Summary
Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen verwendet die Maus Levator Auris Longus (LAL) Muskeln, um spontan aufnehmen und Nerv-evozierten postsynaptischen Potenziale (Strom-Klemme) und Ströme (Voltage-Clamp) an der neuromuskulären Synapse. Diese Technik können wichtige Einblicke in die Mechanismen der synaptischen Übertragung unter normalen und Krankheit darstellen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Aufzeichnung synaptische Übertragung aus der neuromuskulären Synapse unter Strom-Klemme und Spannung-Klemme. Eine ex-Vivo -Vorbereitung des Levator Auris Longus (LAL) wird verwendet, weil es eine dünne Muskel ist, der einfache Visualisierung von der neuromuskulären Synapse Mikroelektrode Impalement an der motorischen Endplatte vorsieht. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung von spontanen Miniatur Endplatte Potentiale und Ströme (mEPPs und mEPCs), Endplatte Nerv-evozierten Potentiale und Ströme (EPPs und EPCs), sowie die Eigenschaften der Membran der motorischen Endplatte. Ergebnisse, die von dieser Methode auch die Quanten Inhalte (QC), Anzahl der Vesikel freisetzungsstandorten (n), Wahrscheinlichkeit des vesikels Release (pRel), synaptische Erleichterung und Depression sowie Muskel-Membran-Zeitkonstante (τ m) und Eingangswiderstand. Anwendung dieser Technik zu Mausmodellen menschlicher Erkrankungen kann wichtige Pathologien bei Krankheitszuständen markieren und identifizieren neue Behandlungsstrategien. Klemmend voll Spannung-eine einzige Synapse, stellt diese Methode eine der ausführlichsten Analysen der synaptischen Übertragung derzeit verfügbar.
Introduction
Studium der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse bietet Einblicke in die dynamische Beziehung zwischen dem Nerven- und Skelett-Muskelsystem und ist ein hervorragendes Modell für die Prüfung von synaptischen Physiologie. Die Levator Auris Longus (LAL) ist eine dünne Muskel, so dass für die neuromuskulären Verbindungen leicht visualisiert werden. Frühere Berichten haben die Bequemlichkeit der Nutzung der LAL, synaptische Drogen und Giftstoffe zu untersuchen und charakterisiert die skelettartigen Muskel Faser Art Eigenschaften des LAL1,2beschrieben. Zahlreiche Studien haben die LAL verwendet, um neuromuskuläre Physiologie3,4,5,6,7,8zu untersuchen. Für Elektrophysiologie die Fähigkeit, LAL neuromuskuläre Kreuzungen leicht beobachten ermöglicht die genaue Platzierung von Mikroelektroden an der motorischen Endplatte und Klemme Platzprobleme in der synaptischen Übertragung Aufnahme reduziert. Strom-Clamp Aufnahmen der Muskel Membran Eigenschaften, wie die Membran Zeitkonstante (τm) und Eingangswiderstand (Rin) werden leicht erreicht. Darüber hinaus können diese Eigenschaften von den gleichen Muskelfasern zur Aufzeichnung der neuromuskulären Übertragung, so dass ein direkter Vergleich der synaptischen Funktion an den Muskel-Membran-Eigenschaften verwendet gemessen werden. Analyse dieser Daten liefern wichtige Erkenntnisse über die physikalischen Mechanismen der vielen neuromuskulären Erkrankungen und Zustände der veränderte Aktivität.
Ein wichtiger Aspekt der hier beschriebenen Technik ist die Verwendung der Spannung-Klemme für synaptische Aufnahmen, die nicht unterliegen die Nichtlinearitäten im Strom-Clamp begegnet und sind unabhängig von der Muskel-Membran-Eigenschaften. Vorteile der Verwendung von Voltage-Clamp im Gegensatz zu Strom-Clamp, um neuromuskulären Übertragung zu untersuchen wurden von bahnbrechenden Bemühungen in den 1950er Jahren9eingerichtet. Unter Strom-Clamp sind EPPs, die 10-15 mV Amplitude überschreiten keine lineare Produkt der Nahostfriedensprozess Amplitude9. Zum Beispiel, wenn die durchschnittliche Nahostfriedensprozess 1 mV, einem EVP von 5 mV kann davon ausgegangen werden, das Produkt von 5 mEPPs (QC 5); in der Erwägung, eine EVP von 40 mV wird das Produkt von mehr als 40 mEPPs sein. Diese nicht-Linearität bei größeren EPPs tritt auf, weil die treibende Kraft für die EVP, was ist der Unterschied zwischen der Membran und Gleichgewicht-Potenzial für den Acetylcholin-Rezeptor (~-10 mV), erheblich sinkt, während große EPPs. Dieses Problem wird in Voltage-Clamp-Experimenten vermieden, weil der Muskel Membran Potenzial während Voltage-Clamp-Experimenten nicht ändert. Ein Nachteil ist, dass Spannung-Clamp Experimente sind technisch schwieriger als Strom-Clamp Aufnahme. Mit diesem im Verstand entwickelt McLachlan und Martin eine einfache mathematische Korrektur, die Nichtlinearitäten im Strom-Clamp Aufnahmen von EPPs10ausmacht. Die Korrekturen funktionieren gut11,12,13, aber wichtiger ist, davon ausgehen, dass die Muskel-Membran-Eigenschaften wurden nicht gestört.
Die Muskel-Membran-Eigenschaften sind besonders wichtig zu prüfen, ob Studium der Bedingungen oder Krankheitszuständen, die den Muskel zu stören. Skelettartiger Muskel aus dem R6/2 transgenen Modell der Huntington-Krankheit ist beispielsweise übererregbar durch eine schrittweise Verringerung der ruhenden Chlorid und Kalium Ströme14,15. Infolgedessen sind mEPPs und EPPs in der Skelettmuskulatur R6/2 verstärkt. Natürlich können zusätzliche Faktoren mEPPs und EPPs ändern. Arbeiten Sie mit einem anderen Modell von Chorea Huntington Mäusen (R6/1) Änderungen in EPPs, die im Zusammenhang mit SNARE-Proteine8schien gefunden. Um die Mechanismen, die veränderten neuromuskulären Übertragung zu beurteilen, wäre es vorteilhaft, die Auswirkungen der veränderten Muskel Membran Eigenschaften mithilfe einer Spannung-Klemme zu beseitigen. In einer aktuellen Studie wurde die R6/2 neuromuskuläre Übertragung Bedingungen sowohl Strom und Spannung-Klemme mit der beschriebenen Technik hierin untersucht. Die Gesamtheit der motorischen endplatten wurden Spannung eingespannten mit weniger als 1 % Fehler, indem man zwei Mikroelektroden in die Konstante Länge der Endplatte16. Es zeigte sich, dass Spannung-Klemme und Strom-Clamp Aufzeichnungen ergab kontrastierende Messungen der neuromuskulären Übertragung in R6/2 Muskel korrigiert. Dies macht deutlich, dass es schwierig sein kann, EPPs Nichtlinearitäten zu korrigieren, wenn der Muskel-Membran-Eigenschaften geändert wurden und zeigt die Vorteile der Voltage-Clamp-Datensätze, die unabhängig von der Muskel-Membran-Eigenschaften sind zu erhalten. Das Protokoll enthaltenen eignet sich für die Prüfung von Bedingungen oder Krankheitszustände, die synaptische Übertragung und der postsynaptischen Membran Eigenschaften beeinflussen.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden gemäß den Animal Care und Nutzung Ausschuss der Wright State University durchgeführt.
1. Maus Euthanasie
- Platzieren Sie in einer Dampfhaube den Mauszeiger in einem luftdichten Glas betäuben Kammer.
- Setzen Sie die Maus über Inhalation, eine tödliche Dosis von Isofluran (Sättigung, oder ~ 25 %). Lassen Sie die Maus in der Kammer, bis keine Atmung beobachtet werden kann.
- Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und führen Sie eine zervikale Dislokation als sekundäre Methode der Euthanasie.
2. Entfernung der Haare von der dorsalen Oberfläche von Kopf, Hals und Rücken
- Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um die Mehrheit der Haare auf der dorsalen Oberfläche des Kopfes, Halses, und Rückseite der Maus entfernen. Entfernen Sie auch die Haare rund um und auf dem linken Ohr.
Hinweis: Achten Sie darauf, beim Rasieren der Haut um die Ohren, Haut kann in die klingen des Rasierers erwischt und zugrunde liegende Muskelgewebe beschädigt werden könnte. - Gelten Sie Haarentfernungs-Creme mit einem Wattestäbchen für den rasierten Bereich um die verbleibenden Haare zu entfernen. Warten Sie ca. 1 min und spülen Sie die Haarentfernung Creme mit Wasser unter Verwendung einer Waschflasche Squeeze dann Bürsten Sie entfernt alle restlichen Creme oder Haare mit einem Wattestäbchen und tupfen Sie die Haut trocken.
3. entfernen Sie die Haut um den Levator Auris Longus Muskel aussetzen
- Machen Sie unter einem Stereomikroskop sezierenden einen kleinen Schnitt (nur tief genug in die Haut eindringen) auf der Rückseite der Maus auf der Ebene der das Schulterblatt. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere Mikro Dissektion, folgt man dem Weg, dargestellt in Abbildung 1A-B.
- Mit feinen Pinzette (z. B. Nr. 5), ziehen Sie die Haut entlang der Schnitt in der Nähe der Scapulae. Mit Feder Schere, Schnitt das Bindegewebe, die Haut von der zugrunde liegenden Muskelgewebe zu trennen, beim Anflug auf des Ohrs. Schneiden Sie wichtig ist, das Bindegewebe mit den klingen wies in der Haut, um versehentliche Schneiden von exponierten Muskelgewebe zu vermeiden.
- In regelmäßigen Abständen durchspülen den freigelegten Muskel mit physiologischer Kochsalzlösung, z. B. der folgenden externen Na+ -Puffer, der besteht aus (in mM): 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0,6 MgCl2, 5 Glukose, 1 NaH2PO4, pH 7.4 mit NaOH und hat eine Osmolalität von 300 ± 5 Mmol/kg. Sobald das Bindegewebe um das linke Ohr geschnitten worden ist, schneiden Sie die Haut um das Ohr, die Haut vollständig von der Maus entfernen und entsorgen Sie es.
Hinweis: Die LAL legt auf der Basis des Ohres und kann leicht beschädigt werden, während die Haut entfernen. Es ist gut, ca. 1 mm der Haut rund um die Basis des Ohres zu vermeiden, schneiden die LAL verlassen.
4. Entfernung der Levator Auris Longus Muskel und das umliegende Gewebe
- Starten Sie mithilfe Feder Schere durch Schneiden-Muskeln, die sind schlechter als die LAL, die an der Wirbelsäule zwischen die Schulterblätter zu verbinden. Die rechten Schulterblatt, rechts von der Mittellinie ab und schneiden in Richtung rostral Ende der Maus, während die übrigen auf der rechten Seite der Mittellinie. Weiterhin schneiden ganz durch bis zum Ende des Muskelgewebes auf den Schädel.
Hinweis: Die LAL ist der oberflächlichsten Muskel an der medialen Seite des Ohrs und der Mittellinie angeschlossen, wie in Abbildung 2dargestellt. Für weitere Bilder zeigt ein Buch von E.C. Greene17 ausgezeichnet, handgezeichnete Bilder der LAL. - Verwenden Sie Zange zu greifen die geschnittenen Gewebe sofort nach rechts von der Mittellinie, dann heben Sie und beginnen, schneiden das Gewebe auf dem linken Ohr mit den Klingen der Schere gegen die Schädeldecke gedrückt, um mehrere Schichten des Muskels zu entfernen, die die linke LAL unterlegen sind. Lassen Sie alle Ebenen vorübergehend angebracht, um zu vermeiden, versehentlich schneiden die LAL beim Entfernen.
- Schneiden mit Messern parallel zu und drückte gegen den Schädel zu vermeiden, schneiden die Nerven, die die LAL die umfließt den Gehörgang innerviert, und betritt die Muskeln auf der medialen Seite des Ohres. Weiter Schnitt durch den Gehörgang, so viel des Nervus befestigt wie möglich zu halten.
Hinweis: Der Nerv, der die LAL liefert Zweige aus der Nervus facialis und sollte beibehalten werden, wie es später in der Prozedur verwendet wird. - Schneiden Sie das Fettgewebe, das direkt hinter dem Gehörgang auf dem gleichen Weg, dargestellt in Abbildung 1 b auf den ventrolateralen Teil des Ohres. Auch, schneiden Sie entlang des linken Schulterblattes, wie auf der rechten Seite den Muskel vollständig von der Maus zu entfernen.
5. Levator Auris Longus Muskel isoliert
- Legen Sie die LAL und umgebende Gewebe in einen Behälter. Verwenden Sie einen Behälter, in dem das sezierte Gewebe nach unten, wie eine Petrischale mit einem Silikon-Elastomer-unten angeheftet werden kann. Baden Sie und waschen Sie das Gewebe häufig in physiologischer Kochsalzlösung.
- Schneiden Sie die Ohrmuschel des Ohres entlang der Basis des Ohres, den knorpeligen Teil des Ohrs befestigt, die LAL verlassen. Drehen Sie den Muskel, so dass die minderwertigere Seite oben (LAL auf der Unterseite des Tellers) zeigt.
- Legen Sie eine Pin, wie ein Insekt Stift durch den Gehörgang, die Prep in Position zu halten. Dann mit Hilfe der kleineren Pins Pin das restliche Gewebe auf der gegenüberliegenden Seite der Mittellinie der Lal. Mit Pinzette, ziehen Sie die Haut auf den seitlichen Teil des Ohres, den Muskel ausstrecken und einer Nadel durch die Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gewebe gut gesichert in die Schale ist, wie in Abbildung 3dargestellt.
Hinweis: Kleine Dissektion Stifte können erfolgen, indem die Spitzen der Akupunkturnadeln auf die gewünschte Länge schneiden. Diese kleine Stifte minimieren Schädigung des Gewebes und können mit Eintauchen in Wasser Mikroskop Ziele mit lange Arbeitsabstände verwendet werden. - Beginnen die Muskeln (siehe Abbildung 4) entfernen, decken, die LAL (Auricularis superior, Entführer Auris Longus und Interscutularis), und diejenigen verpflichtet, die LAL über Bindegewebe und sind besonders dicht in der Nähe der Mittellinie, mit Zange und Feder Schere Nr. 5.
- Mit der Pinzette nach oben ziehen, auf die darüber liegende Muskelschicht, schneiden das Bindegewebe mit den klingen orientiert die Muskelschicht gezogen und achten Sie darauf, schneiden oder nicking der LAL. In Richtung der Mittellinie schneiden und schneiden etwa drei Viertel des Weges an der Mittellinie zu stoppen. Dann schneiden Sie parallel zur Mittellinie, jeder Muskelschicht zu entfernen. Entfernen Sie halten Sie Muskelschichten bis nur die LAL bleibt.
- Entfernen Sie einige der verbleibenden Bindegewebe, das die LAL, deckt die aids in Impalement der Elektroden. Verwenden Sie sanft Nr. 5 Zange, um das Bindegewebe von der LAL ziehen und schneiden Sie es mit Feder Schere. Entfernen Sie nur Gewebe, das so leicht ohne Gefahr der Beschädigung der LAL im Prozess erfolgen kann. Entfernen Sie alle großen Nerven, die innervieren die minderwertigen Muskelschichten an der minderwertigen Oberfläche von LAL, die die Visualisierung der neuromuskulären Kreuzungen behindern kann.
6. Isolierung der Nerven
- Der Nerv, der die LAL mit einem Nervenstimulator innerviert zu identifizieren (z. B. zwei platindrähte verbunden mit einem Impulsgenerator); Es werden mehrere Nerven laufen aus dem Gehörgang zu den Muskeln. Tippen Sie auf die Nerven mit der Nervenstimulator liefert einige aktuelle (Strom variieren etwa 5 V). Wenn der Muskel kontrahiert, wurde der richtigen Nerv festgestellt.
- Vorsichtig greifen Sie das Gewebe in der Nähe der Nerven und verwenden Sie Feder Schere, um den Nerv aus dem Gewebe rund um das Ohr zu trennen. Um Schäden zu minimieren, halten Sie die meisten der Nerv eingebettet in einigen umliegenden Gewebe, die später verwendet wird, um den Nerv zu den Aufnahme-Gericht zu sichern.
Hinweis: Der motorische Nerv, der die LAL innerviert befindet sich auf der medialen Seite des Gehörgangs öffnen. - Wenn eine bipolare Elektrode anregende verwenden, entfernen Sie das umgebende Gewebe nur um eine Region des Nervs, distal vom Muskel. Bei Verwendung eine Saug-Elektrode entfernen Sie umgebende Gewebe auf das abgeschnittene Ende des Nervs.
Hinweis: Dies ist ein guter Zwischenstopp. Dies ist ein guter Zwischenstopp. Wenn eine Pause ist die sezierte LAL Prep pflegbaren benötigt in einer physiologischen Lösung oder Konstante Durchblutung für ein paar Stunden, um sicherzustellen, dass schädliche Stoffwechselprodukte nicht ansammeln. Verwenden Sie eine große Menge der Lösung oder Konstante Perfusion um zu gewährleisten, dass schädliche Stoffwechselprodukte nicht ansammeln. - Als nächstes lösen und den Muskel zu einer Perfusion Kammer für Elektrophysiologie Experimente unter einem aufrechten Mikroskop Verbindung zu übertragen.
Hinweis: Verwendung einer Perfusion Kammer mit einem weichen Boden, den das Gewebe sicher werden kann, fixiert (Abb. 5A). - Heften Sie den Muskel, an den Enden (Ohr und Mittellinie) und entlang der Kante des Muskels. Positionieren Sie den Nerv senkrecht auf die Muskelfasern und Heften Sie es auf den Boden der Schale durch einige überschüssige Gewebe, das am Ende des Nervs intakt war. Halten Sie das Gewebe, die zu allen Zeiten in physiologischer Kochsalzlösung getaucht.
Hinweis: Es ist auch hilfreich, haben abgerundete, erhöhten Material direkt unter den LAL Muskelfasern. Diese zusätzliche Unterstützung hilft bei der Elektrode Impalement und von einem kleinen Teil der Silikon-Elastomer, gegossen in einem 50 mL konische Rohr liegend erfolgen kann. Die abgerundeten Abschnitt des Elastomers kann an der Unterseite der Perfusion Kammer mit einem kleinen Betrag von frischem Silikon gesichert werden. Ein Diagramm der Perfusion Kammer ist in Abbildung 5 b-Cgezeigt. Die Muskelfasern können neu Besetzung Silikon-Elastomer (was sehr hydrophob) sehr dicht halten und beschädigt werden kann. Es ist hilfreich, Mantel oder Block neu Silikon mit Protein, ähnlich wie die blockierende Schritt in ein Immunoblot gegossen. Um es zu blockieren, haben wir neu Besetzung Silikon in eine konzentrierte Lösung von bovine Serum Albumin über Nacht inkubiert.
(7) Elektrophysiologie Geräte Setup
- Bereiten Sie vor oder tauen Sie Aliquote eines Farbstoffes zur Unterstützung bei der Visualisierung der neuromuskulären Synapse, wie die mitochondriale Farbstoff 4-(4-diethylaminostyryl)-1-Methylpyridinium18, die ist lichtempfindlich und sollte lichtgeschützt gelagert werden auf. Auch tauen Sie Elektrode Lösungen auf. Vortex alle Aliquote um sicherzustellen, dass alle gelösten Stoffen in Lösung. Bereiten Sie eine physiologische Kochsalzlösung enthält 1 µM µ-vor GIIIB (µ-CTX) und 80 µM BTS (optional).
- Sichern Sie die Perfusion Kammer mit LAL, Mikroskoptisch. Legen Sie die Bezugselektrode in eine Tasse gefüllt mit 3 M KCl, die mit der Aufnahme Kammer über eine Agar-Brücke verbunden ist. Verbinden Sie die Bezugselektrode an den Verstärker pro Anweisungen des Herstellers.
- An dieser Stelle positionieren Sie die Nerv-Stimulation Elektrode auf den Nerv. Verwenden Sie eine Saug-Elektrode oder eine kleine bipolare Elektrode, wie sie gut für Nervenstimulation funktionieren.
- Positionieren Sie die anregende Elektrode so weit von den Muskel wie möglich, die Anzahl der Stimulation Artefakte in den Aufnahmen zu minimieren.
Hinweis: Die anregende Elektrode sollte mit einem Reiz Isolation Gerät gesteuert werden, die die Spannungsamplitude nach Bedarf steuern können.
- Positionieren Sie die anregende Elektrode so weit von den Muskel wie möglich, die Anzahl der Stimulation Artefakte in den Aufnahmen zu minimieren.
- Heben Sie langsam die Spannung mit dem Drehknopf Spannung auf dem Reiz Isolation Gerät bis Kontraktionen beobachtet werden. Der Punkt, an dem die Kontraktion zuerst beobachtet wurde, ist die Schwelle. Nachdem die Schwelle identifiziert wurde, stellen Sie die Spannung auf dem Reiz Isolation Gerät bei 1,5 * Schwelle (oder entsprechend den Festlegungen des Experiments).
Hinweis: Bild 6 zeigt die Muskeln Prep einrichten unter einem aufrechten Mikroskop und die kleinen bipolare Elektrode auf den Nerv mit einem Kugelgelenk Manipulator positioniert. Fördernd ist es, die niedrigste Spannung zur Stimulation möglich und trotzdem ausreichend über Grenzwert haben. Eine Niederspannung Impuls reduziert die Anzahl der Stimulation Artefakte bei Aufnahmen. Außerdem wird platzieren die anregende Elektrode von der Muskel Stimulation Artefakt verkleinern. Manchmal wird am Ende des Nervs aus der Dissektion beschädigt werden, so dass es möglicherweise notwendig, experimentieren Sie mit dem entlang des Nervs der Stimulator platziert werden soll. - Entfernen Sie die Salzlösung Baden zu und ersetzen Sie durch 5 µM 4-Di-2-Asp. Setzen Sie die LAL-Vorbereitung auf die 4-Di-2-Asp für 10 min, angemessene Fluoreszenz zur neuromuskulären Visualisierung (Abbildung 7) zu erreichen.
- Bereiten Sie zwei Elektroden Lösungen, 3 M KCl und ein K+ interne Lösung (in mM) bestehend aus 75 Aspartat-, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP binatrium, 5 Phosphokreatin binatrium, 5 Glutathion, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7,2 mit KOH.
Hinweis: Die Lösungen sollten im Voraus vorbereitet werden; die K+ interne Lösung kann in Aliquote bei-20 ° c gelagert werden - Füllung der Kapillare für die Spannung-sensing Elektrode mit 3 M KCl. gezogenem Glas verwenden K+ interne Lösung (vorbereitet in Schritt 7,6) für die Strom-Passing-Elektrode; benutzen Sie eine schmale nichtmetallische Nadel (~ 34 Gauge) eine 1 mL Spritze, leicht die Glaskapillaren aufzufüllen. Klopfen Sie leicht die Kapillaren um Luftblasen zu entfernen; Stellen Sie sicher, dass jede gefüllte Elektrode einen Widerstand von 10-15 MΩ hat.
Hinweis: Überprüfen Sie und notieren Sie den Widerstand der beiden Elektroden mit der Datenerfassungs-Software. - Tauschen Sie nach 10 min die 4-Di-Asp-Lösung mit der normalen Ca2 + Lösung.
8. Kennzeichnung der neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenz
- Mit einem aufrechten Mikroskop mit standard Hellfeld und Fluoreszenz Beleuchtung, suchen Sie nach einer hellen Band fluoreszierend grün neuromuskuläre Kreuzungen senkrecht zu den Muskelfasern entlang der Prep wie in Abbildung 7Agezeigt. Verwenden Sie ein schwacher Vergrößerung Eintauchen in Wasser Ziel (~ 10 X), neuromuskuläre Kreuzungen zu identifizieren
Hinweis: Sollte das Mikroskop mit einem FITC-Würfel ausgestattet (Ex: 480/40, dichroitischen: 505LP, Em: 535/50), und eine LED, Laser, Halogen-Lampe oder Quecksilber-Lampe für Fluoreszenz. Foto Bleichen, wechseln Sie zwischen Hellfeld und Fluoreszenz Beleuchtung zu minimieren.
Hinweis: Diese Band ist in der Regel mehr proximalen auf der Basis des Ohres als an der Mittellinie. Die Band ist die Region, wo die neuromuskulären Kreuzungen konzentriertesten. - Wechseln Sie zu einer höheren Vergrößerung Eintauchen in Wasser Objektiv (~ 40 X) und identifizieren Sie eine neuromuskuläre Synapse auf die oberste Schicht des Muskels mit Elektrophysiologie (Abb. 7 b) zu prüfen.
- Sichern Sie die gefüllten Pipetten in die Pipette Halterungen auf die entsprechende Headstages gemäß Herstellerangaben. Verwenden Sie Mikromanipulatoren, positionieren Sie die Elektroden oberhalb der Muskel Membran innerhalb von 100 µm die identifizierten neuromuskuläre Synapse (Abbildung 7). Positionieren Sie die Elektroden verwenden in erster Linie Hellfeld Mikroskopie; Verwenden Sie Fluoreszenz, um die Lage der Elektroden im Vergleich zu der neuromuskulären Synapse zu bestätigen.
- Verwenden Sie zuerst ein geringer Vergrößerung (~ 10 X) Ziel zu lokalisieren die Elektroden und wechseln Sie dann in eine höhere Vergrößerung (~ 40 X)-Ziel für die endgültige Positionierung der Elektroden. Aufspießen der Elektroden in den Muskel an dieser Stelle nicht, erstens Stimmen die Elektroden.
9. tuning und aufspießen der Elektroden
- Sobald die Elektroden über die gewünschte Faser positioniert sind, NULL und einstellen die Spannung-sensing Elektrode durch Brücke balancieren (oder eine analoge Ansatz) und neutralisieren die Elektrode Kapazität pro den Anweisungen des Herstellers. Auch, NULL-Strom-Passing-Elektrode.
- Bringen Sie beide Elektroden auf die Oberfläche der Faser. Langsam passen Sie die Position der Elektroden auf dem Weg hinunter die Faser so dass die Elektroden in Bezug auf die neuromuskuläre Synapse ausgerichtet bleiben, wie in 8.3 und 8.4 beschrieben.
- Nachdem beide Elektroden die Oberfläche der Muskelfaser kontaktiert haben, Spießen Sie die stumpfe Strom-Passing-Elektrode zuerst auf. Verwenden Sie Techniken wie Buzz (kurze Impulse der überschüssige Kapazität Entschädigung), kurze Stromimpulse oder leichtes Klopfen der Tabelle Elektrode Impalement zu erleichtern.
- Überwachen Sie das Signal mit einem Oszilloskop oder Oszilloskop-Protokoll in der Datenerfassungs-Software, bis ein negatives Membranpotential identifiziert ist, was darauf hindeutet, dass die Elektrode aufgespießt wurde.
- Drücken Sie die schärfere Spannung-sensing Elektrode auf den Muskel auf die Ebene der aufgespießte Strom-Passing-Elektrode. Sobald beide Elektroden im Einklang miteinander sind, aufspießen der Spannung-sensing Elektrode mit den gleichen Techniken mit der Strom-Passing-Elektrode aufgetragen.
- Bewerben Sie nach erfolgreichen Impalement, mit dem Controller für den Verstärker eine Konstante Negative Haltestrom mit der aktuellen vorbeifahrenden Elektrode zum Ausgleich von Membranschäden durch Elektrode Impalement. Wie die Zelle beginnt, langsam in Richtung-80 aufzuladen mV, Erhöhung der Haltestrom als benötigt, um die Zelle auf die gewünschte Ruhe potenzielle bringen (d.h.-80 bis-85 mV).
Hinweis: Vermeiden Sie die Aufnahme von Fasern, die einen Betrieb erfordern aktuelle im absoluten Wert größer als-25 nA in Wildtyp-Muskel, die Möglichkeit der Aufnahme von ungesunden Fasern zu minimieren. - Sobald die Faser für ein paar Minuten auf die gewünschte Ruhe potenzielle stabil ist, fahren Sie mit der Aufnahme von Muskel Membran Eigenschaften oder neuromuskulären Übertragung.
10. Erfassung der postsynaptischen Membran Eigenschaften und synaptische Übertragung
- Beginnen Sie mit Strom-Clamp Aufnahmen durch die Anwendung einer gleichen Anzahl von positiven und negativen aktuellen Schritte, um die entsprechenden Membran Spannung Antworten zu messen, die verwendet wird, um Motorische Endplatte Rin und τmbestimmen. Um passive Eigenschaften zu gewährleisten, verwenden Sie kleine Spannung Antworten, die einen stabilen Zustand zu erreichen und haben eine lineare Spannung-Strom-Beziehung16,19,20. Aufnahme von Fasern mit einem beschädigten oder fehlerhaften Nerv vermeiden, solche Fasern haben eine mEPP Frequenz von > 3 Hz.
- Geben Sie anschließend zwei-Elektroden-Spannung-Clamp gemäß den Herstellerangaben. Voltage-Clamp-Fasern auf einem Membran-Potential von-85 mV. Voltage-Clamp-Einstellungen sollte Signal-Rausch-Verhältnis erreichen, die Erkennung von mEPCs zu ermöglichen.
Hinweis: Aufrechterhaltung angemessener Spannungsregelung kann ein Problem sein. Wir verwenden zwei Methoden, um diese Probleme zu minimieren. Erstens sind die Fasern innerhalb von 100 µm der motorischen Endplatte aufgespießt wie zuvor beschrieben die ist in der Länge konstant diese Fasern21. Zweitens verwenden wir die DC-Restore-Funktion des Verstärkers. Diese Funktion setzt einen sehr hohe Spannung-Clamp-Gewinn. Unsere bisherige Arbeit hat diese Methode im Detail beschrieben und skizziert eine Methode für die Bewertung der Spannung eingeklemmt Endplatte16. - Einmal in Voltage-Clamp, aufzeichnen synaptische Ströme (mEPCs und eEPK es) mit verschiedenen Nervenstimulation Protokolle basierend auf den Anforderungen des Experiments.
- Rekord spontane mEPCs und EPCs mit einem Niederfrequenz-Nerv Stimulation Protokoll (≤0.5 Hz) ermöglicht eine Datensatz EPCs ohne synaptische Modulation (Moderation oder Modulation) Quanten Inhalte zu bewerten. Verwenden Sie um synaptische Erleichterung oder Depression zu beurteilen, ein Hochfrequenz-Nerv-Stimulation-Protokoll (10 Impulse bei 50 Hz).
- Stimulieren Sie die Nerven auf die gewünschte Frequenz über einen Reiz Isolierung, die mit einem Pulsgenerator, der mit der Datenerfassungs-Software gesteuert wird ausgelöst werden kann.
- Sobald die Spannung-Clamp-Aufnahmen fertig sind, den Verstärker auf eine Strom-Clamp-Einstellung zurück, schalten Sie alle Strömungen und entfernen Sie die Elektroden von der Faser. Überprüfen Sie, ob die Elektroden nicht verstopft oder Drift in der Grundlinie Spannung während der Aufnahme.
Hinweis: Bezüglich Drift, sollte die Elektrode Spannung 0 Volt in die extrazelluläre Lösung, wie sie vor Faser Impalement festgelegt wurden. Die aufgezeichneten Spannungen wäre beispielsweise unklar, ob die Spannung während des Experiments trieb.
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Representative Results
Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für die Stromimpulse (Abb. 8A) und die Spannung Antworten (Abbildung 8 b) aus einem LAL Faser unter Strom-Klammer aus einem 12 Wochen alten Wildtyp R6/2-Maus. Das Vorhandensein von mEPPs zeigt, dass diese Aufzeichnungen aus der motorischen Endplatte aufgenommen wurden. Die Aufzeichnungen wurden in normaler physiologischer Kochsalzlösung erhalten. Dieser Strom-Clamp-Datensätze können analysiert werden, um festzustellen, Rin und τm von dieser Faser16,19,20.
Abbildung 9Azeigt eine repräsentative Aufnahme eine EPG und zwei mEPCs, unter Spannung-Clamp Bedingungen erhalten. Die kurze aktuelle Ablenkung vor der EPC ist das Artefakt durch Nervenstimulation verursacht. Die Analyse der mEPCs und EPCs erfolgen kann schneller mit Event-Erkennungs-Software. Mit diesem Tool können die Forscher um eine Vorlage, die dann automatisch, die Ereignisse in der Aufzeichnung erkennen. Die Ereignisse können überlagert und in jedem Daten-Analyse-Software exportiert. Abbildung 9 zeigt die überlagerten EPC und mEPCs (kleines Foto) aus einer repräsentativen Faser.
Abbildung 1 : Allgemeine Lage der Levator Auris longus Muskel
Der LAL-Muskel befindet sich auf der dorsalen Oberfläche des Kopfes. Die rot gepunktete Linie zeigt den Pfad zum Schneiden der Haut für die Entfernung auf der dorsalen (A) und (B) Mantelfläche. Der LAL legt auf der Basis des Ohres, so ca. 1 mm der Haut rund um die Basis des Ohres zu vermeiden, schneiden die LAL intakt bleiben sollen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Ausgesetzt Levator Auris longus Muskel
LAL (gelb und grün) befindet sich direkt unter der Haut und der oberflächlichsten Muskel in den markierten Bereich. Es gibt zwei Teile des Muskels, die cranial (gelb) und kaudalen (grün) Regionen. Der Oberkopf ergibt sich aus der Mittellinie auf die ersten vier Halswirbel und läuft auf den vorderen Teil der Basis der Ohrmuschel. Zum Vergleich ist die Mittellinie eine Band aus Bindegewebe, die von der Scapulae (weißer Pfeil) in Richtung der Nase läuft. Der Rechte und linke LAL Muskel an der Mittellinie über den Schädel verbunden. Der kraniale Teil der LAL ist viel breiter als der kaudalen Teil. Der kaudalen Teil legt in der Nähe der Mittellinie auf der vierten und fünften zervikalen Wirbel und verbindet sich mit den hinteren Teil der Basis der Ohrmuschel. Während die Dissektion halten Sie ein paar Millimeter der Haut rund um das knorpelige Ohr um zu verhindern, schneiden die LAL, die in der Abbildung durch eine Belichtungsreihe gestrichelte Linie markiert ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Grobe sezieren von der Levator Auris longus und umliegenden Muskel
Sobald vom Tier entfernt, ist das Gewebe fixierten, dorsalen Seite nach unten (LAL auf Unterseite), in eine Silikon-Elastomer ausgekleidet-Schale mit feinen Nadeln gemacht, wie beschrieben in Abschnitt 5.3. Sobald an der Unterseite der Schale befestigt, können die darüber liegende Muskelschichten entfernt werden. Eine Insekt Pin durch den Gehörgang ist mit einem weißen gestrichelten Pfeil gekennzeichnet. Die gelben Pfeile zeigen ideale Pinplatzierung zur Entfernung von unerwünschten Muskeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Muskelschicht direkt unter dem Levator Auris longus
Hervorgehoben blau ist die Entführer Auris Longus (AAL) in rot Auricularis Scupularis (AS) und ist in gelb ist der Interscutularis (IS). Der LAL ist die wichtigste zugrunde liegenden Muskel in diesem Bild. Als Referenz wird das Ohr und die umgebende Haut durch eine durchgezogene schwarze Linie umrissen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Silikon-Elastomer-gefüttert, benutzerdefinierte Perfusion Kammer
Gezeigt wird die benutzerdefinierte 35 mm Perfusion Schüssel zur LAL für elektrophysiologische Aufnahmen (A)zu sichern. Silikon Elastomer dient zum Erstellen einer Oberfläche geeignet für Sehnsucht des Gewebes. In der Mitte der Kammer ist eine Runde Plattform, die hilfreich ist, wenn die Fasern aufspießen. Die Plattform unterstützt die Muskelfasern aus unter Wann anwenden eine nach unten gerichtete Kraft mit Elektroden während der Impalement verarbeiten. Diese Plattform war geprägt von Silikon-Elastomer, Form der Kurve einer 50 mL konische Röhre ermöglicht. Ein Stück davon gerundet Silikon Elastomer kann dann auf dem Boden der Kammer mit mehr Silikon-Elastomer geklebt werden. Eine skizzierte Darstellung der Schale als auch seitlich Blick erscheinen in B und C wo die Perfusion Kammer noch besser wahrgenommen werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Elektrophysiologie experimentieren Set-up
Eine kleine bipolare Elektrode wird mit einem magnetischen Kugelgelenk Manipulator, stimulieren den Nerv der LAL gehalten. Mikroskoptisch kann leicht eine magnetische Plattform mit dem Einsatz eines selbstklebenden magnetischen Materials zu halten (wie in einem Handwerk oder Baumarkt gefunden werden kann zur Herstellung von Kühlschrank-Magnete) erfolgen. Ebenfalls gezeigt werden die Headstages und Elektroden über eine LAL-Probe. Ein wichtiges Instrument ist der Wasser-Immersion, abgeschrägte Ziel mit einem keramischen DIP Kegel dargestellt. Das abgeschrägte Ende ermöglicht einfacher Platzierung der Elektrode und das keramische Material minimiert Störgeräusche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Identifikation der neuromuskulären
Alle Bilder zeigen die LAL gebeizt mit 5 µM 4-Di-2-Asp (grün) bis zur Visualisierung der neuromuskulären Verbindungen ermöglichen. (A) A helle Band der neuromuskulären Kreuzungen kann gesehen (gelbe Pfeile) werden bei der Anzeige des Muskels durch ein 10 X-Objektiv. Verzweigte Axone können auch gesehen werden, wie der weiße gestrichelte Pfeil angegeben. (B) kleine konfokale Stapel (5 x 1 µm) von drei neuromuskuläre Verbindungen (gelbe Pfeile). Gesunden Muskelfasern haben deutliche Streifung sowie mehrere Myonuclei, die als dunkle Flecken entlang der Sarkolemm der Faser (weisse Pfeile) angezeigt werden. Oft können die Axone innervieren die neuromuskulären Verbindungen sowie beobachtet werden. (C) eine Faser mit einer gefärbten neuromuskuläre Synapse, die mit Glaselektroden aufgespießt. Die Elektroden wurden mit einem weißen Highlight erweitert, so dass sie leichter zu sehen sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : Strom-Clamp Aufzeichnung der Membran Eigenschaften
Eingespritzte Stromimpulse (A) und die daraus resultierende Membran mögliche Antworten (B) aus einer Faser der Lal aufgezeichnet in physiologische Kochsalzlösung getaucht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9 : Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen
Eine rohe Spur eine EPG und zwei mEPCs in zwei-Elektroden-Spannung-Klammer (A) aufgezeichnet. Überlagerten EPC und mEPCs (kleines Foto) aus einer einzigen Faser (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschrieben ist die Vorbereitung und Verwendung der Maus LAL Muskel für die Messung der neuromuskulären Übertragung unter Strom oder Spannung Klemme Bedingungen. Es gibt mehrere wichtige Punkte zu beachten für Sezieren, die LAL. Reinigung überschüssiges Bindegewebe an der Muskel-Aids in Elektrode Impalement, als die Elektroden kann das Bindegewebe Haken, wenn sie für Impalement Positionierung. Jedoch nur entfernen, Bindegewebe, das weggenommen werden kann ganz einfach, die Wahrscheinlichkeit, dass des Muskels zu begrenzen. Die Isolierung des Nervs sollte mit Vorsicht durchgeführt werden, weil es sehr empfindlich ist. Um Nervenschäden zu vermeiden, ist es hilfreich, lassen einige der das umliegende Gewebe am Ende des Nervs durch die Pin platziert werden kann, um den Mut, das Gericht zu sichern. Darüber hinaus kümmern Sie sich nicht um den Nerv zu vernichten, wenn die Nervenstimulator Positionierung. Schließlich ist die Reihenfolge, in der die Elektroden in die Faser aufgespießt sind, wichtig. Die stumpfe Elektrode ist nicht so einfach zu Spießen und sollte zuerst aufgespießt werden. Wenn die scharfen Elektrode zunächst aufgespießt waren, konnte die stumpfe Elektrode der Muskelfaser herunterdrücken bevor es die Membran durchbohrt, wodurch möglicherweise die scharfen Elektrode kommen aus der Faser. Dies macht es notwendig, die Faser ein zweites Mal mit der scharfen Elektrode aufspießen, die unnötige Membranschäden führen würde. Es ist auch hilfreich, dass der Verstärker gleichzeitig Strom und Spannung der aktuellen vorbeifahrenden Elektrode messen kann, so dass eine negative Auslenkung in das Membranpotential beobachtet werden kann, darauf hinweist, dass die Elektrode aufgespießt worden.
Eine Besonderheit der LAL, die nützlich sein kann ist die Fähigkeit, beide Muskeln gleichzeitig zu entfernen. Dies ist ideal für Elektrophysiologie und Molekularbiologie experimentieren im selben Tier. Dies kann erreicht werden, indem Sie die folgenden im Wesentlichen des gleichen Protokolls beschriebenen mit geringfügigen Änderungen. Führen Sie alle Schritte unter Überschriften 1-3 alles beschrieben auf der rechten Seite, sowie Links zu tun. Bei Schritt 4 empfiehlt es sich, schneiden ventrolateralen seitlich an das rechte Ohr zu entfernen, die Muskeln beginnen. Wie bereits beschrieben, halten Sie die Messer drückte gegen den Schädel, so tief wie möglich verlassen minderwertigere Muskeln befestigt, die LAL schneiden. Weiterhin schneiden Sie auf das rechte Ohr vorbei an der Mittellinie, die Klinge so tief wie möglich zu halten. An dieser Stelle der Rest des Verfahrens ist, wie in diesem Protokoll beschrieben, führen Sie die verbleibenden Schritte nur auf beide Muskeln. Sobald die Muskeln gesäubert worden, ein LAL kann geschnitten werden, entfernt und gefrorenen für später molekulare Analyse und andererseits für Elektrophysiologie genutzt werden. Es wäre schwierig, Elektrophysiologie Studien mit beiden Muskeln des gleichen Tieres durchzuführen. Hierzu muss die Mittellinie geschnitten werden, um die Muskeln zu trennen und dabei wird also wahrscheinlich einige Muskelfasern beschädigt.
Der LAL ist seit langem verwendet, neuromuskulären Übertragung zu untersuchen, denn seine dünne Natur die einfache Identifizierung der motorischen Endplatten und ausgezeichnete Ex Vivo Perfusion1,3,4,5 ermöglicht ,6,7,8. Neben dem Einsatz von 4-di-2-Asp haben andere Gruppen Rhodamin konjugiert Bungarotoxin bei niedrigen Konzentrationen22verwendet. Wir haben die LAL für Elektrophysiologische Untersuchungen, Purinergic signalisieren und Mängel an Chorea Huntington16,20verwendet. Der LAL ist auch ideal für live Cell imaging Studien. Zum Beispiel haben mehrere Studien der LAL zur synaptischen Vesikel Freigabe und Aufnahme23,24Messung. Dies kann mit Farbstoffen, z. B. FM 1-43.
Da die Endplatten mit einem fluoreszierenden Fleck leicht beobachtet werden können, können die Elektroden in unmittelbarer Nähe der motorischen Endplatte in die Konstante Länge der Muskelfaser platziert werden. Platzierung der Elektrode an der Endplatte und den Einsatz von eine hohe Compliance-zwei-Elektroden Spannung-Clamp-System ermöglicht die Ermittler die volle Kontrolle über die Endplatte mit weniger als 1 % Fehler16. Dies kann wichtig sein, weil die gängigen Korrekturen für nicht-lineare Summierung der synaptischen Potentiale unter Strom-Clamp Bedingungen10 erfasst nicht Änderungen in der postsynaptischen Membran verursacht durch experimentellen Bedingungen ausmachen und/oder Krankheitszustandes. Zum Beispiel verstärken reduzierte ruhenden Endplatte maßgearbeitet postsynaptischen Potenziale19, auch diejenigen, die für nicht-lineare Summation korrigiert. Im Gegensatz dazu Spannung eingeklemmt postsynaptischen Ströme unterliegen nicht einer nichtlinearen Summierung Fehler und sind unabhängig von der postsynaptischen Membran Eigenschaften. Zeigt dies, haben wir vor kurzem gegensätzliche Ergebnisse aus Endplatte Potentiale im Vergleich zu Strömungen aufgenommen von hyper-erregbare Chorea Huntington Skelettmuskulatur16gezeigt.
Ein endgültige Schlüssel Vorteil der Verwendung der LAL für das Studium der neuromuskulären Übertragung ist, dass eine einzige Synapse Aufnahmen stammen. Neuromuskulären Übertragung aufgezeichnet aus einer Hand, bietet voll Spannung eingeklemmt Endplatte einige detaillierten und genauen Daten über synaptische Übertragung verfügbar, ist ideal für die Modellierung und die Komplexität der synaptischen entwirren Physiologie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Mark M. Rich und Daniel Miranda für redaktionelle Kommentare, Ahmad Khedraki für die Unterstützung dieser Technik und Wright State University für die finanzielle Unterstützung (Gründerfonds, A.A.V.) zu etablieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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