Summary
在这里, 我们提出了一个有效的单步纯化活性无标签人的协议十-十一 translocation-2 (TET2) 5-甲基胞嘧啶酶使用离子交换色谱法及其测定液相色谱-串联质量基于质谱 (LC-ms) 的方法。
Abstract
5-甲基胞嘧啶 (5mC) 介导的表观遗传转录调控在真核发育中起着至关重要的作用。这些表观遗传标记的去甲基化是通过顺序氧化十-十一易位芳香烃 (TET1-3), 其次是胸腺嘧啶 DNA glycosylase 依赖基础切除修复。由于基因突变或其他表观遗传机制, TET2 基因的失活与不同癌症, 特别是造血恶性肿瘤患者预后较差有关。在这里, 我们描述了一个有效的单步纯化酶活性无标签人 TET2 酶使用阳离子交换层析。我们进一步提供液相色谱-串联质谱 (LC ms/ms) 方法, 可以分离和量化四个正常的 DNA 基础 (a, T, G 和 C), 以及四个改性胞嘧啶碱基 (5-甲基, 5-羟甲基, 5-甲酰基, 和 5-羧基)。本试验可用于评价野生型和突变 TET2 芳香烃的活性。
Introduction
在 CpG 二核苷酸内胞嘧啶碱基的 C5 位置是哺乳动物基因组1中主要的甲基化部位 (5mCpG)。此外, 一些最近的研究发现在非 CpG 站点 (5mCpH, 其中 H = a, T, 或 C)2,3的广泛 C5 胞嘧啶甲基化 (5mC)。5mC 修饰在内源座子和基因促进剂3、4、5中用作转录消声器。5mC DNA 甲基化在 X 染色体失活、基因印迹、核重编程和组织特异基因表达5、6、7等方面也起着重要作用。C5 位置的胞嘧啶甲基化是由 DNA 甲基转移酶进行的, 而这些酶的突变导致重大发育缺陷8。5mC 标记的去除由 TET1-3 5mC 氧化酶9、10启动。这些春节家庭芳香烃通过连续氧化步骤11,12,13转换5mC 到 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxylcytosine (5caC)。最后, 胸腺嘧啶 DNA glycosylase 替代5fC 或5caC 到未修改的胞嘧啶使用基础切除修复途径11。
人类TET2基因被确定为在不同的造血恶性肿瘤, 包括骨髓增生异常综合征 (mds)14,15,16, mds-骨髓增生性肿瘤经常突变的基因 (mds-mpn) 和急性髓系白血病 (AML) 源自 mds 和 mds-MPN16。与野生型 (wt) TET214相比, TET2 突变患者骨髓 DNA 的5hmC 修饰水平较低。一些小组已经开发出 TET2-knockout 小鼠模型, 以阐明其在正常造血和髓样转化中的作用17,18,19,20。这些在 TET2 基因突变的小鼠最初是正常和可行的, 但表现出不同的造血恶性肿瘤, 因为他们的年龄导致他们的早期死亡。这些研究表明 wt-TET2 在正常造血分化中发挥的重要作用。在这些小鼠模型中, 杂合造血干细胞 (TET2+/造血干细胞) 和纯合 TET2造血干细胞在 wt-TET2 造血谱系中具有优于纯合造血干细胞重新填充的竞争优势, 同时 TET2TET2 造血干细胞开发了多种造血恶性肿瘤17,18。这些研究表明, TET2 酶的 haploinsufficiency 改变了造血干细胞的发展, 导致了造血恶性肿瘤。
与 TET2 基因突变的小鼠相似, 大多数白血病患者 haploinsufficiency TET2 酶活动的表现。这些主要杂合体细胞突变包括帧移位和废话突变分散在整个 TET2 基因体内, 而错义突变是最聚集在酶领域12。到目前为止, 文献中很少有关于 wt 和 mutant-TET2 的表征, 主要是由于 TET2 酶的生产和测定21的困难。在这里, 我们报告了一个简单的单步纯化原生 TET2 酶使用离子交换色谱法。进一步, 对 TET2 酶的酶活性进行了优化, 并进行了定量的 LC-ms/ms 测定。
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Protocol
1. 无标记人 TET2 酶的克隆和纯化
- 使用特定于站点的重组技术将人类 TET2 酶 (TET2 1129-1936、Δ1481-1843) 克隆到 pDEST14 目标向量中, 如前所述22。
注意: 以前的研究表明, C 终端 TET2 酶 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) 域是最小催化活动域21,23。为了用 pDONR221 向量表达未标记的 TET2 酶域, 在 PCR 过程中将发光达尔加诺和科扎克序列合并到正向底漆中 (表 1)。 - 对于细菌转化, 将含有未标记人类 TET2 酶 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) 的重组 pDEST14 表达载体的1µL 添加到1.7 毫升管中具有化学能力的大肠杆菌µL (BL21) 细胞的 100 DE3。将混合物保持在冰上至少15分钟后, 热休克在42摄氏度, 三十年代在一个水浴。
- 热休克后立即将细胞放回冰上至少2分钟。在此之后, 添加250µL 的超级最佳汤与阻遏抑制 (s.o. C 介质) 到细胞。在振动筛中孵育1小时的细菌细胞37摄氏度。
- 孵育后, 通过离心管在 9000 x g 上向下旋转细胞, 1 分钟. 通过移液去除70% 上清液, 并将颗粒在左侧的介质中溶解。
- 在含有100µg/毫升氨苄青霉素的 Luria 汤 (LB) 琼脂板上传播细胞悬浮液。在37摄氏度下孵育16小时的板材。
- 选择一个孤立的殖民地, 并接种它到10毫升的 LB 氨苄青霉素培养基在一个50毫升管。在摇床上孵育37摄氏度的管子过夜。在此之后, 使用100µL 的文化从50毫升管接种100毫升的 LB 氨苄青霉素培养基。在 180 rpm 的振动筛上孵育37摄氏度的烧瓶, 并将其用作初级文化。第二天, 使用6毫升每一个主要文化接种15烧瓶, 每个包含600毫升 LB 氨苄青霉素培养基。现在, 在 180 rpm 的振动筛上孵育15瓶37摄氏度。
注: 用于验证转化克隆, 执行 DNA 测序或限制消化与分离质粒 DNA。 - 要检查细菌培养的密度, 使用分光光度计测量其外径600 。当培养达到0.8 在 OD600的密度, 诱导 TET2 蛋白的表达300µL 1 M (最终浓度0.5 毫米在600毫升) IPTG 在每个烧瓶和进一步增长的文化 16 h 在17摄氏度。
- 16小时后, 将细菌培养转移到离心瓶中。离心的细菌培养表达 TET2 酶在 5250 x g 45 分钟. 使用细菌颗粒进行 TET2 纯化。
注: 在冰上或4摄氏度执行所有剩余的蛋白质纯化步骤。 - 在100毫升50毫米 MES (2-(n-吗啉代) 乙烷磺酸) 缓冲液中重悬细菌颗粒, pH 6 和油脂实验为 5 x 三十年代在功率20与六十年代冷却间隔。
- 将裂解液在 5250 x g 处旋转45分钟. 收集含有可溶性 TET2 酶的上清, 并在 FPLC 系统上加载前通过 0.45-µm 过滤器。
注意: 在这些实验中, TET2 酶是非常稳定的, 但如果需要一个蛋白酶抑制剂鸡尾酒包含1毫米苯甲脒盐酸, 1 毫米 phenylmethylsulphonyl 氟 (PMSF) 和0.5 毫米 110邻菲咯啉可以添加到细胞裂解防止 TET2 酶的降解。避免在抑制剂鸡尾酒中使用 EDTA 或 EGTA, 因为这些可能会干扰以下阳离子交换色谱。 - 将30毫升强阳离子交换树脂包装成 FPLC 柱。平衡使用 FPLC 系统, 在恒定流速为0.3 毫升/分钟的情况下, 将10个体积的洗涤缓冲液 (50 mM MES 缓冲器, pH 值 6) 的柱带到该列上。
- 将澄清的裂解液加载到预平衡柱上, 然后用∼10的洗涤缓冲层洗涤, 直到水流变得清晰。
- 洗脱 TET2 使用0-100% 梯度从洗涤缓冲液到洗脱缓冲液 (50 毫米 MES 缓冲液, pH 6, 1 M 氯化钠) 在15床卷, 然后保持在100% 洗脱缓冲液两床卷。
注: 收集样品 (100 µL 每个) 的细胞裂解前后柱加载连同所有洗脱馏分和分析10% 解决 SDS 页。 - 将含有 TET2 蛋白的馏分池, 冷冻干燥, 溶解酶托盘在10毫升水和存储在-80 摄氏度。
2. 5mC 氧化 TET2 酶
- 以3µg 的基底 (25-去甲基化双绞线 DNA,表 2) 执行所有的三级反应。
- 添加100µg 纯化 TET2 酶在50µL 总反应缓冲液中含有50毫米 HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2 毫米 2OG (2-氧代戊/α-α-), 2 毫米抗坏血酸和孵育37摄氏度 1 h21。
- 淬火 TET2 催化氧化反应, 5 µL 500 毫米 EDTA。
- 淬火 TET2 反应后, 通过使用寡核苷酸纯化柱将 DNA 与 TET2 反应混合物分离, 制备 LC ms/ms 分析样品。
- 将100µL 的寡核苷酸结合缓冲液添加到55µL 淬火反应中。
- 在此之后, 将400µL 100% 乙醇添加到混合物中。通过寡核苷酸结合列传递此混合物。
- 用750µL 洗涤缓冲液和洗脱在20µL 水中洗涤束缚 DNA。
- 消化分离的 DNA 与2个单位的 DNase I 和60单位的 S1 核酸酶在37摄氏度 12 h 生产单个核苷-monophosphates。
- 消化后, 在样品中加入2单位犊牛肠道碱性磷酸酶 (巴佛利山), 在37摄氏度下孵育 12 h, 从核苷-monophosphates 中除去末端磷酸盐组, 获得核苷。
- 使用以下所述的 LC-ms/ms 方法量化所有核苷, 特别是修改过的胞嘧啶。
3. 定量 LC-ms/ms 为基础的检测开发
- 准备100µM 所有改性胞嘧啶核苷 [5-甲基-2′-脱氧胞苷 (5mdC), 5-羟甲基-2′脱氧胞苷 (5hmdC), 5-甲酰基2′脱氧胞苷 (5fdC), 和 5-羧甲基2′脱氧胞苷 (5cadC)] 和正常的 DNA 基 (腺嘌呤,胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤) 在 HPLC 级水中用于发展 LC ms/ms 方法。
- 通过在 EMS 扫描模式下以10µL/分钟的流速在质谱仪中一次注入库存解决方案, 优化核苷相关的 ms/ms 参数。优化以下参数: 去聚电位 (DP)、入口电位 (EP)、碰撞细胞入口电位 (CEP)、碰撞能量 (CE) 和碰撞细胞出口电位 (CXP), 用于每个 DNA 核苷使用自动定量优化软件的功能。
- 通过在0.3 毫升/分钟的流速下注入10µL 的库存溶液, 在溶剂 a 为 10 mM 醋酸铵 (ph 4.0) 和溶剂 b 为20% 乙腈 (ph 10) 的情况下, 优化与源相关的 ms/ms 参数。优化以下参数: 窗帘气体 (电流): 10-50, 温度: 0-600 摄氏度, 气体流量 1 (GS1): 0-50, 气体流量 2 (GS2): 0-50, 碰撞活化分离 (CAD): 低-中高, 离子喷涂电压 (is): 4000-5500 为每个 DNA 核苷使用手动在 FIA (流动注射分析) 模式下软件的定量优化功能。
- 要分离所有八种 DNA 核苷, 请使用以下梯度进行液相色谱: 0% 溶剂 b (0-2 分钟), 0-20% 溶剂 b (2-5 分钟), 20-60% 溶剂 b (5-9 分钟), 60-0% 溶剂 b (9-10 分钟), 然后平衡以溶剂 a 为5分钟, 流速为 0.3%C18 柱上的毫升/分钟 (粒径: 5 µm, 孔径: 120 埃)。
- 使用最佳 ms/ms 参数 (步骤3.2 和 3.3) 加上上述液相色谱梯度 (步骤 3.4), 确定响应线性度、检测极限 (LOD) 和量化 (LLOQ) 的下限 (使用100µM 标准混合物的双倍串联稀释, 包含所有八核苷。为所有八 DNA 核苷绘制标准曲线。
- 使用 LC ms/ms 方法和标准曲线检测和量化在步骤 2.4中产生的所有核苷, 特别是修改后的胞嘧啶。
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Representative Results
芳香烃5mC 在 DNA 中的动态修饰在表观遗传转录规则中起着重要作用。TET2 酶在不同的造血恶性肿瘤12经常变异。为了研究 TET2 酶在正常发育和疾病中的作用, 我们克隆了其最小催化活性域, 而没有任何亲和标记进入 pDEST14 向量22。在细菌大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞中, 通过 SDS-页分析, 在∼5% 的总可溶性蛋白中生成无标记 TET2 酶。由于 TET2 的催化域具有相对较高的等电点 (∼7.49), 与大多数原发大肠杆菌蛋白24、25、26相比, 利用阳离子进行高效纯化过程建立了交换层析。这种纯化在一个步骤中产生 > 90% 纯 TET2 酶 (图 1)。
为了分离和量化不同的 deoxycytidines 衍生物和其他四个天然 DNA 基 TET2 酶反应后, 一个敏感的 LC ms/ms 为基础的检测被优化。液相色谱法使用反相 C18 柱。使用包含所有核苷的混合物的连续稀释度绘制标准曲线 (图 2)。在实验过程中描述的用于液相色谱的梯度能够解决所有八核苷 (图 3)。表 3描述了所有八核苷的 LC 保持时间 (tr)。通过确定其去聚电位 (DP)、入口电位 (EP)、碰撞细胞入口电位 (CEP)、碰撞能量 (CE)、极限值, 我们进一步优化了每个父离子核苷 (Q1)、最强产品离子 (Q3) 的 MS 检测。检测 (LOD) 和量化下限 (LLOQ) (表 3)。最后, 开发了一种 LC ms/ms 方法, 可以分离和量化四个正常的 DNA 基础 (A、T、G 和 C), 以及四个改性胞嘧啶碱基 (5-甲基、5-羟甲基、5-甲酰基和 5-羧基) (图 3)。
未标记 TET2 酶的活性是使用一个 25-海 dsDNA 包含一个5mC 在 CpG 岛在每个 DNA 链 (表 2)。TET2 酶反应后, 将 DNA 寡核苷酸纯化并转化为核苷。然后, 这些核苷接受 LC-ms/ms 检测。在没有 TET2 酶 (阴性对照) 的反应中, 仅观察到 dA、dT、dG、dC 和5mdC 峰。然而, 在含有 TET2 酶的阳性对照反应中, 观察到 d5hmC 和 d5fC 对应的两个新峰。由于检测水平较差 (图 2), 我们无法检测出 d5caC 核苷的形成。结果表明, 本程序纯化的无标签 TET2 酶催化活性, 可用于 wt-TET2 酶及其临床突变体的表征。
图 1。从大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞中纯化 TET2 酶的 SDS 页分析。车道 a 指示标记, 而车道 B 表示使用 SP 琼脂糖离子交换树脂纯化的 TET2 蛋白。未标记 TET2 酶的总大小是∼54 kDa, 如箭头所示。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2。标准曲线绘制四种天然 DNA 核苷和不同的胞嘧啶衍生物, 然后用于它们的定量。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3。液相色谱 (底部) 和 ms/ms (上文) 方法用于分离和表征四种天然 DNA 核苷和不同的胞嘧啶衍生物。
| 底漆名称 | 底漆顺序 | |||
| TET2 前底漆 | 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3 ' | |||
| TET2 反向底漆 | 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3 ' | |||
表 1:DNA 寡核苷酸引物序列在无标记人 TET2 酶催化域 PCR 扩增中的应用。
| 底漆名称 | 底漆顺序 |
| 感股 | 5 '-AGCCCGCGCCG/iMe-直流/GCCGGTCGAGCGG-3 ' |
| 反义链 | 5 '-CCGCTCGACCGGCG/iMe-直流/GGCGCGGGCT-3 ' |
表 2:序列的意义和抗感 25-dsDNA 寡核苷酸作为 TET2 基底的体外氧化反应。
| 核 苷 | Q1 | Q3 | tr (分钟) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol/μl 为单位) | LLOQ | R2 | |
| 2 '-脱氧腺苷 | 252。2 | 136。1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0.06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2 '-胸苷 | 243。2 | 117。1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1。8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2 '-脱氧鸟苷 | 268。2 | 152。1 | 10。6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7。8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2 '-脱氧胞苷 | 228。1 | 112。1 | 6.29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0。1 | 0.33 | 0.998 | |
| 5-甲基-2 '-脱氧胞苷 | 242。2 | 126。1 | 9.85 | 31 | 6。5 | 24 | 13 | 0.03 | 0。1 | 0.998 | |
| 5-羟基甲基 2 '-脱氧胞苷 | 258。2 | 142。1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0。6 | 1.98 | 0.993 | |
| 5-甲酰基 2 '-脱氧胞苷 | 256。2 | 140。1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0。2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-羧基-2 '-脱氧胞苷 | 272。2 | 156。1 | 4。1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3。9 | 12.87 | 0.993 | |
表 3:在正离子模式下, 优化了四种天然 DNA 核苷和不同胞嘧啶衍生物的 LC ms/ms 参数。对于每个父离子核苷 (Q1), 检测到最强的产物离子 (Q3)。
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Discussion
TET2 基因突变是在不同的造血恶性肿瘤患者中发现的最常见的遗传变化。到目前为止, 数以百计的不同的 TET2 突变, 其中包括废话, 帧移位, 和错义突变, 已确定在患者12。与 wt-TET214相比, TET2突变的患者在骨髓中的基因组5hmC 水平低。突变TET2实验概括了这些突变对转染细胞中5hmC 水平的影响14。结果 TET2-knockout 小鼠模型表明, TET2 酶水平与造血恶性肿瘤的进展呈反比关系17,18,19,20。一直以来, 张等等最近证明了 TET2 表达水平的向下调节是 cytogenetically 正常急性髓细胞白血病27的潜在预后和预测性生物标志物。
尽管越来越多的证据表明, TET2 在正常造血和髓样转化中起着根本性作用, 但由于与活性 TET2 的生产相关的困难, TET2 和突变体的生化特性仍处于初级阶段。及其检测方法。大多数研究已经生产重组 TET2 使用耗时的杆状病毒系统在昆虫细胞14, 或作为谷胱甘肽 s-转移酶亲和标记在细菌细胞需要去除亲和标记21。
在这个实验过程中, 我们描述了使用站点特定的重组技术进行无标记人 TET2 酶催化域的克隆, 以及使用目标向量 (pDEST14) 在大肠杆菌中的有效表达。由于未标记 TET2 的电点相对较高 (∼7.49) 与大多数本土大肠杆菌蛋白相比, 我们利用阳离子交换色谱产生 > 90% 纯未标记的 TET2, 开发出高效的纯化过程。酶的一个步骤。
此外, 在定量的 wt 和突变 TET2 酶活动中还存在其他挑战。对于这些实验, 大多数研究都依赖于基于抗体的检测, 如斑点印迹14、28、酶联免疫检测 (ELISA)29等, 因为这些检测通常只使用一种抗体, 例如, 5hmC 或 5fC or5caC, 用于检测基底 DNA 中的5mC 修饰, 它们不提供由春节异构体进行的催化反应的全貌。基于这些原因, LC ms/ms 的检测已经成为量化不同胞嘧啶修饰的唯一方法。在这方面, 我们开发了一种新的液相色谱法, 可以分离四个正常的 DNA 碱基 (a、T、G 和 C), 以及四个改性胞嘧啶碱基 (5mC、5hmC、5fC 和 5caC)。
为了量化从 TET2 催化反应的八核苷, 我们将改进的液相色谱方法与串联质谱法结合在一起。然后利用这一敏感的 LC 质谱分析法测定重组无标记人 TET2 酶的活性。本文介绍的方法将极大地提高 TET2 和突变体酶活动的评价。
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Disclosures
作者没有经济利益申报。
Acknowledgments
这项研究由美国国防部资助的形式的想法奖 (W81XWH-13-1-0174), 再生障碍性贫血 & MDS 基金会赠款, 和 UMRB 授予 M.M. 作者感谢莫希特贾斯瓦尔和 Subhradeep 巴尔在 TET2 向量的初始克隆 pDEST14。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
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