Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

مما يجعل الناجم عن تصريف جسيمات شبيهة بالفيروس سي نيون بالكيمياء ديبروموماليميدي-ثنائي كبريتيد

Published: May 27, 2018 doi: 10.3791/57712
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

Summary

نقدم هنا، على إجراء فلوريسسينتلي فونكتيوناليزي ديسولفيديس في عزام Qβ مع ديبروموماليميدي. يصف لنا التعبير Qβ وتنقية وتركيب جزيئات فونكتيوناليزيد ديبروموماليميدي ورد فعل الاقتران بين ديبروموماليميدي و Qβ. يمكن استخدام الجسيمات مترافق نيون الصفراء الناتجة كتحقيق الأسفار داخل الخلايا.

Abstract

الارتفاع الأخير في جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) في الطب الحيوي وأبحاث المواد يمكن أن يعزى إلى سهولة التركيب الحيوي وحجم منفصلة، وقابلية البرمجة الوراثية وتحلل الأحيائي. في حين أنهم عالية قابلة لردود الفعل بيوكونجوجيشن لإضافة يغاندس الاصطناعية على سطحها، النطاق في منهجيات بيوكونجوجيشن في هذه كابسيدس ولد مائي محدودة نسبيا. لتسهيل توجيه البحوث الحيوية الوظيفية، يجب النظر في ردود الفعل بيوكونجوجيشن غير التقليدية. رد فعل الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم ديبروموماليميديس استحداث وظائف جديدة في المذيب سندات ثنائي كبريتيد المكشوفة من عزام استناداً إلى Qβ عاثية. وعلاوة على ذلك، المنتج النهائي فلوري، الذي له فائدة إضافية لتوليد مسبار تتبعها في المختبر استخدام مجموعة عوامل تصفية متوفرة تجارياً.

Introduction

استخدام نانو الحجم كابسيدس الفيروسية قد برز كحقل مثيرة، التي تهدف إلى توسيع نطاق التطبيقات في البحوث الطبية الحيوية1،،من23. ريكومبينانتلي أعرب عن جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) تستمد هيكلياً من الفيروسات، لكنها تفتقر إلى المواد الوراثية الفيروسية الأصلية يجعلها الجسيمات النانوية البروتينية غير المعدية. السمات السطحية هي مبرمج وراثيا وهو أعرب كل قفيصه مطابق تماما لتلك التي قبل وبعد ذلك، من الممكن أن تعرف موقع وعدد من سلاسل الجانب التفاعلي من الأحماض الأمينية بدقة متنافر. في كثير من الحالات، تمتلك كلا من الأسطح الخارجية والداخلية أنواع كثيرة من مخلفات المذيبات من الأحماض الأمينية المكشوفة، التي يمكن أن تكون فونكتيوناليزيد عمليا من خلال ردود الفعل بيوكونجوجيشن-ردود الفعل التي تشكل سندات تساهمية بين بيوموليكولي والاصطناعية جزيء4،5.

ردود فعل بيوكونجوجيشن مساعدة الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام بوظائف أكثر تنوعاً بطريقة مباشرة نسبيا. يمكن توليفها من قبل الجزيئات ذات الاهتمام، مثل العقاقير العلاجية6،7 من العلامات الفلورية والبوليمرات8،9 وتتميز قبل هي التي تعلق على سطح فلبس. عزام شائع بوجه خاص في الطب الحيوي والأبحاث الحيوية قد كان عزام استناداً إلى Qβ عاثية، الذي، كما أعرب عن ريكومبينانتلي، هو icosahedral قفيصه فيروسية نانومتر 2810. مواقع رد الفعل الأكثر شيوعاً في Qβ ليسينيس بفارق كبير، على الرغم من أننا قد أبلغت مؤخرا الاقتران الناجح11 من مركبات ديبروموماليميدي إلى ديسولفيديس انخفاض هذا الخط مسام Qβ عن طريق فعل بيكر هادليتون. رد فعل العائدات مع حسن العائد، ونفس القدر من الأهمية، دون فقدان الثبات الحراري للجسيمات. في الوقت نفسه، يولد رد الفعل هذا الأسفار الناجم عن تصريف الأفعال، التي يمكن استخدامها لتعقب امتصاص هذه الجزيئات داخل الخلايا. في هذا العمل، ونظهر على تصريف من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) على السطح Qβ من خلال رد فعل هادليتون-بيكر، الذي ينتج fluorophore صفراء زاهية. ثم يمكن تعقب هذه الجسيمات كما أخذوا الخلايا. البروتوكول هنا سوف تساعد الباحثين توليد الجديد سي نيون الجسيمات النانوية البروتينية استناداً إلى Qβ، على الرغم من أن المبادئ قابلة للتطبيق إلى واحدة من العديد من فلبس الأخرى التي تحتوي على المذيبات disulfides المكشوفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد

  1. أجار ليسوجيني مرق (رطل) وصب لوحات12.
  2. تحويل BL21(DE3) مع بلازميد pET28 التي تحتوي على تسلسل البروتين معطف wtQβ.
    1. ذوبان الجليد كولاي BL21(DE3) الخلايا المختصة في حمام الثلج. مكان 50 ميكروليتر من الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    2. إضافة 2 ميكروليتر من بلازميد في أنبوب واحد ونفض الغبار بلطف الأنبوب. ثم احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. صدمة الحرارة الخلايا ل 45 ثانية في حمام مائي في الضبط 42 درجة مئوية. ضع الأنبوبة في حمام الثلج فورا بعد صدمة الحرارة، واحتضان لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة ميكروليتر 950 رطل من وسائط الإعلام التي لا تحتوي على أي من المضادات الحيوية.
    5. اهتزاز الثقافة 200 لفة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. لوحة 100 ميكروليتر من الثقافة في لوحات أجار رطل (مع كاناميسين) واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. حدد مستعمرات بيضاء عند الحاجة.
  3. جعل الإعلام سوبر الأمثل مرق (سوب).
    1. اﻷوتوكﻻف اثنين 2 ل حير قوارير ارلينمييير في دورة سوبيردري.
    2. في بيئة معقمة، تزن وإضافة ز 20.0 من تريبتوني، ز 5.0 من الخميرة استخراج، ز 2.469 اللامائى سلفات المغنيزيوم، 0.584 ز من كلوريد الصوديوم و 0.186 غرام من كلوريد البوتاسيوم لكل قارورة.
    3. إحضار وحدة التخزين إلى 1 لتر بالماء عالي النقاوة في كل قارورة والاوتوكلاف على دورة السائل.
    4. وبمجرد وسائل الإعلام سوب وصلت درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم، إضافة 1 مل كاناميسين (100 مغ/مل) لكل لتر من وسائل الإعلام وتخزين في 4 درجات مئوية.
  4. جعل العازلة فوسفات البوتاسيوم 0.1 M (pH 7.00).
    1. جعل الحل مونوباسيك البوتاسيوم 1 م بتذويب ز 68.045 البوتاسيوم مونوباسيك في 500 مل الماء عالي النقاوة.
    2. جعل البوتاسيوم 1 م حل مائي بتذويب ز 87.09 البوتاسيوم مائي في 500 مل الماء عالي النقاوة.
    3. إضافة مل 38.5 الحل مونوباسيك البوتاسيوم ومل 61.5 البوتاسيوم مائي باستخدام زجاجة 1 لتر.
    4. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.00 إذا لزم الأمر، وعلى كمية من 1 ل.
  5. إجراء 5 – 40% التدرجات السكروز في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 0.1 M (pH 7.00).
    1. في أنابيب الطرد المركزي 50 مل، إعداد الحلول مع 5 – 40% (زيادة في زيادات بمقدار 5 في المائة) السكروز المذاب في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 0.1 M (pH 7.00).
    2. إيداع 3.3 مل محلول 5% في الجزء السفلي من أنبوب البولي السفلي الجولة 38 مل باستخدام حقنه إبرة طويلة وكرر هذه العملية لخمسة أنابيب أخرى.
    3. إيداع 3.3 مل محلول السكروز 10% في الجزء السفلي من الأنبوب بعناية، وإزالة الإبرة بشأن عدم الإزعاج التدرج بعناية. كرر هذه الأنابيب الخمسة الأخرى.
       
  6. الاستمرار في إيداع طبقات 3.3 مل من حلول السكروز، زيادة من 15% إلى 40% في كل أنبوب، مع الحذر أن لا تخل بالتدرج.
  7. عند الانتهاء، تغطي قمم التدرجات مع إحباط وتخزينها في-80 درجة مئوية.

2-التعبير عن Qβ

  1. مسح منطقة مقاعد البدلاء مع التبييض 1:1/الإيثانول.
  2. جعل ثقافتين 3 مل من كاتب في بيئة معقمة بإضافة واحد مستعمرات كولاي BL21(DE3) إلى 3 مل الإعلام سوب في بيئة معقمة.
  3. تنمو على شاكر 250 لفة في الدقيقة في غرفة رطوبة النسبية (rH) 37 درجة مئوية و 0% بين عشية وضحاها.
  4. تطعيم الثقافة المبتدئين في سوب وسائط الإعلام:
    1. تقلع كل الثقافات كاتب 3 مل شاكر، وفي بيئة معقمة، صب كل ثقافة كاتب في واحد من اثنين ل 2 في حيرة قوارير Erlenmeyer مع 1 لتر وسائط سوب الطازجة في كل.
    2. وضع وسائل الإعلام الملقحين على شاكر 250 لفة في الدقيقة في غرفة rH 37 درجة مئوية و 0%.
  5. تنمو هذه البكتيريا في شاكر 250 لفة في الدقيقة في غرفة rH 37 درجة مئوية و 0% حتى OD600 يصل إلى 0.9-1.0.
  6. أضف 1 مل من م 1 الأيزوبروبيل β-د-1 ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) باستخدام ماصة P1000 للحث على التعبير البروتين.
  7. ترك وسائل الإعلام على شاكر في 250 دورة في الدقيقة في غرفة 37 درجة مئوية و 0% رطوبة نسبية بين عشية وضحاها.
  8. إزالة الوسائط من شاكر في صباح اليوم التالي وأجهزة الطرد المركزي من استخدام زجاجات 1000 مل في 20,621 × ز ح 1 في 4 درجات مئوية لحصاد الخلايا.
  9. تجاهل المادة طافية وجمع بيليه الخلية.
    1. صب المادة طافية قارورة مع حوالي 5 مل التبييض لقتل البكتيريا. هذا النفايات.
    2. استخدام ملعقة كشط بيليه الخلية من الجزء السفلي من الزجاجة للطرد المركزي ووضع بيليه في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي.

3-تنقية Qβ

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية مع ~ 20-30 مل من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 0.1 M (pH 7.00).
  2. تأكد من استثارة لا قطع، والخلايا باستخدام معالج ميكروفلويديزير وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). الخلايا مرتين على الأقل لزيادة عائد الجسيمات.
  3. الطرد المركزي في في أجهزة الطرد المركزي 250 مل الزجاجات 20,621 س ز للموارد البشرية 1 في 4 درجات مئوية.
  4. تجاهل بيليه، وقياس حجم المادة طافية في مل. ضرب هذه القيمة بواسطة 0.265 وإضافة هذا المبلغ من غرام كبريتات الأمونيوم إلى المادة طافية.
  5. ضجة في 4 درجات مئوية على الأقل 1 ح على لوحة ضجة 200 لفة في الدقيقة يعجل بالبروتين.
  6. الطرد المركزي في 250 مل الزجاجات 20,621 ز س ح 1 في 4 درجات مئوية.
  7. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع حوالي 10 مل من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 0.1 M (pH 7.00).
  8. إضافة كميات متساوية من 1:1 كلوروفورم/n-butanol بعينه النفط الخام ومزيج من فورتيكسينج لبضع ثوان.
  9. الطرد المركزي في أنابيب مل 38 في 20,621 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. استعادة الطبقة المائية العليا استخدام ماصة باستور. الحذر من عدم القيام بأي من الهلام مثل الطبقة التي شكلت بين الطبقة المائية والعضوية.
  11. ذوبان الجليد ستة التدرجات السكروز مسبقة الصنع 5 – 40% وتحميل حوالي 2 مل الاستخراج على كل منهما.
  12. أولتراسينتريفوجي في 99,582 س ز ح 16 عند 4 درجة مئوية مع تباطؤ مجاناً.
  13. تسليط ضوء التي ينبعث منها الضوء صمام ثنائي (LED) تحت كل أنبوبة وفرقة زرقاء وينبغي أن تصبح مرئية. استرداد هذه الجسيمات بحقنه إبرة طويلة.
  14. أولترابيليت الجسيمات في 370,541 س ز ح 2.5 في 4 درجات مئوية.
  15. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه شفافة لتنقية الجزيئات مع المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم 0.1 M (pH 7.00).

4-التقييم الكمي، وتأكيدا للمنتج

  1. استخدام "مقايسة برادفورد" لتحديد كمية المنتج13.
  2. الحد من التشغيل وعدم تقليل الصوديوم دوديسيل كبريتات التفريد جل polyacrylamide (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) للتأكد من المنتج14.
    ملاحظة: الحد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يستخدم للتأكد من الوزن الجزيئي للبروتين معطف؛ عدم خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة لتأكيد هيكل ترتيب أعلى.

5-التصريف DB المركبات في Qβ

  1. الحد من ديسولفيديس في Qβ.
    1. حل ز 0.0020 من tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب) في 1 مل من الماء عالي النقاوة لجعل حل أسهم 100 x.
      ملاحظة: تعد تسيب الطازجة قبل التخفيض.
    2. إضافة 200 ميليلتر من Qβ (5 ملغ/mL) في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    3. اتبع بإضافة 20 ميليلتر من 100 x TCEP الأسهم الحل.
    4. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
  2. إعادة سد ثنائي كبريتيد انخفاض استخدام ديبروموماليميدي البولي إيثيلين غليكول (DB-الربط).
    1. حل 0.0017 ز من البولي إيثيلين ديبروموماليميدي غليكول (DB-شماعة) في 100 ميليلتر من DMF.
    2. إضافة ميليلتر 680 من حل فوسفات الصوديوم 10 مم (درجة الحموضة 5.00).
    3. أضف تخفيض Qβ إلى حل DB-شماعة ومراقبة عملية خلط تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر. يمكن تصور الأسفار صفراء زاهية فورا مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية يده 365 نيوتن متر عند خلط.
    4. واسمحوا رد فعل المضي قدما بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) على المشواة.
  3. تنقية الخليط رد الفعل بتصفية الطرد المركزي (كومو = كاتشين 10) ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني x 1 في 3,283 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. رصد الاقتران بغير تخفيض مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة وأصلي [اغروس] هلام التفريد.
    ملاحظة: تشغيل فلبس كجزيئات سليمة في الأصلية [اغروس] هلام، وفصلهم بناء على تهمة والحجم والشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن توليفها على المشتقات ديبروموماليميدي من خلال رد فعل التكثيف بين الخل ديبروموماليميدي والامينات الأولية15. وبدلاً من ذلك، كان استغلال معتدل طريقة اصطناعية16 استخدام N-ميثوكسيكاربونيل المنشط 3 و 4-ديبروموماليميدي هنا نتيجة للتفاعل مع ميثوكسيبولييثيليني غليكول (شماعة) الغلة DB-شماعة (الشكل 1). الرنين المغناطيسي النووي استخدمت لتحديد هيكل المركبة (الشكل 2). عزام Qβ هو 28 نانومتر icosahedral البروتينية نانوحبيبات، الذي يتألف من 180 معطف متطابقة البروتينات. البروتينات معطف تميل إلى تشكيل نونكوفالينت dimers المتشابكة من خلال تلك المجالات α-حلزونية مع β-الأوراق من البروتينات معطف المجاورة17. فلبس تميل إلى أن تكون محددة لتحقيق الاستقرار في درجات حرارة عالية، تتمثل المتطرفة، وفي مختلف التراكيب المذيبات18. وفي هذه الحالة، Qβ عزام أكثر استقرارا من غيرها فاجيس الجيش الملكي النيبالي في الأسرة ليفيفيريداك سبب 180 سندات ثنائي كبريتيد حبلا بين الوكالات الموجودة في المحاور الخمسة وستة إضعاف من التماثل في قفيصه19 (الشكل 3). ترتبط هذه الهياكل هيكساميريك وبينتاميريك ديسولفيديس، التي يمكن تصور بعدم خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة19. مكافئات عشرة من تسيب (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (µmol 0.70)، بالنسبة إلى ديسولفيديس في 1 مغ Qβ (البروتين معطف µmol 0.070، 0.070 µmol disulfides)، كانت تستخدم للحد من جميع ديسولفيديس لتوليد كابسيدس Qβ المخفضة (rQβ) في درجة حرارة الغرفة في أحد ساعة، وعدم خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة يظهر أن جميع هياكل النظام أعلى انخفضت إلى البروتينات معطف أحادي(الشكل 4 و الشكل 5A). حدث رد فعل على ريبريدجي لهم كتوليفة وعاء واحد، كما أضيفت اختلاط rQβ الخام مباشرة إلى مكافئات 20 من حل شماعة DB (1.4 µmol) في فوسفات الصوديوم (10 ملم، ودرجة الحموضة 5.00، 10% DMF) بعد أن رد فعل تخفيض ساعة واحدة11. وكان هناك fluorescence أصفر مشرق يمكن ملاحظتها تحت 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية مصباح (الشكل 5) مباشرة بعد إضافة DB-الوتد. الخليط كان ثم المحتضنة في الرايت بين عشية وضحاها في المشواة، متبوعاً بالتنقية باستخدام عامل تصفية الطرد المركزي (موكو = كاتشين 10) الشطف مع المخزن المؤقت المطلوب ثلاث مرات لإزالة الكميات الزائدة من الجزيئات الصغيرة. كانت حراكه يصرف Qβ-ماليميدي في حل فوسفات الصوديوم 10 مم (درجة الحموضة 5.00) لتعزيز فوتوستابيليتي. وأكد على تصريف غير خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة تحت الأشعة فوق البنفسجية وأخذ الأزرق تلطيخ (الشكل 5A). أظهر جميع العصابات الفلورية (الشكل 5A) تحت الأشعة فوق البنفسجية التي كولوكاليزيد مع أخذ الأزرق تلطيخ، ويمثل اقتران نجاح. وأكد سلامة يصرف Qβ-شماعة الأصلي [اغروس] هلام التفريد وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) (الشكل 5، ج).

الأسفار الطيفي أظهرت ماكسيما الإثارة والانبعاثات من Qβ-ماليميدي (Qβ-Μ) وشماعة Qβ بحوالي 400 نانومتر و 540-550 نانومتر، على التوالي (الشكل 6). ويجعل هذا البيان مع تعيين عامل تصفية بروتينات فلورية خضراء-الأشعة فوق البنفسجية المتوفرة تجارياً، الطول الموجي الإثارة التي هي 405 الطول الموجي نانومتر والانبعاثات 500-540 نانومتر. المحاذاة مريحة من خصائص فوتوفيسيكال يصرف مع عامل التصفية المتوفرة تجارياً مجموعات ترخيص استخدام شماعة Qβ في المختبر تحقيق، الذي تم القيام به وتصويرها في الشكل 7. Qβ-شماعة (200 nM) كان المحتضنة مع الماوس الخام-264.7 خلايا خالية من المصل المتوسطة دميم، متبوعاً تلطيخ نواة. صور كولوكاليزيشن في الشكل 7 يوضح أن الجسيمات الفلورية الأصفر أوبتاكين بالخلايا 264.7 الخام ويمكن تعقبها بعد أربع ساعات حضانة. فلبس Qβ أونفونكتيوناليزيد إظهار الأسفار لا يعتد بها.

Figure 1
رقم 1: مخطط الاصطناعية لشماعة DB. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: وصف الرنين المغناطيسي النووي- (أ) 1 الرنين المغناطيسي النووي ح) و (ب) 13ج من DB-الوتد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: بنية بلورية من قفيصه عزام Qβ المجهزة في الوهم (PDB معرف: 1QBE)- اثنين من بقايا السيستين (Cys 74 و Cys 80) ترد في أورانج.

Figure 4
الشكل 4: مخطط تصريف يصرف Qβ-ماليميدي (Qβ-م)- Qβ (µmol 0.07 من ديسولفيديس) تم تخفيض استخدام مكافئات 10 من تسيب (0.7 µmol) على RT لمدة ساعة واحدة تليها إضافة معادلات 20 من مركبات ديبروموماليميدي (DB وشماعة DB) (1.4 µmol). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: وصف Qβ، rQβ، Qβ-M وشماعة Qβ. (أ) عدم خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة وأصلي [اغروس] (ب) جل من Qβ، rQβ، Qβ-M وشماعة Qβ تحت الأشعة فوق البنفسجية (أعلى) وأخذ الزرقاء المصبوغة (أسفل). (ج) صورة مجهرية تيم Qβ-M (أعلى) و Qβ-شماعة (أسفل). (د) صورة من Qβ-شماعة رد فعل الخليط تحت 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية الإضاءة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: الأطياف Fluorescence. الأسفار الإثارة (A) والانبعاثات (ب) أطياف Qβ-M وشماعة Qβ في 0.1 متر من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم (pH 7.00). الإثارة الحد الأقصى هو حوالي 400 نانومتر والانبعاثات والحد الأقصى حوالي 540-550 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: صور الأسفار [كنفوكل] من Qβ-شماعة متزاوجة في الخلايا بلعم 264.7. الأزرق: نوكريد لايف 647 ريديبروبيس الكواشف. الأصفر: Qβ-الوتد. أعلى الصور: دمج القنوات الأزرق والأصفر. أسفل الصور: الصور الميدانية مشرق. تصفية مجموعات: الأشعة فوق البنفسجية-التجارة والنقل (λت = 405 nm, λم = 500-540 نانومتر)، Cy5. كان الوقت لاحتضان حاء – 4 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقارنة لتنقية البروتين أصغر حجماً، هي خطوة فريدة من نوعها في تنقية عاثية Qβ الطرد المركزي السكروز التدرج. بعد الخطوة استخراج كلوروفورم/n-butanol، هو زيادة تنقية Qβ استخدام التدرجات السكروز 5-40 في المائة. أثناء الطرد المركزي، يتم فصل الجزيئات استناداً إلى أحجام الخاصة بهم. السفر الجسيمات الأكبر حجماً إلى منطقة كثافة أعلى، بينما جسيمات أصغر البقاء في منطقة أقل كثافة. Qβ يسافر إلى الثلث السفلي من التدرج، ولا يزال هناك بينما أصغر البروتين الشوائب محاصرون في الجزء العلوي من الأنبوب الطرد المركزي. تعليق غرواني Qβ يظهر تيندال قوية تناثر في التدرج السكروز، التي يمكن اعتبار فرقة زرقاء عندما يتم لمعت على ضوء الصمام من تحتها. ثم هذه الفرقة من السهل استخراجها باستخدام إبرة حقنه طويلة. هو القريبون Qβ في السكروز ثم واسطة تنبيذ فائق، مما أسفر عن بيليه واضحة. يمكن حراكه في المخزن المؤقت المطلوب بيليه أو تنقيته المزيد من البروتين سريع اللوني السائل (فبلك). يمكن تأكيد نقاء الجسيمات الناتجة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.

تسيب غير مستقر في المخزن المؤقت للفوسفات، حيث ينبغي إعداد حل أسهم x TCEP 100 طازجة في المياه قبل التخفيض. وباﻹضافة إلى ذلك، تسيب لا يتضمن ثيول الحرة لا يتفاعل مع اتجاه الأحماض الأمينية الأخرى، حيث أنه ليس من الضروري لإزالة فائض تسيب قبل القيام برد فعل التصريف. مركبات ديبروموماليميدي تذاب في الحل فوسفات الصوديوم 5.00 درجة الحموضة، تليها إضافة Qβ انخفاض. الساعة 5.00 من درجة الحموضة، هو سيستين (ثنائي كبريتيد مخفضة) البروتونية، الذي يعزز تفاعل الاقتران مع ديبروموماليميدي بمنع إعادة أكسدة مرة أخرى إلى ثنائي كبريتيد. تحت 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية الإضاءة، تنبعث الخليط رد فعل الأسفار الصفراء فورا بعد انخفاض Qβ تمت إضافة إلى مركبات DB. بشكل مختلف من إرفاق fluorophores المركبة مسبقاً في Qβ، هو الناجم عن هذه الأسفار برد فعل التصريف. يتم تشكيل فلوروفوري حالما يتم إنشاء روابط جديدة بين الحلبة ماليميدي والكبريت. الأطياف fluorescence يبين أن الإثارة (400 نانومتر) والانبعاثات (550 نانومتر) ماكسيما تناسب تصفية الأشعة فوق البنفسجية-التجارة والنقل في مجهر [كنفوكل] (λت = 405 nm, λم = 500−540 نيوتن متر). ثم كان المحتضنة شماعة Qβ مع بلعم 264.7 الخام في دميم خالية من المصل. بعد أربع ساعات حضانة، كان شماعة Qβ أوبتاكين والأصفر الشروريه يمكن تصور المقصورات نيون داخل الخلايا. حقيقة واحدة أن يحتاج إلى ذكر الأسفار يمكن نقلها لحد ما إلى ألبومين المصل البقري (BSA) في المصل أو غيرها من المواد الغنية سيستين داخل في ليسوسوميس أو اندوسوميس الراحل من الخلايا. على مر الزمن، وهذا سيضعف من الأسفار داخل الخلية للخلية تتبع التطبيقات؛ ومع ذلك، فإنه أيضا يتيح فرصة لتصميم جديد لنظم إيصال المخدرات.

وفي الختام، لقد أظهرنا التصريف شماعة DB على عزام Qβ عن طريق ديبروموماليميدي-ثيول الكيمياء. رد فعل تصريف الكل في واحد فونكتيوناليزيس ديسولفيديس على طول المسام على عزام مع شماعة ليس فقط، ولكن أيضا يجعل نانوحبيبات البروتينية مسماة فلوريسسينتلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

J.J.G. يعترف بمؤسسة "العلوم الوطنية" (هيئة الهجرة واللاجئين-1654405) و "السرطان منع الأبحاث معهد تكساس" (كبريت) (RP170752s) لما تقدمه من الدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth (Miller)  EMD Millipore 1.10285.0500
Tryptone, Poweder Research Products International T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder Research Products International Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate P212121 CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System Fisher Scientific 4474524
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific P288-500
Sucrose Fisher Scientific S25590B
Ethanol Fisher Scientific BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor  Fisher Scientific 096-041053
Ammonium Sulfate P212121 KW-0066-5KG
Chloroform Alfa Aesar 32614-M6
1-Butanol Fisher Scientific A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum Beckman Coulter 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, Beckman Coulter 337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay Fisher Scientific PI23200
TRIS Hydrochloride Research Products International T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine Alfa Aesar J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97% Sigma Aldrich 553603-5G
Polythylene Glycol Alfa Aesar 41561-22
Sodium Phosphate Fisher Scientific AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide P212121 RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich L3771-100G
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus  FV3000 
Labnet Revolver Adjustable Rotator  Thomas Scientific  1190P25 
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap  Thermo Scientific 010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer Thermo Scientific 3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC Thermo Scientific 3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim Pyrex 4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units Millipore Sigma UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor Microfluidics M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate Beckman Coulter 41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL PolyLab 80005
533LS-E Series Steam Sterilizers Getinge 533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid LabSource D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube Fisher Scientific 14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker VWR Scientifc Products 14005-830
Tetra Handcast systems Bio-Rad 1658000FC
Polypropylene, 250 mL Beckman Coulter 41121703
Spectrofluorometer NanoDrop Thermo Fisher Scientific 3300
Long Needle  Hamilton  7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock Fisher Scientific 14-841-46
P1000 Pipetman Gilson F123602
P200 Pipetman Gilson F123601
P100 Pipetman Gilson F123615
P20 Pipetman Gilson F123600
P10 Pipetman Gilson F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance Intelligent Weighting Technology IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube Fisher Scientific 14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl Bio-Rad 456-1084

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
  13. Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
  14. Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  15. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  16. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  17. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  18. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  19. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، 135 قضية، المواد النانوية، وجسيمات شبيهة بالفيروس، عاثية Qβ (قبيتا)، كابسيدس فونكتيوناليزينج، والأسفار، رد فعل بيوكونجوجيشن، مشتقات ديبروموماليميدي، البولي إثيلين غليكول (شماعة)
مما يجعل الناجم عن تصريف جسيمات شبيهة بالفيروس سي نيون بالكيمياء ديبروموماليميدي-ثنائي كبريتيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E.,… More

Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E., Gassensmith, J. J. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (135), e57712, doi:10.3791/57712 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter