Identifikation af genetiske varianter bidrager til komplekse menneskelige sygdom tillader os at identificere nye mekanismer. Her viser vi en multiplex genotypebestemmelse tilgang til kandidat gener eller gen pathway analyse, der maksimerer dækning til en lav pris og er indstillet til kohorte-baserede undersøgelser.
Komplekse sygdomme understøttes ofte af flere fælles genetiske varianter, der bidrager til sygdom modtagelighed. Her, beskriver vi en omkostningseffektiv tag enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) tilgang ved hjælp af en multiplex genotypebestemmelse assay med massespektrometri, til at undersøge gen pathway foreninger i klinisk kohorter. Vi undersøger mad allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som et eksempel. Denne metode maksimerer effektivt dækning ved at udnytte fælles kobling ubalance (LD) inden for en region. Valgte LD SNPs er derefter designet i en multiplex assay, gør det muligt for op til 40 forskellige SNPs analyseres samtidig øge omkostningseffektiviteten. Polymerasekædereaktionen (PCR) anvendes til at forstærke target loci, efterfulgt af enkelt nucleotid udvidelse, og amplikoner derefter måles ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation-tid af flight(MALDI-TOF) massespektrometri. Det rå output er analyseret med genotype kræver software, ved hjælp af strenge kvalitetskontrol definitioner og cut-offs, og høj sandsynlighed genotyper er fastlagt og output til dataanalyse.
I menneskers komplekse sygdom, genetiske varianter bidrage til sygdom modtagelighed og kvantificere disse varianter kan være nyttig for forståelsen patogenese, identificerer patienten højrisikogrupper og behandling respondenter. Faktisk, løftet om præcision medicin er afhængig af udnytte genomiske information for at identificere patienten undergrupper1. Desværre, inden for det komplekse sygdomme biologi rum, hvor sygdommen fænotyper er understøttet af betydelige genetiske heterogenitet, lav penetrans og variabel ekspressivitet, kohorte størrelse krav til genome-wide tilgange til at identificere roman kandidater er ofte uoverkommeligt store2. Alternativt, en målrettet kandidat gen tilgang begynder med en apriori hypotese om specifikke gener/veje i sygdom ætiologi3. Sti analyseværktøjer er almindeligt anvendt til at undersøge Patofysiologi af et identificeret mål loci, genererer talrige kandidat veje skal undersøges. Vi viser her en multiplex genotypebestemmelse tilgang giver mulighed for undersøgelse af snesevis til hundredvis af SNPs med en assay, egnet til menneskelige kohorte studier4. Denne tilgang er relativt høj gennem-læg, tillader hundreder til tusinder af DNA-prøver skal genotypebestemmes for romanen discovery undersøgelser og efterforskning af specifikke veje. De metoder, der er skitseret her er nyttig til at identificere risikoen alleler og deres foreninger med kliniske træk i en relativt hurtig og billig måde. Denne platform er blevet meget fordelagtige for screening og diagnostiske formål5,6, og for nylig, for mikrobiel infektion7 og humant papillomvirus8.
Denne protokol begynder med udvælgelsen af et sæt af gener for undersøgelsen, dvs., målområder, typisk bestemmes gennem litteratur søgning, eller en på forhånd hypoteser for deltagelse i sygdomsprocessen; eller måske valgte for replikering som de førende sammenslutninger af en opdagelse genome-wide association (GWA) undersøgelse. Forskeren vil gen sæt Vælg et raffineret liste over tag SNPs. Det vil sige, bruges kobling ubalance (LD), eller korrelation, blandt varianter i regionen til at identificere en repræsentant ‘tag SNP’ for en gruppe af SNPs i høj LD, kendt som en haplotype. Den høje LD i regionen betyder, at SNPs ofte er arvet sammen, således at genotypebestemmelse en SNP er tilstrækkeligt til at repræsentere variationen på alle SNPs i haplotype. Alternativt, hvis følger op på en definitiv liste over SNPs fra mange områder, fx., replikering til en GWA undersøgelse, denne proces kan være unødvendig. For multipleksede genotypebestemmelse, skal en analyse derefter være konstrueret omkring disse mål sådan, at forstærkning primere er af forskellig masse til dem af de forlængelse primere og produkter til at producere fortolkelige masse spektre. Disse parametre der let kan implementeres af en multiplex genotypebestemmelse assay designværktøj. Frem og bak primere fra dette design vil blive brugt til at målrette markører af interesse og forstærke den sekvens, som indeholder SNP. Udvidelse primere vedhæfte direkte proksimalt for SNPs og en enkelt, masse-modificeret, “terminator” base, der supplerer SNP er tilføjet. Terminator base forhindrer yderligere udvidelse af DNA. Mass-ændring af basen giver fragmenter afviger en enkelt base til at blive opdaget af massespektrometri. Pladen indeholder genotypebestemmelse kemi derefter anvendes på en chip til måling på en massespektrometri platform. Efter anvender passende kvalitetskontrol på de rå genotypebestemmelse opfordringer registreret af systemet, kan data eksporteret og brugt til statistisk analyse til at teste for association med sygdom fænotyper.
Her viser vi metode til multipleksede genotypebestemmelse ved hjælp af massespektrometri. De repræsentative resultater blev genereret ved hjælp af PCR parret med MALDI-TOF-massespektrometri4 med assay kemi listet i Tabel af materialer13. Med denne platform genereret vi ialt 11,295 genotyper på 1,255 personer for 9 SNPs inden for 40 h i laboratoriet.
Vi illustrerer nytten af teknikken i besvarelsen genetiske hypoteser ved at g…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
Micropipettes | single and 8-channel | ||
Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
Plate rotator | |||
MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |