세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

세포종 (GBM)은 성인, 단지 12-15 개월^1,2,3,,45의 음침한 메디아 생존에 가장 일반적인 기본 뇌 암. 생존은 최대한 외과 절제술 방사선 및 수 반하 및 보조 temozolomide 요법의 현재 임상 표준 때 2005^6,7채택 이후 크게 개선 하지. 이 치료 환자 증상의 임시 구호를 제공, 치료 치료의 표준 변함없이 결과 하지 되풀이 침략 암 foci 절제를 회피 하 고 체계적인 치료에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)에 의해 보호 됩니다. 침략 적인 종양 foci BBB를 우회 하는 동안 대상 전략 시급히이 공격적이 고 쇠 약 질병에 대 한 견인을 얻기 위해 필요 합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 마약 배달 차량 때문에 그들의 네이티브 종양 차 있는 굴곡 운동^8,9GBM 약속 표시. MSCs에 대 한 수용 체를 소유 하 고 stromal 세포 유래 인자 1α를 포함 하 여 종양 분 비 성 요인으로 마이그레이션 (자위대-1α), 매트릭스 metalloproteinase-1 (MMP-1), 및 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 다른 사람의 사이에서^{10, 11 , 12 , 13}. 표현 하 고 분 비 세포 독성 약물 엔지니어링 MSCs 종양 유도 마약 배달 차량으로 다룰 수 있도록. 조작된 MSCs 침략 적인 종양 foci 쪽으로 이동 하 고 치료 단백질을 제공 합니다. 이 방법은 다양 한 전 임상 GBM 모델^9,14에서 타당성을 설명 했다. 그러나, 이러한 모델의 대부분에는이 구성의 임상 관련성에도 불구 하 고 수술 절제를 포함 되지 않습니다. 신흥 연구 절제의 새로운 모델을 사용 하 여 공개 외과 종양 제거 수술 구멍¹⁵에 직접 주입 하는 줄기 세포의 고집을 감소. 생존 능력의 손실 귀착되 었 다 감소 효능, 침략 적인 종양 foci 감소 복용량에 약물의 기간으로 인해 전달.

높이기 위해 줄기 세포 생존 능력 및 약물 전달, MSCs 건설 기계 주입 이전에 시드할 수 있습니다. 이 프로토콜, 생체 및 resorbable electrospun nanofibrous poly(lactic acid) (PLA) MSCs PLA flexes 및 이식, 치료 범위를 최대화 하 고 최소화 시 절제 구멍의 모양에 대 한 발판으로 사용 합니다 거리 MSCs는 종양 세포에 도달 여행 해야 합니다. MSCs 주입 동안 발판에 유지 하 고 주입^16,17후 종양 세포를 향해 비 계에서 마이그레이션합니다. MSCs와 그들이 다음에 수행 하는 세포 독성 약물 종양 foci에서 축적. 종양 세포 독성 약물의 배달 MSC 생존 및 지 속성, 둘 다 건설 기계에 이식 하 여 주 었 필요 합니다.

이 절차에서는 lentiviral 벡터 (시험관에 있는 추적) 형광 및 발광 (vivo에서 추적)의 안정적인 식 유도 하 되 암과 줄기 세포 라인에 마커. 인간의 GBM 라인 U87 mCherry와 반딧불 luciferase (U87 mCh-플로리다), 그리고 GFP와 renilla luciferase (MSC GFP-Rluc)와 비 치료 MSCs 감염입니다. MSCs의 치료 변종 TNFα 관련 apoptosis 유도 하는 리간드 (MSC-트레일)을 표현 한다. 트레일, constitutively 분 비 단백질, 암에 죽음 수용 체 근처에 바인딩합니다 세포 및 caspase 중재 apoptosis¹⁸시작.

여기, 우리는 전 임상 이미지 기반 GBM 외과 절제술 및 MSC 시드 장비의 이식에 대 한 프로토콜을 제공합니다. 간단히, 누드 마우스의 U87 mCh-설정할 기본 종양 정위 적 orthotopic 주입 후 3 일 뒤 craniotomy를 받는다. 약 1 주일 동안 engrafted 종양 성장. PLA 건설 기계는 절제 수술 전에 MSCs 48 h 시드. 종양은 다음 형광 지도, 절제 하 고 MSC 로드 비 절제술 구멍으로 이식. 종양 및 마우스 생존 다음 post-operatively (BLI) 이미징 하는 생물 발광으로 추적 됩니다. 이 절차의 타임 라인 (그림 1) 아래 제공 됩니다.

그림 1: 절차의 타임 라인. 마우스 처음 두개골 창 (0 일) 받을 수 있습니다. 종양은 3 일의 회복 기간 후 (3 일)를 이식 하 고 약 1 주일에 대 한 성장. 건설 기계 종양 절제와 이식 절차 (10 일)에 앞서 2 일 MSCs (8 일)와 시드 있습니다. 종양의 진행 및 치료 효능은 수술 후 그 후 이미징 (하루 10 +)을 통해 평가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 노스 캐롤라이나 대학의 채 플 힐에서에 의해 승인 되었습니다.

참고:이 절차는 오픈 craniotomy와 쥐에 수행 Mostany와 Portera-리아우¹⁹ 수술로 제거 된 뼈 조직을 삭제 점에서 프로토콜의 수정된 된 버전으로 떠나는 두뇌 설립에 대 한 접근 및 궁극적인 GBM 종양의 절제입니다. 오자와 제임스²⁰에 설명 된 대로 craniotomy, 종양 정위 적 주입을 통해 설립 됩니다. 우리는 다음 정위 적 좌표에 (mm)에서 bregma 1 x 10⁵ U87 mCh-플로리다 세포 이식: (2.5, 0,-0.5).

1. 세포 배양 준비 발판 및

참고: 건설 기계 48 h 쥐에 주입 하기 전에 준비 되어야 한다. 다음 볼륨 당 발판으로 제공 됩니다. 추가 건설 기계에 대 한 필요에 따라 수량을 곱하면 됩니다.

1. PLA 건설 기계 절제술 구멍 크기 (약 2mm x 2mm) 조각으로 잘라. 건설 기계가 위를 사용 하 여 또는 반복성에 대 한 구멍 펀치를 사용 하 여 손으로 자를 수 있습니다.
2. 15 분 뒤에 PBS에 immersing 70% 에탄올에 immersing 하 여 소독. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 시드를 위한 세포를 준비 하는 동안 포함 된에 비 계를 배치 합니다.
3. 0.05 %trypsin (T75 플라스 크에 대 한 3-5 mL)을 사용 하 여 교양된 MSCs를 들어올립니다. 5 분 셀 해제는 없는지에 대 한 37 ° C에서 품 어 다음 트립 신 비활성화를 플라스 크에 7-10 mL DMEM을 추가 합니다.
4. 15 mL 원심 분리기 튜브를 플라스 크 내용을 전송 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 5 x 10⁵ MSCs 5 분 x 100g에 원심 분리를 통해 각 비 계에 대 한 작은
5. 상쾌한 오프 aspirate와 5 x 10⁵ 셀 당 5 µ L DMEM에서에서 MSCs를 resuspend.
6. 건조 그들에 아 티 하 여 시드에 건설 기계를 준비 합니다.
   1. DMEM 침수에서 집게로는 비 계를 제거 하 고 일시적으로 6-잘 접시의 뚜껑에 배치. 초과 DMEM의 물방울을 남겨두고 뚜껑을 비 계를 들어올립니다.
   2. 다시 새로운, 건조 위치에에서 뚜껑에 다시 발판을 놓습니다. 반복 3-5 번, 다음 시드를 위한 새로운 6 잘 플레이트에 부분적으로 말린된 비 계를 배치 합니다. 각 비 계를 반복 합니다.
      참고: 부분적으로 말린된 비 계 시드 결과 최적의 셀을 제공 합니다. 발판 너무 젖은 경우에, 세포 발판 미끄러져 하 고 잘 플레이트 아래에 준수. 발판은 너무 건조, 드롭릿에 가난한 초기 셀 배포 결과 전체 비 계에 확산 되지 것입니다.
7. 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 줄기 세포 일부 셀 바닥에 정착 할 수 있습니다 중지를 균질의 유리병 믹스.
8. 천천히 2.5 µ L 갓 MSC 정지 비 계, 발판의 정상에 작은 물방울을 만들기에 직접 혼합 플라스틱.
9. 300 µ L DMEM의 각 가장자리를 추가 합니다. 이 셀 물방울의 급속 한 증발이 되지 것입니다. 발판에 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
10. 겸 자와 함께 부드럽게 플립는 건설 기계 잘 접시에. 씨 2.5 혼합 갓 µ L MSC 현 탁 액 (비 계 당 시드 5 x 10⁵ 셀의 총에서 결과). 발판에 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
11. 6 잘 플레이트의 각 음을 2 mL를 추가 하 여 DMEM에서 건설 기계를 커버. 그들 밑에 흐르는 매체를 허용 하는 건설 기계를 부드럽게 들어올립니다. 이식 수술 전에 48 h에 대 한이 상태에서 37 ° C에서 품 어.
12. 초과 증발 또는 pH 불균형으로 인해 변색된 미디어 관찰 되는 경우 24 시간 및 추가/변경 미디어 후에 건설 기계를 확인 합니다.

2. 형광 유도 절제 및 비 계 주입

참고: 초기화 수술 전에 모든 도구 소독. 관리 예방 무 통 기관 IACUC 프로토콜에 명시 된.

1. Stereomicroscope 해 부 형광의 무대에서 stereotaxic 프레임을 배치 합니다.
2. 유도 챔버에서 흡입된 isoflurane 아래 마우스 anesthetize 취, 일단 isoflurane 코 콘 어댑터를 통해 지속적인 흡입된 마 취 공급 stereotaxic 프레임에 마우스를 보안 합니다. 가 열 패드 또는 프로브 체온을 유지 한다.
   참고: 4-5 %isoflurane 유도 적합 및 2-3%는 유지 보수에 적합 하지만이 적응 되어야 하며 각 마우스에 대 한 모니터링.
3. 각 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다. 3 알코올 및 3 betadine 잎사귀의 일련의 두 피 절 개 사이트를 소독.
4. 각 다리에 발가락 핀치 반사 테스트를 수행 하 고 적절 한 anesthetization를 위해 부정적인 응답을 확인 합니다. 약 55-65 호흡/분 꾸준한 호흡 속도 확인 합니다.
5. 집게를 사용 하 여, 꼬 집 고 두 피를 부드럽게 리프트. 수술가 위로 중간 선형 rostral 꼬리 절 개를 확인 합니다. PBS와 절 개 사이트를 관개 하 고 솔 질 원운동에 목화 제보 주걱으로 쳇 지방 제거. 이전에 설립 두개골 창 완전히 표시 되도록 피부를 정렬 합니다.
6. 그냥 인테리어는 18 G 바늘을 사용 하 여 두개골 창의 테두리를 경질을 찔린 부드럽게 합니다. 절 개는 완벽 하 게 윈도우의 내부 추적 될 때까지 반복 합니다.
7. 멀리 공개 기본 실질과 종양 미세 집게를 사용 하 여 그것을 박 리 하 여 두 라를 제거 합니다.
8. 객실 조명 및 stereomicroscope 형광 모드 의해 U87 mCh-플로리다 종양을 찾습니다. 진공 펌프의 배관의 끝에 1-200 µ L 피 펫 팁을 로드 하 여 절제에 대 한 준비.
9. 진공 펌프를 켭니다. 신호가 남아 때까지 부드럽게 형광 조직 발음 하 여 종양을 resect. 진공 펌프를 끄고 열이 피 펫 팁 삭제. 형광 조명에 다시 룸을 끌.
   참고: 출혈을 제어 하려면 차가운 PBS와 관개 하 고 목화 제보 주걱으로 꾸준한 압력을 적용 합니다. 더 심한 경우 절제술 구멍 수 또한 일시적으로 포장 hemostatic 에이전트도 출혈 뒤에 또 다른 PBS 관개 멈춘 후 제거 됩니다.
10. 이식, 직전 원치 않는 미디어와 관련 된 구성 요소를 제거 하는 PBS에 MSC 시드 PLA 비 계를 찍어 천천히. 절제술 캐비티에 발판을 이식. 필요한 경우, 장소에 1 µ L fibrinogen (67-106 mg/mL) 1 µ L 트 롬 빈 (400-625 U/mL) 발판을 확보 하 여 다음을 추가 합니다.
11. 경질 제거와 두개골 창 이미 삭제에서 뼈 플랩, 피부를 닫고 외과 접착제를 적용 하면 상처를 봉인. 흡입된 마 취에서 동물을 제거 하 고 온수 표면에 복구할 수 있도록.
12. 일단 외래, 반환 마우스 케이지를 합니다. IACUC 승인 일정에 진통제를 관리 합니다. 각 마우스에 대 한 절차를 반복 합니다.

3입니다. 수술 후 이미징

1. 28 G 인슐린 주사기를 사용 하 여, D-소 (150mg/kg 복)와 쥐를 주사.
2. 10 분을 기다립니다. 이것은 몸 전체에 순환 하 고 피크 식을 뇌의 luciferase 표현 암 세포와 반응 하 소가 있습니다.
3. (언급 했 듯이 이전) isoflurane 마 취, 종양을 시각화 (BLI) 시스템 이미징 생물 발광에 쥐 이미지. 노출 시간 필요한 (초 분) 종양 크기에 따라 다릅니다.
4. 종양 성장 속도 론을 확인 하는 데 필요한 이미징 절차를 반복 합니다. 동물의 건강 모니터링을 계속 합니다.
   참고: 치료 MSCs constitutively 흔적, 암 세포를 죽이 고 전체 종양의 성장을 억제를 표현할 것 이다. 2-5 일 마다 이미징이 목적을 위해 충분 한 주파수를 제공 합니다.
5. IACUC 프로토콜에서 설명 하는 미리 결정 된 끝점 충족 되었을 때 transcardial 관류 하 여 쥐를 희생 하 고 조직 분석에 대 한 수집 합니다.

U87 종양 세포 표현 mCherry와 반딧불 luciferase (U87 mCh-플로리다) 주입, 이전 및 이미지 기반 절제 및 생물 발광 (그림 2A-C)을 추적 가능 하도록 설계 했다. 줄기 세포 마찬가지로 진단 GFP-Rluc (MSC-GFP) 또는 치료 GFP-재판 (MSC-트레일) 설계 되었고 첨부 파일 및 확산 (그림 2D-F) PLA 건설 기계에 시드.

그림 2: 형광 암 세포와 MSCs의 대표 이미지 PLA에 시드. A-C) 단계, 형광, 및 결합 된 이미지, 각각, 표시 U87 암 세포 표현 mCh-플로리다 마커로 lentiviral 구조 설계. D-F) 줄기 세포의 해당 이미지 GFP Rl을 표현 하도록 설계 또는 치료 GFP-트레일 PLA 계 소재에 시드. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

자가 이미지 아래 종양 절제술에 대 한 수술의 일부를 강조 표시 하 고 이식 (그림 3)를 발판으로 제공 됩니다. 동물 마 취 처음 이며 stereotaxic 악기 (그림 3A)에 정렬. 피부 열리고 두 라를 뒤로 벗 겨. 종양 절제 (그림 3B), 하얀 빛 나타납니다 완전히 제거 될 때 아래. 그러나, (그림 3C) 전에 종양의 형광 이미지 (그림 3D) 절제술 종양의 대부분을 제거 하는 동안 나타냅니다, 후 잔여 금액 남아 있다. 이 현상을 닮았다 임상의 경우를 어떤 점에서 외과 기본 질량 그리고 뇌의 작동 영역으로 신속 하 게 마이그레이션하는 종양 세포를 제거할 수 없습니다. 잔여 종양 foci 향해 철새 치료 MSCs 이동 하는 외과 절제술 다음 남아 있다. 절제술 구멍으로 MSCs를 제공 하는 MSCs는 PLA에 먼저 시드 고 비 계 구조물 절제술 구멍에 배치 됩니다. 발판에 MSCs의 존재 확인 붙일 GFP 신호 (그림 3E) 이미징 여 후 임 플 란 트. 뇌 이미지 비보 전 절제술 구멍 (그림 3 층-H)를 기준으로 비 계 치수를 표시합니다. 발판 때 평면, 상당히 큰 나타나지만 주입 동안 절제 구멍의 모양으로 주조 될 수 있다. 전체 캐비티를 코팅, 거리 치료 MSCs가 종양 foci 도달 마이그레이션할 필요가 최소화 됩니다. 수술 후, 라스는 시간이 지남에 종양 성장을 추적 비 계 전달 MSC 흔적 효능을 결정 하는 데 사용 됩니다.

그림 3: 대표적인 자가 및 수술 후 이미지. 절 개 전에 A) 자가 시리즈 표시 마우스. B) Incised 종양을 공개 하는 두개골 창 마우스 대량. C) 밝은 분야 그리고 종양의 위치를 표시 하는 형광 오버레이 이미지. 남은 종양 foci와 D) 수술 후 절제 캐비티. E) MSC 흔적이 이식 PLA 비 계 시드. F) 사후 비 계 중첩 된 조직 두뇌. G) 형광 오버레이 GFP-트레일 셀 강조. H) G. 스케일 바의 확대 버전 = 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

박사 장, Bagó, 및 Hingtgen 줄기 세포 및 비 계 기술에서 UNC 채 플 언덕의 측면을 허가 했다 누가 팔 콘 치료제에 주식을 있다.