Summary
Här presenterar vi ett förfarande för att fluorescently functionalize i disulfides på Qβ VLP med dibromomaleimide. Vi beskriver Qβ uttryck och rening, syntesen av dibromomaleimide-functionalized molekyler och konjugation reaktionen mellan dibromomaleimide och Qβ. Den resulterande gul fluorescerande konjugera partikeln kan användas som en fluorescens sond inuti celler.
Abstract
Den senaste uppgången i virusliknande viruslika partiklar i biomedicinsk och materialforskning kan hänföras till deras användarvänlighet biosyntes, diskreta storlek, genetisk programmering och nedbrytbarhet. Medan de är mycket mottagliga för bioconjugation reaktioner för att lägga till syntetiska ligander på deras yta, är i bioconjugation metoder på dessa aqueous född förhoppningsvis relativt begränsat. För att underlätta ledning av funktionella biomaterial forskning, måste icke-traditionella bioconjugation reaktioner beaktas. Den reaktion som beskrivs i detta protokoll använder dibromomaleimides att införa nya funktioner i lösningsmedlet exponerade disulfide obligationer av en VLP baseras på Bacteriophage Qβ. Slutprodukten är dessutom fluorescerande, som har fördelen av att generera en spårbar in vitro- sonden med hjälp av kommersiellt tillgängliga filter.
Introduction
Med hjälp av nano-storlek viral förhoppningsvis har vuxit fram som ett spännande område, som syftar till att utvidga tillämpningsområdet för tillämpningar inom biomedicinsk forskning1,2,3. Recombinantly uttryckt virusliknande viruslika partiklar härrör strukturellt från virus, men de saknar den ursprungliga viral arvsmassa som gör dem icke-infektiös proteinhaltiga nanopartiklar. Som ytstrukturen är genetiskt programmerade och varje kapsid uttrycks identiskt med de före och efter det, är det möjligt att veta platsen och antalet reaktiva sida kedjor av aminosyror med atomistisk precision. I många fall besitter både exteriör och interiör ytorna många sorters lösningsmedel exponerade aminosyra rester, som lämpligen kan vara functionalized genom bioconjugation reaktioner - reaktioner som bildar kovalenta bindningar mellan en biomolecule och en syntetisk molekyl4,5.
Bioconjugation reaktioner hjälpa biomolekyler sevärdheter har mer varierande funktioner på ett relativt enkelt sätt. Molekyler av intresse, såsom terapeutiska läkemedel6, fluorescerande Taggar7 och polymerer8,9 kan vara pre syntetiseras och kännetecknas innan de är fästa på ytan av framställda. Ett särskilt vanligt VLP i biomedicinsk och biomaterial forskning har varit den VLP som baseras på Bacteriophage Qβ, som recombinantly uttryckt, är en 28 nm ikosaedriska virus kapsid10. De vanligaste reaktion webbplatserna på Qβ är lysines med råge, men vi har nyligen kommunicerat framgångsrikt konjugation11 dibromomaleimide föreningar till de reducerade disulfides som kantar porerna i Qβ via en Haddleton-Baker reaktion. Reaktionen fortsätter med bra avkastning och, lika viktigt, utan att förlora den termiska stabiliteten av partiklarna. Samtidigt genererar denna reaktion konjugation-inducerad fluorescens, som kan användas för att spåra spridningen av dessa partiklar in i celler. I detta arbete demonstrera vi konjugationen av polyetylenglykol (PEG) på ytan av Qβ genom Haddleton-Baker reaktion, som resulterar i en ljus gul fluorophore. Dessa partiklar kan sedan spåras när de tas av celler. Protokollet häri hjälper forskare generera nya fluorescerande pegylerat proteinhaltiga nanopartiklar baseras på Qβ, även om dess principer är tillämpliga på en av de många andra framställda som innehåller lösningsmedel exponerade disulfides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning
- Göra Lysogeny buljong (LB) agar och häll tallrikar12.
-
Omvandla BL21(DE3) med en pET28 plasmid som innehåller sekvensen wtQβ coat protein.
- Tina E. coli BL21(DE3) behöriga celler i ett isbad. Plats 50 μL av celler i en mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 2 μL av Plasmiden i en tub och knacka försiktigt röret. Sedan ruva på is i 30 min.
- Heat-shock cellerna för 45 s i ett vattenbad som är på exakt 42 ° C. Placera röret tillbaka i isbadet omedelbart efter värme-chockerande och inkubera i 5 min.
- Tillsätt 950 μL av LB media som inte innehåller någon antibiotika.
- Skaka kulturen på 200 rpm under 60 minuter vid 37 ° C.
- Plåt 100 μL av kulturen på LB agarplattor (med Kanamycin) och inkubera plattan över natten vid 37 ° C. Markera vita kolonier när det behövs.
-
Gör Super Optimal buljong (SOB) media.
- Autoklav två 2 L snopen Erlenmeyer-kolvar på en superdry cykel.
- I en aseptisk miljö, väg upp och tillsätt 20,0 g trypton, 5,0 g jäst extrakt, 2.469 g vattenfritt magnesiumsulfat, 0,584 g natriumklorid och 0.186 g kaliumklorid i varje kolv.
- Ta volymen till 1 L med ultrarent vatten i varje kolv och autoklav på flytande cykeln.
- När SOB media har uppnått rumstemperatur efter autoklavering, tillsätt 1 mL kanamycin (100 mg/mL) till varje liter av media och förvaras vid 4 ° C.
-
Gör 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00).
- Gör 1 M kalium monobasiskt lösning genom att lösa upp 68.045 g kalium monobasiskt i 500 mL ultrarent vatten.
- Gör 1 M kalium dibasiskt lösning genom att lösa upp 87.09 g kalium dibasiskt i 500 mL ultrarent vatten.
- Lägga till 38,5 mL kalium monobasiskt lösning och 61,5 mL av kalium dibasiskt en 1 L flaska.
- Justera pH till 7.00 om det behövs, och föra till en volym av 1 L.
-
Göra 5 – 40% sackaros övertoningar i 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00).
- I 50 mL centrifugrör, förbereda lösningar med 5 – 40% (ökar i steg om 5%) sackaros upplöst i 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00).
- Insättning 3,3 mL 5% sackaroslösning längst ned i en 38 mL runda-botten polykarbonat tub med en lång nål spruta och upprepa detta för fem andra rör.
- Noga insättning 3,3 mL 10% sackaroslösning längst ned på röret, och ta försiktigt bort nålen att inte störa övertoningen. Upprepa för de andra fem rör.
- Fortsätta att deponera 3,3 mL lager av sackaros lösningar, öka från 15% till 40% i varje rör, samtidigt vara försiktig att inte störa övertoningen.
- När du är klar täcker översidan av till övertoningar med folie och förvara vid-80 ° C.
2. redovisning av Qβ
- Torka bänk område med 1:1 blekmedel/etanol.
- Gör två 3 mL starter kulturer i en aseptisk miljö genom att lägga till enstaka kolonier av E. coli BL21(DE3) i 3 mL SOB media i en aseptisk miljö.
- Växer på en shaker vid 250 rpm i en 37 ° C och 0% relativ luftfuktighet (rH) rum över natten.
-
Inokulera förrätt kultur i SOB media:
- Ta båda 3 mL starter kulturer av shaker och, i en aseptisk miljö, häll varje förrätt kultur en av två 2 L snopen Erlenmeyer-kolvar med 1 L färska SOB media i varje.
- Placera de inokulerade mediet på en shaker vid 250 rpm i en 37 ° C och 0% rH.
- Odla bakterier på en shaker vid 250 rpm i en 37 ° C och 0% rH rum tills OD600 når 0,9-1,0.
- Tillsätt 1 mL 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) med P1000 pipett för att inducera proteinuttryck.
- Lämna media på shaker vid 250 rpm i en 37 ° C och 0% rH rum över natten.
- Ta bort media från shakern följande morgon och centrifugera det med 1000 mL flaskor på 20,621 × g för 1 h vid 4 ° C för att skörda cellerna.
-
Avlägsna supernatanten och samla cellpelleten.
- Häll supernatanten i en kolv med ca 5 mL av blekmedel att döda bakterier. Detta är avfall.
- Använd en spatel för att skrapa cellpelleten från botten av flaskan centrifug och sätta pelleten i en 50 mL centrifugrör.
3. rening av Qβ
- Återsuspendera cellpelleten med ~ 20 – 30 mL 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00).
- Kontrollera resuspension har inga bitar och lysera celler med hjälp av en microfluidizer processor enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material). Lysera celler minst två gånger för att öka avkastningen av partiklarna.
- Centrifugera det lysate i 250 mL centrifug flaskor vid 20,621 x g för 1 hr vid 4 ° C.
- Kassera pelleten och mäta volymen av supernatanten i mL. Multiplicera värdet med 0,265 och Lägg till att mängden g ammoniumsulfat supernatanten.
- Rör vid 4 ° C i minst 1 h på en uppståndelse tallrik på 200 rpm till fällningen ut proteinet.
- Centrifugera i 250 mL flaskor vid 20,621 x g för 1 h vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten med ca 10 mL 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00).
- Lägga till lika stora volymer av 1:1 kloroform/n-butanol i rå prov och mix av vortexa för några sekunder.
- Centrifugera i 38 mL rör på 20,621 × g i 30 minuter vid 4 ° C.
- Återställa övre vattenskiktet använder en Pasteur-pipett. Var försiktig att inte någon av gelen som lager som bildats mellan vattenfasen och den organiska skiktet.
- Tina sex 5 – 40% färdiga sackaros övertoningar och lasta ca 2 mL av extraktet på varje.
- Ultracentrifugen vid 99,582 x g under 16 timmar vid 4 ° C med gratis retardation.
- Skina ett ljus som avger diod (LED) ljus under varje rör och ett blått band bör bli synlig. Återställa dessa partiklar med en lång nål spruta.
- Ultrapellet partiklarna vid 370,541 x g för 2,5 timmar vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera transparent pelleten renad partiklar med 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00).
4. kvantifiering och bekräftelse av produkten
- Använda Bradford Assay för att kvantifiera den produkt13.
- Kör minska och icke-reducerande sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) för att bekräfta den produkt14.
Obs: Att minska SDS-PAGE används för att bekräfta den molekylära vikten av coat protein; icke-reducerande SDS-PAGE är att bekräfta högre ordning struktur.
5. konjugera DB föreningar på Qβ
-
Minska disulfides på Qβ.
- Lös 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) i 1 mL av ultrarent vatten för att göra en 100 x stamlösning.
Obs: Förbereda färska TCEP före minskning. - Tillsätt 200 µL av Qβ (5 mg/mL) i en mikrocentrifug rör.
- Följ genom att lägga till 20 µL av 100 x TCEP stamlösning.
- Odla i rumstemperatur för 1 h.
- Lös 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) i 1 mL av ultrarent vatten för att göra en 100 x stamlösning.
-
Nytt överbrygga reducerad disulfid använda dibromomaleimide polyetylenglykol (DB-PEG).
- Lös 0.0017 g dibromomaleimide-polyetylenglykol (DB-PEG) i 100 µL av DMF.
- Lägg till 680 µL 10 mM natriumfosfat lösning (pH 5,00).
- Lägg till minskat Qβ till lösningen av DB-PEG och observera blandning processen under en 365 nm UV-lampa. Den ljusa gula fluorescensen kan visualiseras omedelbart med en 365 nm handhållna UV-lampa vid blandning.
- Låt reaktionen fortsätter över natten i rumstemperatur (RT) på en rotisserie.
- Rena reaktionsblandningen genom centrifugal filter (COMW = 10 kDa) tre gånger med 1 x PBS 3 283 x g i 20 min vid 4 ° C.
- Övervaka konjugationen av icke-reducerande SDS-PAGE och infödda agaros gelelektrofores.
Obs: Framställda kör som intakt partiklar i native agarosgel och de separerade utifrån deras kostnad, storlek och form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dibromomaleimide derivat kan syntetiseras genom kondensation reaktionen mellan dibromomaleimide bauxit och primära aminer15. Alternativt var en mild syntetisk metod16 använder N-methoxycarbonyl aktiveras 3,4-dibromomaleimide utnyttjas här genom att reagera med methoxypolyethylene glykol (PEG) till avkastning DB-PEG (figur 1). NMR användes för att identifiera den sammansatta strukturen (figur 2). Qβ VLP är en 28 nm ikosaedriska proteinhaltiga nanopartiklar, som består av 180 identiska coat proteiner. Proteinerna som pälsen tenderar att bilda noncovalent samverkande dimerer genom sin α-spiralformade domäner med β-lakan från intilliggande päls proteiner17. Framställda tenderar att väljas för deras stabilitet vid höga temperaturer, extrema pHs, och i olika lösningsmedel kompositioner18. I det här fallet är Qβ VLP stabilare än andra RNA Fager i familjen Leviviridac på grund av 180 mellan strand disulfide obligationer ligger på de fem - och sex-kasta yxorna av symmetri på kapsid19 (figur 3). Dessa hexameric och pentamer strukturer är sammanlänkade genom disulfides, som kan visualiseras genom icke-reducerande SDS-PAGE19. Tio motsvarigheter till TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol), i förhållande till disulfides i 1 mg Qβ (0.070 µmol coat protein, 0.070 µmol disulfides) användes för att minska alla disulfides för att generera de reducerade Qβ förhoppningsvis (rQβ) vid rumstemperatur i en timme och icke-reducerande SDS-PAGE visar att alla högre ordning strukturer reducerades till monomer coat proteiner (figur 4 och figur 5A). Reaktionen på rebridge dem gjordes som en one-pot syntes, som rå rQβ admixturen lades direkt till 20 medel av en lösning av DB-PEG (1,4 µmol) i natriumfosfat (10 mM, pH 5,00, 10% DMF) efter en timme reduktion reaktion11. Det fanns observerbara ljusa gul fluorescens under 365 nm UV lampa (figur 5 d) omedelbart efter tillägg av DB-PEG. Blandningen var sedan inkuberas vid RT över natten på ett rotisserie, följt av rening med centrifugal filter (MWCO = 10 kDa) sköljning med önskad bufferten tre gånger för att ta bort överskjutande belopp av små molekyler. De Qβ-malemide-konjugat var resuspended i 10 mM natriumfosfat lösning (pH 5,00) att främja photostability. Konjugationen bekräftades av icke-reducerande SDS-PAGE under UV och coomassie blå färgning (figur 5A). Alla band visade fluorescens (figur 5A) i UV-belysning som colocalized med den coomassie blå färgning, som representerar en framgångsrik konjugering. Integriteten hos Qβ-PEG konjugat bekräftades av infödda agaros gel elektrofores och överföring elektronmikroskopi (TEM) (figur 5B, C).
Fluorescens-spektroskopi visade de excitation och utsläpp maxima Qβ-maleimide (Qβ-Μ) och Qβ-PEG vara omkring 400 nm och 540 – 550 nm, respektive (figur 6). Detta ligger i linje med kommersiellt tillgängliga GFP-uv filter set, vars excitation våglängd är 405 nm och utsläpp våglängd är 500 – 540 nm. Bekväm anpassning av de photophysical egenskaperna hos konjugat med kommersiellt tillgängliga filter anger tillstånd med Qβ-PEG som en in vitro- probe som var gjort och avbildas i figur 7. Qβ-PEG (200 nM) var inkuberas med musen Raw-264,7 celler i serumfritt DMEM medium, följt av nucleus färgning. Colocalization bilder i figur 7 visar att gula fluorescerande partiklar var uptaken av Raw-264,7 celler och kan spåras efter fyra timmars inkubation. Den unfunctionalized Qβ framställda Visa försumbar fluorescens.
Figur 1: syntetiska systematiken i DB-PEG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: NMR karakterisering. (A) 1 H NMR och (B) 13C i DB-PEG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Crystallographic struktur Qβ VLP kapsid som bearbetas i Chimera (PDB-ID: 1QBE). Två cystein rester (Cys 74 och Cys 80) visas i orange.
Figur 4: konjugering systemet för Qβ-maleimide (Qβ-M) konjugat. Qβ (0,07 µmol av disulfides) minskades med 10 medel av TCEP (0,7 µmol) på RT för en timme följt av tillägg av 20 medel av dibromomaleimide föreningar (DB och DB-PEG) (1.4 µmol). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: karakterisering av Qβ, rQβ, Qβ-M och Qβ-PEG. (A) icke-reducerande SDS-PAGE och (B) infödda agaros gel av Qβ, rQβ, Qβ-M och Qβ-PEG under UV (överst) och coomassie blå färgning (nederst). (C) TEM Mikrograf Qβ-M (överst) och Qβ-PEG (nederst). (D) fotografera av Qβ-PEG reaktionsblandningen under 365 nm UV belysning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: fluorescens spectra. Fluorescens excitation (A) och utsläpp (B) spektra av Qβ-M och Qβ-PEG i 0,1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,00). Den högsta magnetiseringen är omkring 400 nm och utsläpp högsta är runt 540 – 550 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Confocal fluorescens bilder av Qβ-PEG-konjugat i makrofagceller 264,7. Blå: NucRed Live 647 ReadyProbes reagens. Gul: Qβ-PEG. Topp bilder: samman blågula kanaler. Nedre bilderna: ljusa fält bilder. Filtrera uppsättningar: uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500 – 540 nm), Cy5. Tiden för inkubation var 4 h. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med mindre protein rening, är en unik steg i rena bacteriophage Qβ den sackaros gradient centrifugeringen. Efter steget kloroform/n-butanol utvinning renas ytterligare Qβ med 5-40% sackaros övertoningar. Under centrifugeringen avskiljs partiklar utifrån deras storlekar. Större partiklar resa till regionen högre densitet, medan mindre partiklar stannar i regionen lägre densitet. Qβ reser till den nedre tredjedelen av lutningen och förblir det medan mindre protein orenheter fångas överst i centrifugröret. Kolloidal suspensionen av Qβ visar stark Tyndall spridning i sackaros övertoningen, vilket kan ses som ett blått band när en lysdiod är lyste från undersidan. Detta band är sedan lätt att extrahera använder en lång sprutans nål. Qβ i sackaros är sedan pelleterat av ultracentrifugering, ger en tydlig pellet. Pelleten kan resuspended in i önskad bufferten eller ytterligare renas genom snabba protein vätskekromatografi (FPLC). Renheten av den resulterande partikeln kan bekräftas av SDS-PAGE.
TCEP är inte stabila i fosfatbuffert, så 100 x TCEP stamlösning bör beredas i vatten precis innan minskningen. Dessutom TCEP innehåller gratis thiol varken reagerar mot andra aminosyror, så det inte är nödvändigt att ta bort överskottet av TCEP innan du utför konjugation reaktionen. Dibromomaleimide föreningar löses i pH 5.00 natriumfosfat lösning, följt av att lägga till den reducerade Qβ. Vid pH 5,00 är cystein (minskad disulfid) protonerade, som främjar konjugation reaktionen med dibromomaleimide genom att förhindra re-oxidation tillbaka till en disulfid. Under 365 nm UV belysning, reaktionsblandningen avger gul fluorescens omedelbart efter minskad Qβ lades till DB föreningar. Annorlunda från att fästa pre synthesized fluorophores på Qβ, induceras denna fluorescens genom konjugation reaktion. Fluorophore bildas så snart de nya bindningarna mellan svavel och maleimide ring skapas. Fluorescens spektra visar att magnetiseringen (400 nm) och utsläpp (550 nm) maxima passa uv-GFP filtret i confocal Mikroskop (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-PEG var sedan inkuberas med makrofag Raw 264,7 i serumfritt DMEM. Efter fyra timmars inkubation var Qβ-PEG uptaken och punktuell gult fluorescerande fack kan visualiseras inne i cellerna. Ett faktum som måste nämnas är fluorescensen kan överföras till viss del till bovint serumalbumin (BSA) i serum eller andra cystein-rika ämnen inuti lysosomerna eller den sena endosomes av celler. Med tiden kommer detta att försvaga fluorescensen i cellen för cell tracking program; men ger det också en möjlighet för en ny design för drogen leverans system.
Sammanfattningsvis har vi visat konjugera DB-PEG på Qβ VLP genom dibromomaleimide-thiol kemi. Allt-i-ett konjugation reaktionen inte bara functionalizes disulfides längs porerna på VLP med PEG, men gör det också en fluorescently märkt proteinhaltiga nanopartiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
J.J.G. erkänner National Science foundation (DMR-1654405) och Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
