Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لجسم صفائف لتحديد التغييرات في مسارات الإشارات في مختلف النماذج الخلوية. هذه التغييرات، ناجمة عن المخدرات/نقص/فائقة-فيوليت الضوء/الإشعاع، أو عن أوفيريكسبريشن/دوونريجوليشن/بالضربة القاضية، مهمان لنماذج مختلفة من المرض، ويمكن أن تشير إلى ما إذا كان علاج تكون فعالة، أو يمكن تحديد آليات للمخدرات المقاومة.
Abstract
كثيرا ما تعامل مرضى السرطان مع لائحة شاذة من شبكات الفسفرة البروتين مع مثبطات كيناز تيروزين. معدلات الاستجابة التي تقترب من 85% من الأمور الشائعة. ولسوء الحظ، المرضى غالباً ما تصبح مقاوم للعلاج بتغيير بهم سبل توصيل الإشارات. تطبيق التنميط التعبير مع [ميكروارس] يمكن التعرف التغيرات في مستوى مرناً إجمالاً، والبروتيوميات يمكن التعرف على التغييرات الشاملة في مستويات البروتين، أو يمكن تحديد البروتينات المشاركة، ولكن نشاط توصيل الإشارة لا يمكن إنشاء مسارات باستجواب تعديلات بوستترانسلاشونال من البروتينات. نتيجة لذلك القدرة على تحديد سواء علاج من تعاطي المخدرات بنجاح أو ما إذا كانت قد نشأت المقاومة، أو القدرة على تميز أي تغييرات في مسارات الإشارات، تحديا هاما سريرية. هنا، نحن نقدم شرحاً مفصلاً لجسم صفائف كأداة يمكن أن تحدد التعديلات المنظومة في مختلف التعديلات بوستترانسلاشونال (مثلاً، الفسفرة). واحدة من مزايا استخدام صفائف جسم يتضمن إمكانية الوصول (صفيف لا تتطلب أي خبير في البروتيوميات أو معدات مكلفة)، والسرعة. توفر صفيفات استهداف مجموعة من التعديلات بوستترانسلاشونال هو القيد الرئيسي. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون النهج غير منحازة (فوسفوبروتيوميكس) أكثر مناسبة لاكتشاف الرواية، بينما جسم الصفائف مثالية للأهداف التي تميز على نطاق واسع.
Introduction
تنفيذ السريرية من مثبطات كيناز تيروزين المستهدفة (TKI) حولت علاج السرطان بتزويد الأطباء بأدوات فعالة لاستهداف البروتينات المحددة هذا التحول الورمية محرك الأقراص. تمنع هذه المركبات أو كتلة الفسفرة البروتينات التي يستهدفها تيروسين مؤنزم1،2. وقد وضعت تكيس جزئيا نظراً للتعديلات الوراثية في مفتاح مختلف الإشارات الجينات كافية لبدء السرطان بالسيارة والتقدم [مثلمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، بروتوونكوجيني بروتين تيروزين كيناز Src (SRC)، المركز-ABL، ومستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2)]3،4. تأثير تكيس على دورة الخلية5 و مسارات الإشارات الجزيئية6 يمثل تحولاً من تشتته إلى علاج السرطان مرشدين جزيئيا. أن الميزة الأساسية تكيس مقابل العلاج الكيميائي هو معدلات زيادة استجابة ومخاطر أقل سمية للخلايا السليمة7. كنتيجة لذلك، تزايد الاهتمام بالبحث والتطوير من الرواية تكيس.
الوصول إلى نتائج تسلسل الجينوم بدأت مع "مشروع الجينوم البشري"8،،من910 ويستمر اليوم مع الجيل المقبل (الجيل القادم) سرطان تسلسل الجهود المختلفة [مثلاً، "السرطان الجينوم" أطلس (تكجا)،من1112]. هذا وقد الهم العديد من المنهجيات التجريبية التي توفر المعلومات المتزامنة على آلاف جينات و/أو تقديم لقطات غير منحازة للجينات أو البروتينات عن طريق الاضطرابات البيولوجية13التضمين. منذ تنظيم وظيفة الخلوية يحدث على مستويات متعددة، من نسخ جينات لتعديل بوستترانسلاشونال للبروتينات ونشاطهم، فهم كامل للأحداث التي وقعت في السيطرة على وظيفة الخلوية سوف وفي نهاية المطاف تتطلب تكامل البيانات من قراءات البيولوجية المختلفة. القدرة على رصد مستويات الرنا الرسول (مرناً) الآلاف من الجينات مع قرار خلية واحدة جين زادت القدرة على جعل استنتاجات حول وظيفة الجينات والتفاعلات على نطاق الجامعة-الجينوم. مع ذلك، سيتم تفسير صفائف التعبير الجيني دائماً ناقصة أصلاً دون تكامل المستويات الأخرى للتنظيم: إلا وهي مستويات التعبير البروتين، والدول تعديل البروتين، والبروتين بوستترانسلاشونال تعديلات (الفسفرة، أوبيكويتيليشن، مثلايشن، إلخ). وهنا يصف لنا فائدة المصفوفات الأجسام المضادة كوسيلة استجواب بوستترانسلاشونال إدخال تعديلات على مكونات إشارات هامة كدالة لمختلف الظروف في تجربة واحدة14،15، 16.
يمكن أن تستخدم صفائف جسم والرمات للتمييز، وتحليل التغيرات في ممرات توصيل الإشارات16. وهذه يمكن أن تنشأ من تعديل الوراثي أو علاجات من خطوط الخلايا مع مثبطات كيناز، وتشريعات، والإجهاد الناجم عن المجاعة الحرمان أو نقص أو مصل الجلوكوز. ملاحظة، ومقاومة المخدرات أو جين معين حتى-أو downregulation يمكن أيضا أن يسبب تغييرات في ممرات توصيل الإشارات17.
المقاومة للعقاقير، وعلى سبيل المثال، يمكن أن تنشأ من الطفرات الهدف المخدرات لتجنب حساسية. في سرطان الرئة، ويعرف بالطفرات EGFR تجعل السرطان يغيرها إلى تكيس معينة، ولكن أكثر عرضه للآخرين. يمكن تنشيط إشارات المسارات البديلة بناء على الطفرة17. كتطبيق أوسع نطاقا للتعرف على سبل توصيل الإشارات تشارك في المقاومة ونقص، و ما إلى ذلك، توفر صفيفات والرمات جسم ثاقبة أكثر، وبالتالي فهم، تنطوي الآليات.
التكنولوجيات التي تسمح بتقييم التعديلات البروتين تمثل عنصرا هاما في نظم علم الأحياء لأنها غالباً ما تخدم وظيفة تنظيمية، مثل تحوير نشاط إنزيم أو التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات. وتتجلى أهمية التعديلات بوستترانسلاشونال هو بدور الفسفرة البروتين في توصيل الإشارات خارج الخلية تسبب ما يقرب من جميع مسارات18. تقليديا، تحديد مؤنزم أو حالة الفسفرة من البروتينات يمكن أيضا أن تحددها تحليل لطخة غربية، خاصة إذا كان الباحث مهتما فقط 1-5 أهداف. ولكن البقع الغربية هي انتقائية جداً ويمكن أن يكون متحيزا نحو معرفة مسبقة وقد يغيب عن أهداف هامة نتيجة لذلك. توفير array(s) جسم قراءات الإنتاجية المتوسطة لأهداف متعددة عن طريق تضمين مختلف التقاط أجسام [الخاصة بعموم فوسفوريلاتيد tyrosine(s)، أوبيكويتين المضادة، إلخ] في مصفوفة صلبة (مثلالزجاج أو النيتروسليلوز). الأجسام المضادة الثانوية تقديم معلومات عن بروتينات محددة في شكل أليسا على أساس ساندويتش (الشكل 1). هذا التحليل يصبح أكثر قوة وذات الصلة بالمزيد من الأهداف ذات الأهمية أو المعرفة المسبقة هو مقيد15. والرمات-الصفائف القادرين على نطاق أوسع كما يمكن مقارنة الفسفرة، فضلا عن المبالغ العامة من بروتين مجموعة أوسع من الأهداف في تجربة واحدة وتوفير إجراء تقييم كمي تحسنت بشكل ملحوظ عبر الطيف الكتلي. هذا الأسلوب لا ينطبق على تحديد مواقع الفسفرة جديدة أو لم تكن معروفة سابقا.
يمكن استخدام البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي على نطاق واسع لتحديد مواقع محددة الفسفرة من البروتينات19. على الرغم من أن هذا الأسلوب يمكن تعداد آلاف من الأحداث بوستترانسلاشونال، فإنه يتطلب أجهزة مكلفة وأنابيب تجريبية مكرسة خبرة حسابية التي بعيدة عن متناول معظم الباحثين.
توفر صفيفات جسم قراءات متزامنة على قراءات البروتين المختلفة16. قد تكون هذه التغييرات في أوبيكويتيليشن بروتين (ubiquitin صفيف) أو الفسفرة. والميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا صفيف أنه يوفر معلومات هامة عن الحالة البيولوجية لمختلف المسارات البيولوجية المرتبطة بالخلية هام المعلمات (البروتين 53 كاتشين، p53، ومستقبلات تيروسين مؤنزم ومسارات داخل الخلايا) في نفس الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، من الممكن للجمع بين مختلف أنواع الصفيف لزيادة تغلغل التحليل (مثلاً، المبرمج وأوبيكويتين والفسفره). هذه القدرة على الجمع بين صفائف متعددة لتقييم مختلف التعديلات بوستترانسلاشونال في عدة عينات في وقت واحد في طريقة الوقت--وفعالة من حيث التكلفة التي لا تتطلب أجهزة معينة أو خبرة من ميزة كبيرة في القضية جسم صفائف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-البروتين الاستخراج
- لوحة 5 × 106 خلايا على لوحة زراعة الأنسجة 10 ملم (أو قارورة) في غطاء زراعة الأنسجة. عد الخلايا في وقت الطلاء مع عداد خلية تلقائي أو هيموسيتوميتير. وبدلاً من ذلك، تقدير عدد الخلايا.
- شطف الخلايا المزروعة في لوحة 10 ملم (أو قارورة) دقة 3 x مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (pH = 7.4). تأكد من إزالة كل برنامج تلفزيوني قبل إضافة المخزن المؤقت تحلل.
ملاحظة: يتم عادة توفير المخزن المؤقت تحلل مع عدة. إذا لم يكن كذلك، ثم استخدام مخزن مؤقت بالانزيم راديويمونوبريسيبيتيشن (RIPA) أو أي الأخرى خلية تفسخ المخزن المؤقت الذي يحتوي على خليط مثبطات البروتياز والفوسفاتيز. - 1 × 107 خلايا/مل من الخلايا في المخزن المؤقت لتحلل بإضافة المبلغ الصحيح للمخزن المؤقت إلى الخلايا وكشط الخلايا مع مكشطة خلية في المخزن المؤقت لتحلل. (مثلاً، لخلايا هيلا ومياباكا-2، استخدم 600 ميليلتر كل لوح 10 سم).
- "الماصة؛" صعودا وهبوطاً (حوالي 10 x) وأنه نقل إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
- احتضان ليساتيس لمدة 30 دقيقة على 4 درجة مئوية، ويفضل أن يكون ذلك في الروك/شاكر. اضغط عن طريق حقنه بإبرة ز 27 ل x 10 لضمان حدوث اضطراب cell membrane(s) سليم. وبدلاً من ذلك، sonicate. تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية أو استخدامها فورا.
- الطرد المركزي في س 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ونقل المادة طافية في أنبوب نظيف 1.5 مل.
- كوانتيتاتي كمية البروتين الكلي ب مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك20 أو ما يعادلها كلوري أو برادفورد والاستمرار على الأقل 50 – 400 ميكروغرام. استخدام البروتينات فورا أو قاسمة وتجميد/مخزن لهم في-70 درجة مئوية (تجنب دورات تجميد أذاب متعددة).
2. البشرية Phosphokinase الصفيف
- إحضار جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء (لحوالي 1 ح).
ملاحظة: يتم تضمين كافة الكواشف وملابس بلاستيكية في هذه المجموعة. - إعداد جميع الكواشف الطازجة (مجموعة المخازن المؤقتة) قبل البدء في الإجراء اتباع إرشادات الشركة المصنعة (اعتماداً على اختيار الأهداف/صفائف، الإرشادات قد تختلف بشكل طفيف).
- تشكيل الكوكتيل جسم الكشف في 100 ميكروليتر من المياه أو اتبع إرشادات الشركة المصنعة يجب أن تختلف لأنبوبة الاختبار 1.5 مل المقدمة.
- إعداد 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي بتمييع 40 مل 25 x المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في 960 مل مياه. ومزجها بعكس.
ملاحظة: البلورات تذوب في درجة حرارة الغرفة. المخزن المؤقت الذي قد يتحول أصفر مع مرور الوقت ولكن سوف لا تزال تعمل. - "الماصة؛" 1 مل من الصفيف المخزن المؤقت 1 كل بئر صينية متعددة 8-جيدا (أو 2 مل في علبة متعددة 4-جيدا).
- مع ملاقط نصيحة مسطحة، إزالة الأغشية صفيف بين الأوراق الواقية ووضعها في الآبار. تأكد من الأرقام على الغشاء تواجه صعودا.
ملاحظة: عند غمر، سوف تختفي الصبغة على الغشاء. - تغطي صينية بغطاء واحتضان على شاكر منصة هزاز لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذا هو الخطوة حظر الغشاء. - وخلال فترة الحضانة، إعداد العينات البروتين. إضافة 50-100 ميكروغرام من البروتين الكلي. تمييع، وجود وحدة تخزين الحد أقصى من ميكروليتر 334، مع تحلل المخزن المؤقت لوحدة تخزين نهائي 1 مل.
ملاحظة: 50-100 ميكروغرام من البروتين الكلي وعادة ما يكفي. - نضح الصفيف المخزن المؤقت 1 بعناية واحتضان الأغشية مع 1 مل العينات بين عشية وضحاها في 2 – 8 درجة مئوية في شاكر منصة هزاز.
ملاحظة: لا تعمل باللمس/الصفر الأغشية. - تغسل في اليوم التالي، الصفيف بإزالة كل مجموعة بعناية ووضعها في حاويات بلاستيكية فردية (حوالي 8 × 11 سم2) مع 20 مل من س 1 يغسل المخزن المؤقت. غسل الأغشية 3 × 10 دقيقة على منصة هزاز في 1 × الغسيل المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة.
- "الماصة؛" 20 ميكروليتر من جسم المعاد تشكيلة كوكتيل من الخطوة 2، 3 إلى 1 مل 1 × الصفيف المخزن المؤقت 2. أضف 1 مل من هذا الحل لكل بئر 8 لاستخدامها.
- بعناية إزالة الأغشية من علب المياه والصرف الصحي. لطخة على الحافة السفلي على مناشف ورقية إزالة أي مخزن مؤقت الغسيل الزائدة وتحويلها مرة أخرى إلى علبة الورق التي تحتوي على زجاجات الأجسام المضادة. تغطي صينية بالغطاء واحتضان من أجل ح 2 في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز. دقة شطف الصواني المستخدمة مع dH2س وتجفيفها للاستخدام في وقت لاحق.
- بعناية إزالة كل الصفيف ووضعها مرة أخرى في الحاويات البلاستيكية الفردية نظيفة (حوالي 8 × 11 سم2) مع 20 مل من س 1 يغسل المخزن المؤقت. أغسل منهم 3 × 10 دقيقة مع المخزن المؤقت الغسيل على منصة هزاز في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع Streptavidin-برنامج الصحة الإنجابية (تقدم مع kit) أو 1:1,000 صبغة الفلورسنت ستريبتافيدين (للكشف عن أكثر من كمية) في 1 × الصفيف المخزن المؤقت 2 في أنبوب اختبار 15 مل.
- العودة الأغشية في الأطباق 8-كذلك يتضمن الحل HP واحتضانها لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز (في حالة استخدام الفلورية، يلتف الدرج في رقائق الألومنيوم لتجنب أي التعرض للضوء).
- إزالة المخزن المؤقت الزائدة عن طريق وضع الغشاء بين قطعتين من 5 مم من ورق م 3. للتصوير بتصوير فيلم/تشيميلومينيسسينت الأشعة سينية، احتضان الأغشية المجففة مع حل الكشف عن برنامج الصحة الإنجابية (مزيج الاثنين الحلول تشيميلومينيسسينت 1:1) لمدة 3 دقائق ووضع الغشاء في حامية ورقة بلاستيك الشفاف.
ملاحظة: كما يمكن وضع membrane(s) المجفف في تصوير فلوري الكشف عن إشارة الفلورية؛ التقليل إلى أدنى حد التعرض للضوء للغشاء قبل التصوير. لإجراء تقييم كمي لملفات الفيلم أو التصوير بالأشعة السينية، تجنب التعرض المفرط. معظم تشيميلومينيسسينت/فلوري التصوير يكون دالة لتجنب تشبع للإشارة.
3-بيانات التحليل
- تحميل إيماجيج، معالجة البرنامج21، صور وتثبيت البرنامج.
- فتح إيماجيج بواسطة النقر المزدوج على 'رمز ImageJ'. حدد الصورة ليتم تحليلها بواسطة النقر فوق 'ملف' في شريط القائمة، ثم حدد 'فتح' من القائمة المنسدلة وتصفح ملفات الكمبيوتر لصورة الفائدة. انقر فوق الملف لفتحه.
- عكس الصورة للتحليل (بقع سوداء على خلفية بيضاء للبقع البيضاء على خلفية سوداء) بالنقر فوق 'تحرير' في شريط القوائم واختيار 'عكس' من القائمة المنسدلة.
- حدد الرمز 'البيضاوي' من شريط الأدوات (الخيار الثاني في شريط الأدوات إيماجيج). رسم شكل دائرة/بيضاوي بالنقر فوق الصورة (الصليب الأسود) وتحريك الماوس. ضبط الحجم/شكل الدائرة/البيضاوي لتطويق النقاط على وصمة عار دوت.
- انقر فوق 'تحليل' في شريط القائمة، ثم حدد 'تدبير' من القائمة المنسدلة لفتح نافذة جديدة تلقائياً مع القيم لمنطقة محددة (منطقة، يعني والحد الأدنى والحد الأقصى).
- نقل منطقة دائرية بواسطة سحب الدائرة من المركز (ضع نقطة حق السهم في الوسط) ووضعه حول منطقة القياس (نقطة) القادم. قياس جميع البقع من اهتمام ومراقبة إيجابية والمراقبة السلبية والخلفية للتحليل.
ملاحظة: الرقابة السلبية هو برنامج تلفزيوني والخلفية هو جزء من الغشاء دون أي بقعة (سوف تفعل أي جزء) وإيجابية عنصر التحكم عنصر تحكم توفيرها من قبل الشركة المصنعة. - حدد نقاط المراقبة السلبية برنامج تلفزيوني وطرح القيمة من كل بقعة. متوسط كثافة لكل زوج من البقع مكررة تمثل كل مستقبلات التيروزين كيناز (راديو وتلفزيون كوسوفو). يمكن أن تتصل كل متوسط كثافة عنصر التحكم لحساب التغير حظيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقيق في تأثير المقاومة TKI على سبل توصيل الإشارات في خطوط الخلايا، حللت العينات الأربع. نموذج عنصر تحكم واحد (H3255r1) و 3 خطوط الخلايا TKI المقاوم (H3255r2-4) (الشكل 2) تتصل بالقالب أضداد موضعية (الشكل 3). أعدت جميع العينات 4 باستخدام هذا البروتوكول. تم اختيار ستة فوسفوبروتين مع النشاط التفاضلية لمظاهرة تحليل المصفوفات جسم (الشكل 4). خريطة الحرارة (الشكل 5) تنص قراءات شبه كمي عن التغييرات في الفسفرة بروتين من البروتينات توصيل إشارة هامة. يمكن إكمال التحقق نتائج مصفوفة بتنفيذ نهج متعامد، مثل النشاف الغربية.
رقم 1: التخطيطي صفائف جسم شبه كمي. صفائف جسم تستند إلى مبدأ المناعة ساندويتش، حيث مجموعة من الأجسام المضادة لالتقاط مضمن في الزجاج أو دعم النيتروسليلوز. ليساتيس الخلية هي المحتضنة مع الغشاء ويتعرضون في الصفيف للأجسام المضادة الثانوية. يمكن الحصول قراءات شبه كمي من ركائز تشيميلومينيسسينت، أو لمزيد من المعلومات الكمية، التصوير على أساس الفلورسنت. قد تتم معالجة أي إشارات مستمدة من أفلام أو صور TIF بقياس كثافة وحساب إضعاف-التغييرات لكل البروتين. تستغرق العملية كاملة حول اليوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مثال على جسم والرمات صفيف وضعت مع جهاز التصوير. يتم الكشف عن بقع مضيئة في التكرارات (المكانين الواحدة والهدف). عينات ونقاط مراقبة إيجابية تبين كثافة متفاوتة. سيظهر هنا هو المقارنة بين H3255r1 TKI الحساسة و 3 صفائف عينة (H3255r2-4) مقاومة، كل فصل في غشاء A و b الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: خريطة للبقع الصفيف. ويربط الخريطة البقع الأهداف الأجسام المضادة. المواقع المسماة أ-ز عمودياً و 1-10 أفقياً. مراقبة إيجابية (برتقالي) موجودة على جميع الأغشية وعادة ما تكون موجودة في الزوايا. سلطت الضوء على مراقبة برنامج تلفزيوني السلبية باللون الأسود بينما يتم تمييز البقع عينة باللون الأصفر. لكل صفيف، ترد قائمة بالأجسام المضادة أيضا لتحديد الهوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مثال على تحليل البيانات- التحكم (A) كثافة البقع ذات الاهتمام، والإيجابية، والخلفية تم تحديدها على الخريطة وقياس لجميع العينات. (ب) نسبة كثافة (شدة بقعة مع كثافة الخلفية تطبيع كثافة السيطرة إيجابية وإزالة) يتم عرض في مخطط شريطي لعدد قليل من المرشحين الذي تم اختياره. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خريطة الحرارة من الإشارات التفاضلية في H3255 الحساسة (r1) وخطوط مقاومة (r2-4) الخلية. واستخدمت كثافة بقعة نسبي لإنشاء مخطط حرارة لمقارنة التغيرات في كريب، P53، عكة، و STAT5 في جميع العينات 4. يتم عرض أية مستويات عالية في ظلال مختلفة من الأحمر بينما يتم عرض أي مستويات أدنى في الزرقاء22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النهج التي تجمع بين العديد من قراءات البيولوجية تمثيلات طبيعتها أكثر دقة الأجهزة الخلوية في تجربة أداء. ظهور جسم والرمات صفائف تمكن وصف سريع للنمط التعديلات التي قد تكون مفيدة أكثر من حالة تعديل أي البروتين وحيد. سير العمل العامة لتطبيق المصفوفات والرمات جسم يستند إلى تعديل في سيرين، ثريونين، أو تيروزين. وركز هذا المثال وصف التغييرات المرتبطة بالمقاومة للعلاج من الإصابة بسرطان الرئة. هو المسوّغ الرئيسي لهذا التطبيق أن الفسفرة البروتين يلعب دوراً محوريا في توصيل الإشارة في العديد من السرطانات البشرية18، وهذا الأسلوب سوف تكون قابلة للتحويل إلى نظم أخرى. التقلبات الفسفرة في السرطان وعادة ما ينطوي هايبراكتيفيشن كيناز تيروزين، ونتيجة لذلك، ركائز فوسفوريلاتيد (غالباً ما كيناز فوسفوريلاتيد السيارات نفسها) هذا على مستويات أعلى من العادي إعدادات الفسيولوجية، وتبعاً لذلك، يمكن أن تشكل جزءا كبيرا من فوسفوبروتين في خلية سرطان. هذه المستويات أعلى من الفسفرة سوف تسهل الكشف. وعلاوة على ذلك، الفسفرة البروتين له أهمية طبية منذ الفسفرة تيروزين الشاذة سمة مميزة للكثير من أنواع السرطان23. وبالإضافة إلى ذلك، أن هذا الأسلوب قابل للتحقيق في النظم البيولوجية الأخرى التي تستخدم الفسفرة، العديد من الميزات الموضحة هنا يمكن بسهولة تعديل للتركيز على أنواع أخرى من صفائف بروتين (ubiquitin، المبرمج، إلخ).
والرمات-جسم صفائف تستخدم على نطاق واسع لتحديد أي مسارات إشارة المعنيين، أما كأسلوب استكشافي أو التحقق من مسار معين واحد. جعل شركات مختلفة من مجموعات لكل حالة الفسفرة والمستويات الإجمالية للبروتينات. بينما تحليل التفاعل المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي [بولمرس] أو [ميكروارس] أكثر بكثير من الكمية، يأخذون مستويات مرناً فقط في الاعتبار، ولا يمكن التصدي لترجمة، فضلا عن التعديلات بوستترانسلاشونال. وبصرف النظر عن الفسفرة، يمكن أيضا معالجة تعديلات أخرى بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن أو أوبيكويتيليشن أو صفائف24،25.
أحد العوامل الهامة في الاعتبار قبل البدء في صفائف جسم أن تبدأ مع خلايا صحية والفاصل بنشاط. نقص، والأكسدة، والتهاب قد تنتج التغيرات في ممرات توصيل الإشارات26 يمكن أن تحرف النتائج وتقديم تفسير إذا تعامل غير صحيح. يمكن أن يعزى هذا الإجهاد لصياغة وسائل الإعلام أو لطلاء الخلايا كثيرة جداً أو قليلة جداً، أو لتعريض الخلايا للبيئات سيئة التنظيم، أو لعلاج السيطرة مقابل sample(s) بشكل مختلف قليلاً. وقد لاحظنا أيضا اختلافات كبيرة في عدد مرور أو الوقت في ما بعد تذويب الثقافة. المفتاح لتجنب هذه المتغيرات أدخلت مصطنعة إبقاء كل شيء بين العينات متسقة قدر الإمكان. لا تقم بتغيير النسبة المئوية FBS أو وسائط التخزين، إلخ، خلال التجربة.
كما ينبغي تحليل البيانات قبل البدء في تجربة صفيف. إجراء تحليل تشيميلومينيسسينت صفيف فقط نصف الكمية، ومداه الحيوي هو تقريبا واحد الضخامة، بينما نهج فلورسنت زيادة النطاق الديناميكي لقرابة عامين أوامر من حجم. الجدول الذي يتم تنفيذ صفائف يعتمد على السؤال بيولوجية معينة (ق). فمن الممكن لتحليل واحد خط الخلية الخاصة بمقاومة من الفائدة لجميع التغييرات في التعديلات بوستترانسلاشونال مقارنة بخط الخلية الأصلي أو للتركيز على مسار خاص واحد لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا مقاومة. ينبغي النظر في التوسع في هذا النهج في مراحل التخطيط المبكرة. وعلاوة على ذلك، ينبغي دائماً أكدت نتائج مجموعة جسم بطريقة ثانوية في عينات جديدة و/أو ليساتيس نفس. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية للتحقق من التغييرات التي أدخلت على أهداف محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للدعم المالي السخي من "لورانس جيه أليسون معهد تحويلية الطب" من المؤتمر الصومالي الموحد (هدية لديفيد اجوس). ونحن نقدر الدعم الذي بيمير الخريف وليزا فلاشنير التي تؤدي إلى توليد ونشر هذه المخطوطة. ونحن نشكر نغ لورا للدعم الإداري لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
