Summary
여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.
Abstract
프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.
Introduction
프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제1. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.
효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제2 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제3의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide4, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판5 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험6을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 단일 잘에서 포함 하는 기판의 단일 특이성 탐지를 사용. 현재 연구에서 이러한 추출 물 포함 여러 프로 테아 제 효소 특이성 조직 추출의 다양 한 조건에서 검사 합니다. 효소 활동은 pH, 코엔자임, prosthetic 그룹, 이온 강도 등 여러 가지 요인에 의해 통제 된다. 최근, proteomics 기반 방법 효소 특이성;을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어, Biniossek 외에서 보고 하는 방법. 7 조 추출 물에도 기질 특이성을 결정 하는 프로테옴을 사용 하 고 여러 아미노산 시퀀스8을 인식 하는 프로 테아의 분열 활동의 정확한 결심을 허용 한다. 그러나,이 메서드는 수많은 샘플의 분석에 적합 하지. 우리의 메서드 여러 샘플의 동시 처리 및 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화의 사용을 사용 하는 반면, 시간의 비행 (TOF MALDI)는 쪼개진의 신속 하 고 쉽게 감지 샘플 분석을 위한 질량 분석에 용이 하 게 기판입니다.
이 종이 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 그들의 이론적 분자 무게, 함께 쪼개진된 기판의 분자 형태는 그림 1 과 표 1에 표시 됩니다. 이전 연구 polyglycine 스페이서 및 biotin9;를 포함 하는 기판 사용 그러나, 이러한 기판 polyglycine 시퀀스 글리신 시퀀스를 인식 하는 효소에 의해 죽 습 있을 수 있습니다 때문에 결함이 있습니다. 또한, avidin 비타민 b 복합체 사이 높은 선호도 낮은 회복 율을 이어질 수 있습니다. 하 우리는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), iminobiotin, 및 분열 사이트 (그림 1)을 식별할 수 있는 아미노산의 구성 되었다 독특한 기질 합성이 연구에서는 이러한 단점에 향상. 유사한 분자 무게의 아미노산 사이 차별, D-떠들고 못 스페이서 사이 쪼개진된 사이트에서 아미노산 추가 되었습니다.
기판의 N 맨끝 원유 샘플에서 친 화력 정화를 가능 하 게 iminobiotin로 분류 됐다. Biotin 대신 iminobiotin의 사용은 매우 중요; biotin은 avidin, avidin에 대 한 iminobiotin의 선호도 pH에 의해 변경 될 수 있습니다 동안 avidin 수 지에서 biotin 표시 된 기판의 낮은 회수율 결과와 강한 선호도 하고있다. Iminobiotin 표시 된 기판 avidin pH 4 아래 조건에서 기판 iminobiotin 표시를 해제 하는 동안 pH 9, 위의 조건에서 avidin에 바인딩합니다. 따라서, iminobiotin는 친 화력 정화10사용 되었다. 요약, 우리는 독특한 기질을 사용 하 여 효소 특이성을 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
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Protocol
동물 실험 프로토콜 일본 제약 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 관심과 일본 제약 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행. 프로토콜 조직 추출 물의 ICR 생쥐에서 파생 된에 대 한 조정 되었습니다. ICR 생쥐 일본 SLC 회사 (일본 시즈오카)에서 구입 했다
1. Iminobiotin 표시 된 기판의 준비
기판 겪 습 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 그룹 (Fmoc)를 사용 하 여 고체 상 합성-11아래 설명 된 대로 아미노산을 보호. 표 2 를 사용 하 여 원하는 아미노산 및 합성의 단계에 따라 사용 Fmoc 화합물 결정.
- N, N-dimethylformamide (DMF) 합성 열에서의 10 mL와 Fmoc-NH-샐 수 지의 0.2 g 맛있게
- DMF에 30 %piperidine 5 mL를 추가 합니다. Fmoc 그룹을 쪼개 10 분 솔루션 바위.
-
체크 trinitrobenzenesulfonic 산 (TNBS) Fmoc 분열 테스트12: 1%의 추가 10 µ L DMF에 diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 m m2 유리 튜브, 다음 전송 작은 양의 수 지는 유리의 10 µ L TNBS 튜브. Fmoc 죽 습 수 지는 오렌지 색상을 개발 해야 합니다.
- 이 결과 부정적인 경우 1.2-1.3 단계를 반복 합니다.
- 워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.
-
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0.3 m m o l의 0.3 m m o l (단계 1에서에서 사용 하는 화합물으로 시작), 표 2에 나열 된 Fmoc 화합물의 0.3 m m o l을 포함 하는 DMF의 5 mL을 추가 Hydroxy 1 H benzotriazole, 토스 (HOBt), 그리고 diisopropylethylamine (DIPEA)의 0.6 m m o l. 30 분 수 지와 함께 몇 가지 솔루션을 바위.
- TNBS 테스트와 함께이 단계를 확인 합니다. 결과가 긍정적인 경우에, 즉, 반응이 충분히 진행 되지 하 고이 단계를 반복 해야 합니다.
- 워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.
- 1.2-1.6, 표 2에 따라 1.5 단계에서 사용한 Fmoc 복합 변경 단계를 반복 하 여 신장 반응을 반복 합니다.
- 2.5% 물의 1 mL을 추가 1 %triisopropylsilane (TIS), 그리고 2.5 %ethanedithiol (EDT)에 trifluoroacetic 산 수 지와 보호 그룹에서 펩 티 드를 쪼개 다. 60 분에 대 한 솔루션을 바위.
- 필터, 및 50 mL 튜브에는 filtrate 수집.
- -20 ° c.에 하룻밤 찬 diethyl 에탄올과 저장소의 40 mL를 추가
- 30 분 동안-20 ° C에서 원심 분리기 4000 x g 펠 릿을 수집 합니다.
- 3 h desiccator를 사용 하 여 diethyl 에테르를 제거.
- 물 50% 이기의 1 mL을 추가 하 고 원유 펩 티 드를 분해. Trifluoroacetic 산을 제거 하는 솔루션 lyophilize 이 단계를 여러 번 반복 합니다.
-
C18 카트리지 열을 사용 하 여 펩 티 드를 정화.
- C18 카트리지 열 이기 (ACN)의 3 mL를 사용 하 여에 수 지를 활성화 합니다.
- 5 %ACN, H2o. 0.1 %TFA 5 mL와 함께 equilibrate
- C18 카트리지 열에 원유 합성 펩 티 드를 로드 합니다.
- 5 %ACN, H2o. 0.1 %TFA 10 mL로 씻어
- 60%의 3 mL과 샘플을 elute ACN, 0.1% TFA H2o.
-
TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 그들의 분자량을 측정 하는 펩 티 드를 확인 합니다.
- Eluent 대상 접시에의 1 µ L 플라스틱 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 즉시 추가
- 공기에서 혼합물을 구체화.
- 악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
- 수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.
- CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).
- 합성 펩 티 드의 질량 스펙트럼을 취득 하 고 이론적인 분자 무게와 비교 하 여 평가 합니다.
2입니다. 조직 추출의 준비
- Anesthetize 남성 ICR 마우스 isoflurane 흡입 챔버에 고 발가락 핀치를 통해 마 취 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사.
- 가 위를 사용 하 여, 칼 과정까지 확장 하는 피부를 통해 복 부 절 개를 중간 확인 합니다.
- 횡 경 막 통해 잘라내어 수집 모든 폐 조직. 조직의 작은 조각으로 잘라.
- 씻어 얼음 50 mM Tris 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 세 번 조직.
- 조직 및 12 x 75 m m2 유리 튜브에 전송 조직의 약 100 밀리 그램 무게.
- 추출 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 7.4, 0.1% 폴 리 (oxyethylene) octylphenyl 에테르를 포함)의 0.3 mL를 추가 합니다.
-
폐 조직 샘플 혼합 균질 화기를 사용 하 여 균질
- 차가운 얼음에 샘플.
- 30에 대 한 20000 rpm에서 샘플을 균질 믹서 기에 s. 샘플은 완전히 동 질 때까지이 단계를 반복 합니다.
참고: 온도 증가 피하기 위해 1 분 이상 계속 하지 균질 할.
- 1.5 mL 튜브 4 ° c.에 10000 x g에 5 분 동안 원심 분리기에는 homogenate의 1000 µ L를 전송
- 새로운 1.5 mL 플라스틱 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.
- 단백질 농도, bicinchoninic 산 (BCA) 같은 메서드 또는 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 메서드를 사용 하 여 결정 하는 샘플의 10 µ L을 사용 합니다.
- 동결을 방지 하기 위해 50% 글리세롤의 최종 농도 대 한 샘플을 80% 글리세롤을 추가 합니다.
- 추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
3. 기판 모델 효소와 조직 추출에서의 소화
-
N-토실기-L-페닐알라닌 chloromethyl 케 톤 (TPCK)의 0.1 µ g / µ L의 10 µ L 추가-트립 신, 황색 포도 상 구 균 V8 protease의 µ 0.1 µ g/L 또는 소화 버퍼의 890 µ L에 조직 추출의 µ 10 µ g/L.
- PH에 따라 효소 특이성에 차이 명확 하 게, 3, 5, 7, 및 9의 pH를 조정 하는 버퍼를 사용 합니다. 소화 버퍼의 구성 표 3에 표시 됩니다.
- 조직 추출 물, 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 외피에 의해 준비에 비활성 효소를 사용 하 여 부정적인 제어를 실시 합니다.
- Iminobiotin 표시 된 기판의 10 µ L 추가 (디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 최종 농도에 녹아 = 100 pmol/10 µ L).
- Iminobiotin 표시 된 기판 소화 37 ° C에서 3 시간 동안 품 어.
- 부 화, 후 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 기판의 소화를 중지 합니다.
- 10000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 소화 기판 원심
- 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.
4. Iminobiotin 표시 된 기판의 정화
-
1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르에 50% streptavidin sepharose 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
- PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 9 주위에 솔루션을. 솔루션의 산도 낮은 경우에, 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르를 추가 하 여 약 pH 9 조정 합니다. 이 단계는 streptavidin는 iminobiotin 표시 된 기판의 바인딩을 포함 하기 때문에 중요 한.
- streptavidin iminobiotin 표시 된 기판 바인딩할 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 밤새 품 어. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.
- 4 ° c.에 10000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기 제거는 상쾌한.
-
다음과 같이 구슬 5 번 세척.
- 구슬에 워시 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 9)의 1000 µ L를 추가 합니다.
- 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 세척. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.
- 4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
-
구슬에 0.2 %trifluoroacetic 산의 100 µ L를 추가 합니다.
- PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 2 아래 솔루션을. 솔루션의 산도 높은 경우에, 1 %trifluoroacetic 산을 추가 하 여 2 아래에 pH를 조정 합니다.
- 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- 4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 다음 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.
5. 샘플 준비와 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (TOF MALDI 질량 분석)
참고: 다음 단계에서 모든 솔루션은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)으로 준비 되어야 한다-학년 또는 아미노산 시퀀싱 급 물.
- 그것을 활성화 C18 수 지에 이기의 500 µ L 플라스틱 사용된 이기를 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.
- 0.1 %trifluoroacetic 산의 100 µ L와 C18 수 지 equilibrate Eluent는 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.
- 샘플을 로드 하는 피 펫을 사용 하 여 수 지에 샘플을 바인딩하십시오.
- 0.1 %trifluoroacetic 산의 20 µ L로 수 지를 세척. 5 번이이 단계를 반복 합니다.
- 샘플의 0.1 %trifluoroacetic 산에서 60% 이기 3 µ L elute TOF MALDI 질량 분석에 대 한 대상 접시에 eluent 플라스틱 즉시 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 추가 합니다.
- 공기에서 혼합물을 구체화.
-
악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
- 수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.
- CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).
- 샘플, biotin 표시 된 기판의 쪼개진된 형태에 대 한 900 다 700에서 질량 스펙트럼에 세심 한 관심 지불의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
- 표 1을 사용 하 여 검색 된 봉우리를 식별 합니다. 적절 한 분자량의 검출 관련 아미노산의 C-말단에 분열을 나타냅니다.
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Representative Results
모델 프로 테아 제에 의해 효소 특이성의 식별에 대 한 방법의 평가
이 시스템의 효율성은 TPCK-트립 신 및 V8 효소의 기질 특이성 가져온 사용 하 여 평가 되었습니다. TPCK-트립 신 및 V8 효소 아미노산 시퀀스 리 신과 아르기닌 잔류물의 C-터미널 및 aspartic 산 및 글루탐산 잔류물의 카 쪽에서 각각 쪼개 위하여 견적 되었다. 표 1 및 특정 프로 테아 제에 의해 죽 습 조각 소화 기판의 이론적 분자 무게를 보여 줍니다. TPCK-트립 신을 사용 하 여 기판 소화 쪼개진된 조각, 두 번째는 839.81 다 796.76 다 (그림 2A)에서 검출 될 수 생산. 이 파편의 분자 무게는 리 신과 아르기닌의 C-터미널에서 각각 죽 습 파편의 이론적 분자 무게에 맞춰 밀접 하 게 했다. 또한, V8 protease 769.78 다 755.62 다 (그림 2B), 글루타민 산, aspartic 산 성의 이론적인 m/z를 각각 일치의 분자 무게를 가진 그들의 쪼개진된 형태 전조 기판 변환. 이 결과이 방법은 성공적으로 MALDI TOF 질량 분석으로 효소 특이성을 식별 하기 위해 사용 될 수를 나타냅니다.
마우스 폐를 사용 하 여 다른 pH 수준 기질 특이성의 평가 추출
이 기술의 이점 중 하나는 샘플의 많은 동시에 처리 될 수 있다 이었다. 이 연구는 그 기질 특이성 변경 pH 수준 (그림 3)에 따라 증명. (그림 3B, pH 5) 산 성 조건에서 쪼개진 조각의 분자량 되었고 770.13 Da 826.66 다. 이러한 결과 폐 조직 추출 글루탐산, 트립토판의 C-말단에 쪼개 다 수와 프로 테아 제 포함 된 표시. PH 수준을 점차적으로 증가, 글루탐산으로 죽 습 조각과 트립토판 점차적으로 감소, 아르기닌 및 라이 신에 의해 점차적으로 죽 습 조각의 봉우리 증가 하는 반면 (그림 3C, D, pH 7, 9)의 봉우리로. 이러한 결과 폐 추출 포함 다른 최적의 pH와 분열 특이성을 가진 두 개 이상의 프로 테아 표시.
그림 1: 효소 특이성의 검출에 대 한 스키마. (A) 효소의 특이성에 대 한 iminobiotin 표시 된 기판의 구조. (B)는 기판 했다 iminobiotin, 폴 리 에틸렌 글리콜 스페이서, 쪼갤 아미노산 사이트. (C) iminobiotin 표시 된 기판의 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 정제 효소를 사용 하 여 효소 특이성을 결정 하는 방법의 평가. (A) iminobiotin 표시 된 기판에 대 한 스펙트럼 TPCK-트립 신으로 처리. 839.81 및 796.76 봉우리 조각 리 신과 아르기닌의 C-터미널 측에 분열에 의해 생성 된 각각의 이론적 분자량 일치 합니다. (B) iminobiotin 표시 된 기판에 대 한 스펙트럼 V8 효소 처리. 769.78 및 755.62 봉우리 조각 글루탐산, aspartic 산 성의 C-터미널 측에 분열에 의해 생성 된 각각의 이론적 분자량 일치 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 결정 조직을 사용 하 여 효소 특이성을 추출 하는 방법의 평가. 폐 조직으로 취급 하는 iminobiotin 표시 된 기판에 대 한 스펙트럼을 추출. 이러한 스펙트럼 봉우리 (A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7, 및 (D) pH 9에서 보여줍니다. (E) iminobiotin 표시 된 기판 일반적인 소화를 평가 하기 위해 열 처리로 비활성화 조직 추출 물과 인 큐베이 팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| X | 선구자 | 쪼개진된 형태 |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| 난 * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa 양식 | ||
표 1: iminobiotin 표시 된 기질 그리고 효소 조각의 예상된 분자량의 이론적인 분자량. 별표 (*)는 폴 리 에틸렌 스페이서와 쪼갤 아미노산 사이 D 떠들고의 추가 나타냅니다.
| Xaa: Gly, Ala, Ser, 프로, 발, 목, 레이, Asp, Gln, Glu, 그의 페, Arg Tyr | |||
| 단계 | Fmoc 화합물 | ||
| 1 | Fmoc-미니-PEG3-오 | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-오 | ||
| 3 | Fmoc-미니-PEG3-오 | ||
| 4 | Fmoc-미니-PEG3-오 | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys, Ile, Asn, 리스, 만난, Trp | |||
| 단계 | Fmoc 화합물 | ||
| 1 | Fmoc-미니-PEG3-오 | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-오 | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-오 | ||
| 4 | Fmoc-미니-PEG3-오 | ||
| 5 | Fmoc-미니-PEG3-오 | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
표 2: 기판 합성에 사용 된 시 약의 순차 목록입니다.
| pH | 구성 | ||
| 9 | 50mm Tricine 0.1 M NaCl을 포함 하 고 10 m m CaCl2 | ||
| 7 | 50 mM Tris HCl 0.1 M NaCl을 포함 하 고 10 m m CaCl2 | ||
| 5 | 50 mM 아세트산 나트륨 0.1 M NaCl 및 10mm CaCl2 | ||
| 3 | 50 m m 구 연산 산 0.1 M NaCl 및 10mm CaCl2 | ||
표 3: 사용 되는 버퍼 솔루션의 작곡.
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Discussion
이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.
avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비타민 b 복합체에의 바인딩 거의 되돌릴 수 하지 않습니다. ABCs에 대 한 친 화력 정화 따라서 매우 효율적입니다. 이러한 이유로, 우리 보고 biotin 표시 된 기판에 대 한 회복 율 낮을 것으로 예상 된다. 이 연구에서 우리만 사용 낮은 pH 수준 차입; 그러나, deglycosylated avidin-수 지13 또는 단위체 avidin-수 지14 도 사용할 수 있습니다 biotin 표시 기판 정화.
이 연구에서 제안 된 방법은 다른 실험 시스템 및 응용 프로그램; 조정 될 수 있다 베어링 염두에 두고 MALDI TOF 질량 분석기는 정량 분석을 수행할 수 없습니다. 기질 특이성을 결정 하는 일단 정량화 spectrometric 분석 실험, fluorometric 분석 실험, 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워)를 사용 하 여 수행 하는 더 나은 수 있습니다.
질량 분석의 교정은이 프로토콜의 가장 중요 한 단계입니다. 유사한 분자 무게를 가진 기판은 감지 하는 경우에 결과의 정확도 선구자의 분자량을 추가 하 여 향상 시킬 수 있습니다.
효소 반응 시간 향상 때문 효소를 감지할 수 없습니다 경우 반응 시간을 연장 가능 하다. 그러나, 이상의 24 시간 동안 계속 반응 시키는 원치 않는 봉우리를 생성 하는 측 반응 결과. 따라서, 그것은 최대 18 h에 대 한 반응을 수행 하는 것이 좋습니다 또는 샘플 처리 열을 사용 하 여 테스트를 제어 하. 이 절차는 trypsin의 몇 가지 femtomol 내에 효소 특이성을 결정할 수 있었다.
끝으로, iminobiotin 표시 된 기판 특이성 효소를 사용 하 여 하는 간편한 방법을 소개 합니다. 이 방법은 여러 개의 샘플 동시 처리 가능 하며 효소 검사를 단순화 하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 일본 제약 대학 (2016)과 문 부 과학성 KAKENHI 보조금 번호 JP17854179에서 일본 제약 대학 연구 보조금에 의해 부분에서 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
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