインキュベーターに混合物を置く。 - プレート 24 ウェル プレートのウェル内コラーゲン ゲル RCP microcarriers 混合物。37 ° C で 30 分間 5% CO2孵化させなさい。
- 血管内皮細胞増殖因子 (例えば、VascuLife VEGF Mv 培) 200 μ L を追加します。37 ° C と 5% CO2 24 時間で孵化させなさい。
- 倍率オブジェクト X 10 を使用して逆位相差顕微鏡下で観察し、画像を取得します。
5. マトリックス シードと HDMECs のバイオリアクター システムの開始
- バイオリアクター文化を開始する前に 1 日は、対側縦オープン BioVaSc (マトリックス) をカットし、以前消毒ポリカーボネート フレームでそれを修正 (図 3 a, Bを参照)。
注: BioVaSc は脱豚腸セグメント、準備として以前公開された21から得られたニッピバイオ マトリックスです。
注: ポリカーボネート フレームは、熱によって滅菌できませんソニック風呂 (40 kHz) 25 分エタノール 70% で 3 時間 20 分で消毒します。その後、滅菌 DPBS で 3 回フレームを洗います。- 100 mm ペトリ皿内ニッピバイオ マトリックス フレーム システムを置き、血管内皮増殖因子 + 1% でそれを埋めるペニシリン ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。
- 37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートし、マトリックスを平衡します。
- デタッチとセルをカウント後、10 x 107ニッピバイオ マトリックス、保存されて vasculature を通して培の 1000 μ L HDMECs 2 mL 注射器を使って注入します。
注: は、動脈口 ~ 700 μ L と静脈の出口を通して 〜 300 μ L を注入します。 - 携帯の添付ファイルを許可する 37 ° C および 5% CO2 、3 時間で孵化させなさい。
- 血管内皮増殖因子 + 1% の 350 mL とバイオリアクター システムを埋めるペン/連鎖球菌と 37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。
- バイオリアクターの容器内には、フレームを配置します。椎弓根動脈と静脈を血管に接続します。
- 蠕動性ポンプをバイオリアクター システムを接続することによって血流を開始します。10 mmHg と振幅 ± 1 で圧力を設定します。
- 段階的圧力 100 mmHg の圧力振幅 ± 20 に到達するまですべての時間を増加します。
- これらの条件下で 7 日間の 37 ° C、5% CO2バイオリアクター システムを保ちます。
6. RFP-HDMECs、マトリックスに添加
- 0.4% コラーゲン R ソリューションの 330 μ L、0.1% の酢酸の 170 μ L と 15 mL の隼のチューブの中の M199 の 50 μ L を混ぜます。氷の上を保ちます。
- スピナー フラスコから RCP microcarriers を取る。培養液を完全に削除します。
- コラーゲン混合物を中和し、RCP microcarriers 混ぜてすぐに必要な水酸化ナトリウム 0.2 N のボリュームを追加します。
- マトリックスの内腔にコラーゲン ゲル RCP microcarriers 混合物を追加します。30 分のゲル化を許可します。
- 並行して、メディアを完全に削除することによって汚泥の中を変更し、新鮮な中古の 350 mL 暖め、血管内皮増殖因子 + 1% 追加ペン/連鎖球菌。
- バイオリアクターを蠕動性ポンプに接続し、100 mmHg と振幅 ± 20 で圧力を設定します。
- 7 日ごとに媒体を変更します。
- 21 日間文化のバイオリアクターを維持します。
7. 分析とバイオリアクター文化の読み出し
- サンプルの準備
- 汚泥から、マトリックスを外し、ポリカーボネートのフレームから削除します。
- 6 セクションに得られた部分をカット: MTT、パラフィンの埋め込み/染色 2、SEM 分析のための 2 のための 2。
- パラフィン包埋
- ペトリ皿のセクションを置き、それらをカバーする十分な DPBS で洗います。DPBS を破棄します。
- 一晩 4% のパラホルムアルデヒドのセクションを修正します。
- パラフィン包埋用カセットを準備し、標準プロトコルによるとそれを実行します。
- パラフィン ブロックのセクションを準備し、H & E 染色、ミクロトームの使用と 3 μ m のサンプルをカットします。
- H & E 染色
- 標準プロトコル32に応じて水分を補給されたセクションを染色します。
- 走査電子顕微鏡 (SEM) 分析
- ペトリ皿のセクションを置き、それらをカバーする十分な DPBS で洗います。DPBS を破棄します。
- 一晩 4.75% グルタルアルデヒドでセクションを修正します。
- 濃度のエタノール 50-100% の増加と脱水チェーンを実行します。
- 10 分破棄使用 HMDS ヘキサメチルジシラザン (HMDS) でセクションをカバーし、新鮮な HMD を追加します。
- ヒューム フードの下で一晩乾燥してセクションを許可して、イメージング用サンプルを準備します。
- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT)
- 1 Mg/ml の濃度で、血管の内皮細胞増殖因子と MTT の試薬を混ぜます。
- 37 ° C、5% CO2で 90 分の MTT 溶液中セクションを孵化させなさい。
- 肉眼的または代謝活性の高い細胞を検出するため、明るいフィールド顕微鏡下で血管の構造と細胞の種 microcarriers を確認します。画像を取得します。
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Representative Results
図 1 aのように、生きているかデッドの汚損によって決定されるカルチャの 7 日後 RCP microcarriers に実行可能なセルの数が多いを得た.これらの結果は、部分的に (図 1 b) を短期、毛穴周り完全に植民地化された microcarriers を認め、SEM 分析によって確認されました。その一方で、実験で細胞ない均等に播種したいくつかの空 microcarriers 結果になった失敗した実験は、以上合計セル量 (図 1) の 10% をしないで死んだ細胞の異常に高い数が特徴です。さらに、HDMECs の DNA の内容数量は時間 (図 1) をかけて dsDNA の増加を示した。
また、RFP HDMECs できた RCP microcarriers の培養後の機能を維持するためにに示すよう図 2細胞がコラーゲン ・ ゲル内培養の発芽表現型を採用します。
さらに、マトリックス BioVaSc ルーメンを再シードするのに RFP HDMECs 植民地化 RCP microcarriers を使用しました。このため、血管柄付き組織同等22 (図 3)、我々 カットを開きます、マトリックスとポリカーボネート フレームにそれを置くの生理血流のバイオリアクター システム方法を用いることにより内腔もセットアップ (さらされました。図 3 b)。
バイオリアクター文化の 21 日後代謝活性の高い細胞、マトリックスの保存状態の血管および RCP microcarriers の両方に存在していた (図 4 aと図 3 b)。失敗した実験や組織学的試料のセクショニング中にスライスの間違った選択は、マトリックスまたは、microcarriers の血管の内腔内皮細胞を植民地化の不在につながることができます。RCP microcarriers の一部の地域がまだ細胞で覆われていたことと、マトリックスに近接した RCP microcarriers それは観察することができる場所、ニッピバイオ マトリックス断面の SEM 解析によってこれらの結果を確認できる (図 44 D)。
最後に、H & E 染色血管構造 (図 5 a) 具体的に、マトリックス上の HDMECs の存在を確認しました。蛍光顕微鏡下で観察すると、マトリックスの血管構造を植民地化細胞が RFP HDMECs (図 5 b)、RCP microcarriers から細胞のマトリックスへの移動を示すになったいくつかの RFP HDMECs RCP microcarriers (図 5および5 D) も観察されました。実験で、細胞はないために生き残った培養条件 (文化時間の短縮など) を変更、彼らを検出できませんでした以前に報告された技術 (図 5Eと5F の none を使って血管構造の内側).
図 1: 文化 HDMECs と RCP microcarriers に hBMSCs 。(A, C)ライブ/デッド動的文化の 7 日後染色します。(B)動的文化の 7 日後 RCP microcarriers 上で培養した HDMECs の SEM 解析。(D) DNA コンテンツ PicoGreen アッセイ キットによって決まります。平均 ± 標準偏差で表されるデータ (n = 3)。スケール バー: A の 200 μ m、b、88 μ m、C の 100 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 発芽アッセイ。RFP HDMECs のもやしは、明るいフィールド(A)と蛍光顕微鏡(B)、新たな植民地化された RCP マイクロ ・ キャリアからのコラーゲン ・ ゲル内培養 24 時間後の下で観察できます。(C)は、イメージをオーバーレイします。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マトリックスとバイオリアクターのセットアップ。(A)ニッピバイオ マトリックスとポリカーボネート フレーム(B)の取り付けの準備。(C)バイオリアクターを設置しました。船は中の貯留層とシリコン チューブを通して圧力のボトルに接続されているし、システム全体が蠕動性ポンプに接続されています。圧力は、圧力センサーによって測定されます。AI: 動脈入口;VO: 静脈の出口。この図は、Groeberらから変更されています。22この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: バイオリアクター読み出し。MTT の試金は、RCP microcarriers (B)と同様、 (A)ニッピバイオ マトリックスの保存された血管の代謝活性の高い細胞を認め、文化の 21 日後ニッピバイオ マトリックス部に実行されます。(C, D)マトリックス部に RCP microcarriers の SEM 画像。スケール バー: a、B、c、47 μ m および d 225 μ m 0.45 cm 0.28 cmこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: H & E 染色・蛍光画像。(A、C、E)H & E 染色します。(B、D、F)21 日間培養後 RFP HDMECs は RCP microcarriers (矢印) にだけでなく、マトリックス (矢印) の血管内観察されました。スケール バー: E と F の A D と 30 μ m の 50 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マイクロ ・ キャリアの 1 つの主な目的は、必要な場所にセルを提供するために、分化を維持しながら細胞の拡大です。表されたメソッドは、セルを添付し、増殖、細胞密度の高いと、microcarriers を植民地化しできた RCP microcarriers をご紹介します。これはライブ/デッド染色、生菌の 90% 以上が動的文化の 7 日後のみいくつかの死んだ細胞が得られた中に検出されたで観測されました。同様に、SEM 画像はセルが文化の 7 日後、microcarriers の全体の表面をカバーすることを確認しました。
3 D モデルの細胞の存続を確保するため、廃棄物の除去ができ、細胞に酸素と栄養の供給を維持することが重要です。血管は、以来、彼らは血管23の内側の部分の内側を覆う細胞に内皮細胞が重要な役割を再生、この exchange プロセスの責任がある構造です。彼らは増殖、移行、付着、スプラウト、および24血管のような構造を形成する能力を持っています。これらのプロパティは、セルを発芽の表現型をとることができたことがわかったので RCP microcarriers に RFP HDMECs の培養後維持された (図 2参照)。これらの植民地の RCP microcarriers された BioVaSc マトリックスの元の血管の内腔を再シードする主な血管内皮細胞を提供して効果的に、我々 はここでかもしれない。これは体制組織インプラント臨床応用のための新生血管を改善するために適していることを示唆しています。血管新生のアプローチ25、体外腫瘍と同様の sytems21,26,27,28をテストとして、生産、この行列の誘導体は、正常に使用されています。皮膚動物実験29の代わりに、同等のもの。ここに使用されるオープンでフラット セットアップ、組織等価22世代の灌流バイオリアクターに配置されます。
バイオリアクターは、拒絶反応や合併症の30のような関連するリスクを削減しながら臓器の需要やすさを助けることができる組織の同等物を生成する組織工学で使用されています。ただし、生産組織のような構造は、組織固有のセル型、適切な足場および適切な分化と三次元組織にまとめることができる適切な成長因子の使用を含む非常に複雑なプロセスです。設計された構造の 1 つの主要な欠点は細胞生存をサポートする適切な血管のネットワークの欠如の in vitroとin vivoの17。ここで組み合わせて RCP 植民地 microcarriers バイオリアクター モデルの decellularized マトリックス セルの種類、必要な細胞接着と血管の形成との本質的な要因を提供する特定の文化媒体ことができる足場を提供すること増殖し、その機能のプロパティを保持するセルです。このモデルの重要な結果は、RCP microcarriers から追加の剥離や他のアプローチの31で必要に応じて消化なし足場に移行する、HDMECs の能力です。その後、彼らは microcarriers は、再生医療用細胞配信システムとして使用できます、マクロポーラス概念を証明する行列の具体的には血管構造を植民地化。
完全に、このプロトコルを表す最大セル拡張を取得するための再生医療に有望な戦略と着床、組織移植のための血管新生サポートを向上可能性がありますそれに携帯配信になるかもしれません。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
これらの結果につながる研究資金から、欧州連合第 7 フレームワーク プログラム FP7/2007-2013 付与契約 n ° 607051 の下で (バイオ刺激) を受けています。私たちは、SEM 分析支援のためケイ酸塩研究 ISC の RCP 製造とフラウンホーファー研究所からヴェルナー ・ ストラックの間に技術援助から富士フイルム製造ヨーロッパ BV、キャロライン ・ ヴァン ・ Spreuwel Goossens を感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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