Summary
Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.
Abstract
Immunophenotypic Charakterisierung und molekulare Analyse haben seit langem verwendet, um abzugrenzen Heterogenität und unterschiedliche Zellpopulationen zu definieren. FACS ist von Natur aus eine einzellige Assay, molekulare Analyse jedoch vor, die Zielzellen oft prospektiv in loser Schüttung, isoliert werden dadurch verlieren einzellige Auflösung. Einzellige gen Expressionsanalyse bietet die Möglichkeit, molekulare Unterschiede zwischen einzelnen Zellen in heterogenen Zellpopulationen zu verstehen. In Zelle Massenanalyse ergibt eine Überrepräsentation von einem deutlichen Zelltyp Vorurteile und Gefäßverschlüsse von Signalen von seltenen Zellen mit biologischer Bedeutung. Durch die Verwendung von FACS Index sortieren gekoppelt mit einzelligen gen Expressionsanalyse, Populationen untersucht werden können ohne den Verlust von einzelligen Auflösung während Zellen mit mittleren Zelle Oberfläche Marker Ausdruck auch erfasst werden, ermöglichen die Bewertung der die Relevanz der kontinuierliche Oberfläche Marker Ausdruck. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der reversen Transkription einzellige kombiniert quantitative PCR (RT-qPCR) und FACS index sortieren gleichzeitig die molekulare Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb Zell-Populationen.
Im Gegensatz zu den einzelligen RNA Sequenzierung Methoden ermöglicht die Verwendung von qPCR mit zielgruppenspezifischen Verstärkung für robuste Messungen von niedrig-Fülle Transkripte mit weniger Aussetzer, während es durch Probleme im Zusammenhang mit Variationen von Zelle zu Zelle lesen Sie nicht verwechselt wird Tiefe. Darüber hinaus direkt Index-Sortierung Einzel-Zellen in Lyse-diese Methode Puffer, ermöglicht durch cDNA Synthese und zielgruppenspezifische Vorverstärkung in einem Schritt sowie für die Korrelation der später abgeleiteten molekulare Signaturen mit Zelloberfläche durchgeführt werden Marker-Ausdruck. Die beschriebene Vorgehensweise wurde entwickelt, um hämatopoetischen Einzel-Zellen zu untersuchen, aber haben auch erfolgreich auf andere Zelltypen eingesetzt.
Abschließend ermöglicht der hierin beschriebene Ansatz für empfindliche Messung der mRNA Ausdruck für ein Panel der vorgewählten Gene mit der Möglichkeit, Protokolle für angehende isoliert von molekular unterschiedliche Subpopulationen zu entwickeln.
Introduction
Jede einzelne Blutzelle wird geglaubt, um in einer zellulären Hierarchie befinden wo Stammzellen bilden die Spitze auf der Oberseite eine Reihe von zunehmend engagierte fortgeschrittene Stammväter, die schließlich unheilbar in die endgültige Effektorzellen mit spezifischen unterscheiden biologische Funktionen1. Viel von dem Wissen über Stammzellen Systeme wie organisiert sind wurde im blutbildenden System, vor allem wegen der Fähigkeit, unterschiedliche hämatopoetische Populationen hochangereichertes für Stammzellen oder verschiedene Vorfahren2 prospektiv isolieren generiert durch FACS sortieren. Dies hat für viele dieser Populationen erlaubt, funktional oder molekular, überwiegend durch gen-Expressions-profiling3,4analysiert werden. Aber wenn Analyse der Genexpression von Schüttgut Populationen individuelle Unterschiede zwischen den Zellen sind gemittelt und verlor5. So kann Arbeitsunfähigkeit, Zell-Zell-Varianten in heterogenen Zelle Bruchteilen zu erkennen unser Verständnis der kritischen biologischen Prozesse verwirren, wenn kleine Teilmengen von Zellen für die abgeleitete biologische Funktion von dieser Bevölkerung6zu berücksichtigen, 7. Umgekehrt, Untersuchung von gen-Ausdruck-Signaturen bei einzelligen Auflösung bieten die Möglichkeit zu Heterogenität abzugrenzen und zu überschatten Einflüsse aus überrepräsentiert Teilmengen von Zellen8umgehen.
Bisher wurden viele Protokolle für einzellige gen Expressionsanalyse entwickelt; mit jeder dieser Ansätze hat seine eigenen Vorbehalte. Die früheste Methode wurde RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch), die eine begrenzte Anzahl von Abschriften zu einem Zeitpunkt misst, sondern ist einzigartig, da es ermöglicht die Untersuchung von RNA Lokalisierung9,11. Frühe Methoden mittels PCR und qPCR um zu erkennen, dass ein einzelnes oder wenige Abschriften wurden auch entwickelt,12. Jedoch haben diese in letzter Zeit durch Mikrofluidik-basierte Methoden ersetzt, die gleichzeitig Ausdruck von Hunderten von Abschriften pro Zelle in Hunderten von Zellen durch qPCR analysieren können und ermöglichen so hochdimensionalen Heterogenität-Analyse mit gen Platten10,13im Vorhinein festgelegt. Vor kurzem RNA Sequenzierung basierenden Technologien haben werden am meisten benutzt für Einzelzelle Analyse, wie diese können theoretisch das ganze Transkriptom einer Zelle zu messen und dadurch eine explorative Dimension Heterogenität Analyse10, verleihen 14. Multiplexed qPCR Analyse und einzellige RNA Sequenzierung haben unterschiedliche Eigenschaften, so die Begründung für die Verwendung einer der Methoden hängt die Frage sowie die Anzahl der Zellen in der Zielpopulation. Hochdurchsatz- und low-cost pro Zelle zusammen mit unvoreingenommenen, explorative Eigenschaften der einzelligen RNA Sequenzierung sind erwünscht, wenn unbekannte Zelle oder große Populationen untersucht werden. Allerdings ist einzellige RNA Sequenzierung auch voreingenommen gegenüber Sequenzierung hohe reichliche Abschriften häufiger während Transkripte mit niedrigen Fülle anfällig für Ausfälle sind. Dies führt zu erheblich komplexer Daten, das stellt hohe Anforderungen an bioinformatische Analyse wichtige molekulare Signale zeigen, die oft subtil oder in technischen Lärm15verborgen sind. Also für gut charakterisierten Gewebe einzellige qPCR-Analyse mit vorbestimmt Primer Platten ausgewählt für funktionell wichtige Gene oder molekulare Marker können als ein sensibler, unkomplizierte Konzept zur Bestimmung der Heterogenität der dienen ein Bevölkerung. Allerdings ist anzumerken, dass im Vergleich zu einzellige RNA-FF, die Kosten pro Zelle ist im Allgemeinen höher für einzellige qPCR Methoden. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der einzelligen RT-qPCR (geändert von Teles J. Et Al. kombiniert ( 16), FACS Index gleichzeitig17 und Bioinformatik Analyse18 zur Sortierung die molekularen und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb von Populationen zu charakterisieren.
Bei diesem Ansatz die Zellpopulation des Interesses ist befleckt und Einzel-Zellen sind durch FACS direkt in Lyse Puffer in 96-Well-PCR-Platten sortiert. Gleichzeitig sind Ausdruck eines zusätzlichen Satzes der Zelloberfläche Marker für jede einzelne Zelle bei der FACS-Sortierung, eine Methode Drittel über dem Niveau, die als Index-Sortierung bezeichnet wird. Das lysierten Zellmaterial wird anschließend verstärkt und die Genexpression eine ausgewählte Gruppe von Genen mit RT-qPCR, mithilfe einer mikrofluidischen Plattform analysiert. Diese Strategie ermöglicht molekulare Analyse der sortierten einzellige sowie gleichzeitige Charakterisierung von jeder einzelnen Zelle Zelloberfläche Marker Ausdruck. Indem Sie direkt zuordnen molekular unterschiedliche Teilmengen von Zellen des Ausdrucks der indizierten sortierte Marker, können die Subpopulationen mit einer bestimmten Immunophenotype verknüpft werden, die für ihre zukünftigen Isolation verwendet werden können. Die Methode wird erläutert Schritt für Schritt in Abbildung 1. Eine vorbestimmte gen Gremium trägt eine höhere Auflösung der gezielten Genexpression, da sie Messung irrelevant reichlich Gene umgeht, die sonst feine gen Ausdruck Signale verdecken können. Robuste Messung von niedrigen ausgedrückt Transkripte, wie Transkriptionsfaktoren oder nicht-Poly-Adenylated-RNAs ermöglicht darüber hinaus der zielgruppenspezifischen Verstärkung, einen Schritt reversen Transkription und Verstärkung. Wichtig ist, zulassen qPCR Methoden für die Messung der mRNA von Schmelzverfahren Proteine, die wichtig sind bei der Untersuchung von bestimmten bösartigen Erkrankungen19. Zu guter Letzt die fokussierte Zahl der Gene untersucht, geringe Drop-out-Raten und begrenzten technischen Unterschiede zwischen den Zellen machen diese Methode leicht analysiert im Vergleich zu höher dimensionale Methoden, z. B. einzellige RNA-seq. Anhand des Protokolls kann eine gesamte Experiment durchgeführt werden, von der Sortierung Zellen analysierten Ergebnisse innerhalb von drei Tagen, so dass dies eine unkomplizierte und schnelle Methode für sensible, Hochdurchsatz einzellige Ausdruck Genanalyse.
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Protocol
1. Vorbereitung der Lyse Platten
- Mit Hilfe einer RNA/DNA-freie Bank vorbereiten genug Lyse Puffer 96 Wells, mit 10 % extra, durch das Mischen von 390 µL Nuklease freies Wasser, 17 µL 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0.1 M DTT und 5.3 µL RNAse-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Wirbel und Spin-down.
- Verteilen Sie 4 µL Lyse Puffer in jede Vertiefung eine 96 well PCR-Platte zu und verschließen Sie die Platten mit Klebefolie. Spin-down Röhren Flüssigkeit an der Unterseite der Platten zu sammeln. Halten Sie die Platten auf Eis bis Zelle sortieren (max. 24 h).
2. Vorbereitung der Zellen Zellsortierung
- Tauen Sie entsprechende Anzahl von Zellen (hier, CD34 angereicherten hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen) für das Experiment. 1 x 106 Zellen eignen sich für die Sortierung etwa drei 96-Well-Platten von Einzel-Zellen mit Steuerelementen.
- Aufgetaute Zellen auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und 1 mL EB alle 30 s bis ein Gesamtvolumen von 8 mL erreicht ist. Zellen in einer Zentrifuge bei 350 X g für 10 min bei 4 ° C drehen und überstand zu entfernen.
- Aufschwemmen Zellen in 8 mL Puffer Färbung (PBS mit 2 % FBS) und 350 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und überstand zu entfernen.
- Aufschwemmen Zellen in 200 µL Färbung Puffern und Zellen für Kontrolle Flecken zu entfernen.
- Machen Fluoreszenz abzüglich einer Steuerelemente (RGV) für jede Fluorophor durch Färbung ein Bruch der Zellen in 50 µL Puffer Färbung. In diesem Beispiel werden 6 Mikrozentrifugenröhrchen mit 20.000 Zellen als FMOSs verwendet. Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen abhängig von der untersuchten Bevölkerung angepasst werden soll. Fügen Sie alle Antikörper bei der gleichen Konzentration wie in der Probe Fleck mit Ausnahme eines für jedes Rohr.
- Stellen Sie einzelne Flecken für jedes Fluorophor durch Färbung einen Bruchteil der Zellen in 50 µL Puffer für jede Fluorophor verwendet. In diesem Beispiel werden 6 Mikrozentrifugenröhrchen mit 20.000 Zellen verwendet. Beachten Sie, dass das Ziel für jeden Antikörper durch die Zellen benutzt für Steuerelemente zum Ausdruck gebracht werden muss. Fügen Sie jeder Antikörper bei der gleichen Konzentration wie in der Probe Fleck in Einzelrohren. Zusätzlich halten Sie 20.000 ungefärbte Zellen in 50 µL als ungefärbten Kontrolle.
- Die Zellprobe fügen Sie Antikörper in ihrer entsprechenden Konzentration hinzu. Verwendet hier sind CD34-FITC in einer Konzentration von 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 und Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50 und CD235a-PECy5 1/1000.
- Inkubieren Sie Zellen mit Antikörpern für 30 min auf Eis im Dunkeln.
- Waschen Sie Zellen mit 3 mL Puffer Färbung. Zellen bei 350 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und überstand zu entfernen.
- Aufschwemmen Sie Zellen und wiederholen Sie Schritt 2,9.
- Aufschwemmen Probe in 500 µL und RGV in 100 µL Puffer mit 1/100 7AAD und Filter Zellen durch einen 50 µm Filter eine einzellige Aussetzung zu beflecken.
(3) Zellsortierung
- Stellen Sie sicher, dass das FACS-Gerät konfiguriert ist korrekt mit Drop Verzögerung und Cytometer Setup und tracking (CST), die vor kurzem durchgeführt worden sind, nach Angaben des Herstellers, um sicherzustellen, dass die entsprechenden Zellen sortiert werden. Für hämatopoetische Zellen empfiehlt die Verwendung der 85 Mikron Düse und maximale Geschwindigkeit von 4, während die optimale Ereignisrate zwischen 800 und 2000 Ereignisse/s ist.
- Spektrale Überlappung durch Fluoreszenz Kompensation ausführen korrigieren und Tore nach FMO Steuerelemente oder negative Kontrollen festgelegt.
- Durchführen Sie Reanalyse der Zielgruppe durch mindestens 100 Zielzellen zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit 100 µL Puffer Fleck Sortierung. FACS der sortierten Zellen durch Aufnahme der sortierte Probe zu analysieren und stellen Sie sicher, dass sie am Ende in der Art Tor.
- Set-up einzigen Zellplatte Sortierung nach Zentrierung des Rückgangs auch A1 in einer 96-well-Platte. Wenn es zentriert ist, sortieren Sie, 50 – 100 6 µm Partikel in alle Vertiefungen an den Rändern der eine leere 96-well-Platte um sicherzustellen, dass alle Brunnen eine Zelle in der Mitte jedes gut erhalten.
- Wenn möglich, kann eine zusätzliche Kontrolle, um sicherzustellen, dass lebensfähige Zellen sortiert werden durch Sortierung Einzel-Zellen in Vitro Wachstum hinzugefügt werden. Hämatopoetische Zellen können in U-Boden-96-well-Platten in 100 µl SFEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 100 ng/mL FLT3L, TPO und SCF angebaut werden. Analysieren Sie jedes gut, nach 3 Tagen in der Kultur für Zelle Kolonien unter Verwendung eines Mikroskops.
- Entfernen Sie die Klebefolie von Platten. Eine einzelne Zelle Art von Interesse (hier Lin-CD34 + CD38-Zellen) in 92 von 96 Wells, aktivieren INDEX-Sortierung in der FACS sortieren Software, das Immunophenotypic-Profil von anderen Markern von Interesse (hier CD45RA, CD49f und CD90) für jede einzelne Zelle zu speichern.
- Zwei Brunnen mit 10 und 20 Zellen bzw. für Linearität Steuerelemente in der PCR-Amplifikation zu sortieren. Wells H1 und H2 sind in der Regel verwendet.
- Halten Sie zwei Brunnen ohne irgendwelche Zellen, wie keine-Template steuert in der Regel Wells H3 und H4.
- Versiegeln Sie die Platten mit klaren Klebefilm und drehen Sie die Platten bei 300 X g für 1 min vor Snap auf Trockeneis einfrieren.
- Speichern Sie gefrorene Platten bei-80 ° C.
Hinweis: Sichere Haltepunkt. Sortiert und lysierten Zellen können bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung aufbewahrt werden.
(4) reverse Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung
- Bereiten Sie den Primer-Mix für alle 96 gen Ziele durch Zugabe von 2 µL jeder Primerpaar, einschließlich Housekeeping gen Primer und Primer für Spike-Steuerelement RNA, in eine 1,5 mL RNAse frei Rohr auf einer freien RNA/DNA-Bank. Wenn weniger als 96 Primer verwenden, fügen Sie gleichwertigem Umfang Nuklease freies Wasser für die fehlenden Primer hinzu. Primer sind separat zu bestellen das gewünschte gen Panel übereinstimmen.
- Machen reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung mix, indem 632.5 µL 2 x Reaktion Mischung, 101.2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL-Primer-Mix und 0,7 µL Kontrolle RNA versetzt. Vorform dieser Schritt auf eine freie DNA-Bank. Mix von aufschütteln und Spinnen bis zu sammeln die Flüssigkeit in den Boden des Röhrchens. Halten Sie auf dem Eis bis hinaus auf die Probe.
- Make keine-Reverse Transkription Kontrolle Mix für vier Brunnen durch das Mischen von 27,5 µL 2 x Reaktion Mischung, 1,76 µL Taq Enzym, 6,6 µL Grundierung-Mix und 2,64 µL Nuklease freies Wasser. Spike Kontrolle RNA. Führen Sie diesen Schritt auf einer freien DNA-Bank. Wirbel und Spin bis zu sammeln die Flüssigkeit in den Boden des Rohres und halten Sie auf dem Eis bis Zusatz zu probieren.
- Lysate Platten auf Eis auftauen. 92 Brunnen, einschließlich der Linearität und nicht-Template-Kontrollen fügen Sie 8,75 µL der zuvor vorbereiteten reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung Mix hinzu. Die vier verbleibenden Brunnen 8,75 µL des keine-Reverse Transkription Kontrolle Mix hinzufügen. Platten mit klaren Klebefilm und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten zu versiegeln.
- Vorform reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung durch die Platte in einer PCR-Maschine nach dem Preamp-Programm ausführen; Schritt 01:50 ° C für 60 min, Schritt 2: 95 ° C für 2 min, Schritt 3: 95 ° C für 15 s, Schritt 4: 60 ° C für 4 min, wiederholen Sie 3 bis 4 24 Schritte Mal und schließlich Schritt 5: 8 ° C für immer.
- Nach PCR abgeschlossen ist, halten Sie die Platte bei 8 ° C für die kurzfristige Lagerung und-20 ° C für langfristige Lagerung.
Hinweis: Sichere Haltepunkt. Verstärktes Material kann bei 8 ° C für eine kurzfristige Speicherung und bei-20 ° C für die Langzeitspeicherung gehalten werden.
5. Vorbereitung der Probe und Assay-Platten für Multiplex mikrofluidischen Gene Expression Analysis
- Bereiten Assay Laden Platte durch Pipettieren 3 µL Assays laden Reagenz in jede Vertiefung eine 96-well-Platte. Individuelle Vertiefungen in der Probe Laden Platte fügen Sie 3 µL jedes Primers hinzu.
- Dichtplatte mit Klebefolie und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten.
- Bereiten Sie Verdünnung Platte durch Pipettieren 8 µL Nuklease freies Wasser in alle Vertiefungen einer 96-well-Platte. Verdünnung Plattenherstellung, eine endgültige Verdünnung von 1:5 fügen Sie 2 µL verstärkte Probe hinzu.
- Dichtplatte mit Klebefolie, mischen durch Vortexen Platte für 10 s, und schließlich bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten drehen.
- Bereiten Sie Probenbeladung Mischung sorgfältig 352 µL des master-Mix mit 35,2 µL Probe laden Reagenz vermischen. Bereiten Sie Probe Belastungsplatte durch Aliquotierung 3.3 µL Mischung in jede Vertiefung eine 96-well-Platte zu laden.
- Fügen Sie 2.7 µL aus der verdünnten Probe in jede Vertiefung der Platte laden Probe hinzu.
- Dichtplatte mit Klebefolie und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten.
6. Laden der Mikrofluidik-Chip
- Nehmen Sie einen neuen 96 x 96 Mikrofluidik-Chip. Bereiten Sie Buchten durch stossen sie mit einer Spritze mit Kappe auf, um sicherzustellen, dass sie verschoben werden können.
- Entfernen Sie Luftblasen von Spritzen. Jedes Ventil fügen Sie vollen Lautstärke von Spritzen während den Chip 45 Grad kippen und drücken Sie das Ventil hinzu. Prime-Chip mit der IFC-Controller.
- Laden Sie jedes Assay-Einlass mit 4,25 µL aus jedem der Brunnen in der Probe, die Platte zu laden. Vermeiden Sie Luftblasen. Wenn im Brunnen Luftblasen, entfernen Sie diese mit einer Pipettenspitze.
- Jede Probe Einlass mit 4,25 µL aus jedem der Brunnen in der Probe Laden Platte Laden fortsetzen, Luftblasen zu vermeiden und wenn Luftblasen, entfernen Sie diese mit Pipettenspitze.
- Chip mit der IFC-Controller zu laden.
- Überprüfen Sie, dass der Chip selbst sieht und alle Kammern geladen wurden. Entfernen Sie Staub von der Chipoberfläche durch Berühren mit Klebeband. Führen Sie den Chip in der Multiplex-mikrofluidischen gen Ausdruck Plattform.
7. laufende Chip auf Multiplex mikrofluidischen Gen-Expression-Plattform
- Nach dem Laden Chip in die multiplex mikrofluidischen gen Ausdruck Plattform, nennen Sie die Probe.
- Als passive Farbstoff ROX festgelegt. Stellen Sie einzelne Sonde und FAM-MGB als Fluoreszenz. Verwenden Sie 96 x 96 standard v2 als Protokoll. Starten Sie laufen.
- Entfernen Sie Chip Ausführung ist abgeschlossen.
8. vorläufige Analyse der Chip Run
- Laden Sie Daten in Real-Time PCR-Analyse-Software.
- Laden Sie gen Namen und Zellnamen durch Einfügen von Zell- und Gentherapie Layouts aus einer Registerkarte getrennt-Datei.
- Öffnen Sie Bildansicht und wählen Sie ROX als Farbstoff. Überprüfen Sie, ob alle Brunnen passive Farbstoff ROX haben.
- Untersuchen Sie, ob alle Verstärkung Grundstücke in Ordnung, mit einer glatten Verstärkung Kurve mit keine Spikes (ähnlich wie Abbildung 3E) aussehen.
- Sicherstellen Sie, dass alle Einzel-Zellen haben Ausdruck der Spike-Steuerelement RNA um sicherzustellen, dass alle ordnungsgemäß geladen wurden.
- Sicherzustellen Sie, dass alle Zellen Zimmermädchen Genexpression und somit richtig sortiert wurden.
- Sicherstellen Sie, dass 10 bis 20 Zelle Linearität Steuerelemente verfügen über ca. 1 CT Unterschied, lineare Verstärkung zu validieren.
- Überprüfen Sie, ob Ausdruck in NoRT Kontrollproben. Wenn Ausdruck in NoRT erkannt wird Erwägung, Sonden, Sonden die genomischen DNA für die nachfolgenden Ausführungen nicht erkennen.
- Exportieren Sie Daten in Csv-Dateien zur weiteren Analyse.
9. einzellige Analyse mit SCExV
Hinweis: Ein Einführungsfilm ist präsent20 , das Werkzeug einzuführen. Hier ist eine kurze Empfehlung wie man Analyse mithilfe der Steuerelemente in das Protokoll eingeführt präsentiert.
- Verbinden Sie mit der SCexV-Website-20.
- Hochladen Sie exportierte CSV-Dateien.
- Die Spike-Steuerelement RNA als Positivkontrolle gewählt. Jede Zelle verfügt über ein Steuerelement RNA CT über 25 zu entfernen. Die Daten zum Median Ausdruck des Steuerelements RNA zu normalisieren.
- Klicken Sie auf "-hier > Analyze". NoRT, Notemplate, 10 und 20 Zelle Kontrollen in der Zelle-Option "ausschließen" zu entfernen.
- Cluster-Zellen mit dem clustering Ansatz der Wahl mit der erwarteten Anzahl von Clustern. Exportieren Sie analysierte Werte.
10. Index-Sortierung Analyse
- Öffnen Sie FACS-Analyse-Software und laden Sie die indizierten Proben.
- Öffnen Sie den Skripteditor, und führen Sie das Skript verfügbar von Quinn J. Et al. 21
- Nun, da die FACS-Analyse-Software ein Tor für jede einzelne Zelle gemacht haben sollte, Layout-Editor zu öffnen und Farbe der Zellen nach der Vereinigung von SCexV (erhältlich in der Datei mit dem Namen "Sample_complete_Data.xls").
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Representative Results
Das Protokoll beschrieben ist sehr zuverlässig, schnell und problemlos durchgeführt. Ein Überblick über die Versuchsanordnung ist in Abbildung 1dargestellt. Das gesamte Protokoll von der Sortierung der Einzel-Zellen gezielt Verstärkung, gen-Ausdruck-Messungen und vorläufige Analyse kann in drei Tagen durchgeführt werden. Ein Beispiel der analysierten Ergebnisse in Form einer Heatmap, die vorläufige analysierte Daten von einzelligen Ausdruck Genanalyse mit 96 Grundierungen und 96 von entweder einem chronisch-myeloischer Leukämie (CML) Patienten oder 96 Zellen aus einem im Alter abgestimmt gesunden darstellt Steuerelement wird in Abbildung 2dargestellt. Mit hierarchischen clustering, können vier Untergruppen anhand ihrer Signaturen gen Ausdruck der analysierten Zellen unterteilt werden. Die Hitze Karte Visualisierung ist eine komfortable Möglichkeit, einen Überblick über die Daten sowie zur Kontrolle für Brunnen zu erhalten, die aus der Analyse (z. B. Kontroll-Vertiefungen) ausgeschlossen werden sollen. Abbildung 2 b ist eine Hauptkomponentenanalyse (PCA), Visualisierung, wie ähnlich sich die Zellen der einzelnen Gruppen durch Reduzierung der Dimension miteinander sind. Hier, sind Ausreißer leicht zu unterscheiden von dem Rest der Zellen. Zu analysieren, wie einzelne Gene sind die Cluster verteilt als auch zwischen ihnen unterscheiden, Violine Grundstücke sind nützlich. In Abbildung 2sind vier repräsentativen Genexpression dargestellt: die Fusionsgen BCR-ABL1, das kennzeichnet alle leukämischen Zellen; der Zellzyklus-Marker-mKI67, die in einer aktiv teilenden Gruppe zum Ausdruck kommt; die myeloische Differenzierung Marker MPO, die auf den Radsport Untergruppe beschränkt; und schließlich das Haus halten gen RPS18, die in allen Zellen exprimiert wird. Schließlich werden in Figur 2D die molekularen Signaturen zu Immunophenotyped korreliert sind, als die Identitäten der einzelnen Zellen in jedem Cluster verwendet um die einzelnen Zellen in einem FACS-Grundstück generiert aus der Index-Sortierung zu färben. Gezeigt wird die Zelle Oberfläche Marker Ausdruck für die hämatopoetische Stammzell-Marker CD90 und CD45RA, die in diesem Fall verwendet werden könnte, zu unterscheiden zwischen einigen der Cluster und prospektiv für Funktionsanalyse isolieren.
Die Mikrofluidik verwendet, um die einzelligen qPCR durchzuführen ist sehr empfindlich auf Einführung von Luft oder Partikel in das System. Daher ist es wichtig, einen post laufen Qualitäts-Check der Daten zu tun. Abbildung 3 zeigt Vertreter, dass Daten und der Kontrast zwischen einem erfolgreichen und einem gescheiterten aufgrund schlechter Probenbeladung ausgeführt. Abbildung 3A zeigt, wie die Rox-Ebenen nach einem erfolgreichen Lauf Verbreitung gleichmäßig über alle Brunnen beruhigend, dass das Laden war erfolgreich. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 3 b wie Probe und Assay laden gescheitert sind, wie durch den Mangel an ROX in weiten Teilen des Chips. Sobald die Qualität der Rox bewertet wurde, kann die Qualität der raw gen Ausdruck Signale ausgewertet werden. In Abbildung 3wird eine Heatmap einer erfolgreichen Ausführung präsentiert, wo Ausdruck gleichmäßig verteilt ist Proben mit starkes Signal von rund 7-25 Ct:s. In Kontrast, 3D Abbildung zeigt einer Heatmap einer fehlerhaften Ausführung wo haben viele Proben kein Signal oder Ausdruck für eine sehr begrenzte Anzahl von Genen. Die Ergebnisse in Abbildung 3D dürften aufgrund eines Fehlers in der FACS Sortierung vor einzellige Genanalyse Ausdruck, da viele Zellen deutlich zum Ausdruck-Signale haben, während andere Ausdruck ganz fehlt. Zu guter Letzt zeigt Abbildung 3E die erwartete Verstärkung Kurve der Pfennigabsatz Eingabesteuerelement RNA mit allen Wells mit rund 10 CT mit wenig bis keine Veränderung klar zum Ausdruck. Diese Positivkontrolle misst die Effizienz aller Schritte in der einzelligen qPCR-Analyse. Um sicherzustellen, dass die Verstärkung im dynamischen Bereich ist, sind verschiedene Zellzahlen als Linearität Steuerelemente enthalten; Hier sind 10 - 20 Zellen Steuerelemente verwendet. Die CT-Unterschiede zwischen Linearität Kontrollen sollten die Unterschiede im Zellzahlen widerspiegeln. Schließlich sicherstellen die keine reverse Transkription (NoRT) und die keine Vorlage Negativkontrollen, dass keine falsche positive Signale aus genomischer DNA oder Verunreinigungen, bzw. erkannt werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. Zellen sind gefärbt, sortiert mit Index-Art Anwendung aktiviert, um die Oberfläche Marker Ausdruck aufzeichnen und lysiert, die mRNA freizugeben. mRNA ist anschließend umgekehrt in cDNA umgeschrieben und verstärkt mit zielgruppenspezifischen Verstärkung. Als nächstes werden die Proben zusammen mit einzelnen Primer in einem Mikrofluidik-Chip, geladen wo des Genexpressionsprofils jeder Zelle mit RT-qPCR analysiert wird. Nach der Datenerfassung die Daten vorverarbeitet, minderwertige Zellen zu entfernen und clustering wird durchgeführt, um Molekular unterschiedliche Zellpopulationen zu definieren. Schließlich sind molekular definierte Subpopulationen Oberfläche Marker Ausdruck von FACS sortieren Index korreliert zu immunophenotypisch Daten charakterisieren die Heterogenität der Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Ergebnisse der drei erfolgreichen einzellige Genexpression analysiert von normalen und leukämischen hämatopoetischen Stammzellen. (A) Heat map zeigt einzellige gen Ausdruck Messungen 270 einzelner Zellen aus einem chronisch-myeloischer Leukämie-Patienten sowie ein Alter abgestimmt gesunden Kontrolle von hierarchischen clustering mit SCExV 18, ein Analyse-Tool analysiert für diese Art von Daten konzipiert. Rot steht für hohe Expression, blaue geringe Expression und grau kein Ausdruck. Die Zellen wurden in vier verschiedenen Clustern anhand ihrer Signaturen gen Ausdruck unterteilt. Es ergibt sich aus den Daten, dass die leukämischen Stammzellen Bevölkerung von diesem Patienten unterteilt werden kann, in einem ruhenden Bevölkerung (Cluster 3), mit Ausdruck von nur ein paar Differenzierung Marker und ein aktiv teilenden Bevölkerung, die Ausdruck der initiiert hat Gene myeloische Differenzierung (Cluster 4) zugeordnet. Die hier verwendeten Daten sind von einem ausgewählten Patienten Warfvinge Et Al. in zuvor veröffentlichte Arbeit aufgenommen 22 (B) wichtigste Komponente (Analysis, PCA) in A, wo vier Gruppen getrennt angezeigten Daten kann angezeigt werden. (C) Violine Grundstücke von vier Genen mit Cluster Konkretisierung, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 und MPO. Jede Parzelle Violine ist der Ausdruck in jedem Cluster und die gepunktete Linie bildet den Mittelwert der Ausdruck für alle Zellen. (D) Index-Sortierung Analyse eines der Patientenproben in der Heatmap, wo jede einzelne Zelle wird mit der Farbe seiner molekularen Subpopulation markiert dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Qualitätskontrollen von multiplex qPCR in Real-Time PCR Software. (A) Rox Lade Bild der erfolgreichen Probe und Assay laden. (B) Rox Lade Bild der erfolglosen Probe und Assay laden, dem gescheiterte Belastungen der Proben durch einen Mangel an ROX in horizontalen Linien angezeigt werden. Fehlerhafte Belastung des Assays würde in vertikalen Linien angezeigt werden. (C) Beispiel für eine erfolgreiche laufen in der Hitze Kartenansicht, wo einzelne Zellen repräsentieren Zeilen und Gene Spalten. Hoher Genexpression wird in gelb, niedrige Ausdruck in blau und kein erkannten Ausdruck in schwarz angezeigt. (D) Beispiel für eine fehlgeschlagene laufen in der Hitze Kartenansicht, wo einzelne Zellen repräsentieren Zeilen und Gene Spalten. Hoher Genexpression ist vertreten durch gelb, geringe Expression wird durch Blau und kein erkannten Ausdruck als schwarz dargestellt. (E) normalisiert Intensität (links) und Verstärkung Grundstück (rechts) von einem dotierten RNA-Steuerelement. CT-Werte von etwa 10 und Kurven mit begrenzten Variation zeigen erfolgreiche und robuste reverse Transkription, Vorverstärkung und qPCR-Analyse in alle Wells. (F) Intensität (links) und Verstärkung Plot (rechts) eines fehlerhaften Gens normalisiert. Die normalisierte Intensitäten bilden keine Kurve und der Verstärkung-Plot zeigt große Spitzen Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In den letzten Jahren ist Ausdruck von einzelligen Genanalyse eine wertvolle Ergänzung zu definieren, die Heterogenität der einzelnen Zelle Bevölkerungen23geworden. Das Aufkommen der RNA Sequenziertechnologien theoretisch bietet die Möglichkeit, das gesamte Transkriptom einer Zelle zu messen, aber diese Methoden durch Variationen in tiefen von Zelle zu Zelle Sequenzierung und Aussteiger kompliziert sind. Einzellige qPCR bietet eine sensible und robuste Analyse des Ausdrucks von Hunderten von kritischen Genen wo alle Zellen werden ebenso behandelt, technische Lärmminderung. Die zielgerichtete Analyse von einer begrenzten Anzahl von Abschriften ermöglicht darüber hinaus für eine vereinfachte Analyse ohne Einmischung von stark exprimierten Gene.
Da der Ansatz nur eine Teilmenge der Gene in den Zellen untersucht, ist es sehr wichtig, den richtigen Satz von Genen zu wählen, wenn das Gen-Panel zu entwerfen. Die Wahl von Genen kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden; durch Literatur, bisherigen Erkenntnissen durch Massenanalyse und Bioinformatik Analyse öffentlich verfügbarer Daten. Das ist nicht unbedeutend; mit den richtigen Satz von Genen kann jedoch der Ansatz sehr mächtig. Wenn das Gen-Panel entwickelt wurden, ist es wichtig zu überprüfen, ob die Primer während Multiplexen nicht beeinträchtigt werden. Hier empfehlen wir Analyse, wenn die Primer linear sind, durch eine Verdünnungsreihe mit reichlich Stoff Vorformen; eine Verdünnung, die Serie in dieser Studie verwendeten Primer in ergänzenden gezeigt ist Figur 2D in Warfvinge Et al. 22
Die zwei wichtigsten Einschränkungen des hier vorgestellten Protokolls sind die begrenzte Anzahl von Zellen und Gene untersucht. Jedoch Obwohl bei jedem Durchlauf nur 96 Zellen untersucht werden, dieses relativ einfache Protokoll kann in einem Tag abgeschlossen werden und somit Hunderte von Zellen in einer Woche analysiert werden können. Darüber hinaus konnte die Anzahl der Gene untersucht gesteigert werden, wenn weitere Primer in der Target-spezifische Vorverstärkung Schritt enthalten sind. In diesem Fall sind mehrere Chips benötigt, um jeden Satz von 96 Primer zu untersuchen.
Wenn Gene oder Zellen mit stark ausgedrückt hohe RNA-Gehalt werden analysiert, die Anzahl der Zyklen optimiert für hämatopoetische Stammzellen mit niedrigen insgesamt gen Ausdruck23 geändert werden sollte. Ändern Verstärkung Zyklen ist auch wichtig, bei der Untersuchung von Bulk-Populationen. Für Massenanalyse von hämatopoetischen Stammzellen (100 Zellen) empfehlen wir die Verringerung der Menge an Vorverstärkung Zyklen von 25 auf 18.
Die häufigsten Gründe für Fehler beim läuft aufgrund der erfolglosen Sortierung der Einzel-Zellen in den Brunnen der Lyse Platte, Sortierung der nicht lebensfähige Zellen, suboptimale Vorverstärkung oder Chip Ladefehler. Die Rox-Ebene in jede Reaktionskammer ist ein Indikator für die Belastung der Probe oder Assay, und wenn diese niedrig sind, es wird empfohlen, dass die Proben auf einem neuen Chip seit niedrigen Rox erneut ausgeführt werden, die Ebenen wahrscheinlich durch Einführung von Luftblasen während des Ladens verursacht sind. Mangel an dotierten Eingabesteuerelement RNA Ausdruck ist ein Indikator für das Pre-Amps sind gescheitert, wahrscheinlich aufgrund von Problemen mit Vorverstärkung- oder reverse Transkription Reagenzien. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass ein neuer Chip mit neu sortierten Zellen und neue Reaktionspartner ausgeführt wird. Erkennung des Steuerelements RNA aber keine Anzeichen für andere Genexpression Signale Aufschluss über erfolglose einzellige FACS vor gen Expressionsanalyse Sortierung ist. Zur Vermeidung von Fehlern während der FACS sortieren es ist darauf zu achten, dass die einzelnen Zellen in der Mitte jedes gut sortiert sind. Dies kann durch Sortieren von Perlen in einen leeren Teller und visuell prüfen, wo der Tropfen landet. Achten Sie darauf, Test-Art in alle Vertiefungen in die Kanten der Platte um sicherzustellen, dass die Einrichtung nicht nur für die ersten paar Brunnen stimmt. Wenn zutreffend, Einzel-Zellen können parallel für in-vitro- Wachstum sortiert und analysiert vor der qPCR Analyse zur Kontrolle für erfolgreiche Sortierung Protokolle. Index-Sortierung Informationen lässt sich nicht nur für die Untersuchung der Immunophenotyped von einer molekular unterschiedliche Subpopulation aber bieten auch nützliche Erkenntnisse bei der Problembehandlung Wenn Sie einer undefinierten Bevölkerung sortieren und viele minderwertige Zellen sind in den einzelligen Genanalyse Ausdruck vorhanden. Die Index-Sortierung Informationen lässt sich die gating-Strategie zu optimieren und zukünftige Sortierung von minderwertigen Zellen zu vermeiden.
Einzellige gen Expressionsanalyse revolutioniert wie heterogen Zelle Populationen untersucht werden und ebnet den Weg für das weitere Verständnis der Zelldifferenzierung. In Hämatopoese einzellige gen Expressionsanalyse verwendet wurden, um Sortierstrategien für Teilmengen von HSZ7, zu verfeinern, um die Heterogenität der multipotenten Vorläuferzellen Populationen6,24,25 zu beheben , und Therapie unempfindlich leukämischen Stammzellen Populationen22,26zu identifizieren. Kombination von Index sortieren mit einzelligen gen - Expression und Funktionsanalyse hat zuvor nachweislich zuverlässig und effizient bei der Untersuchung von Immunophenotype und Heterogenität der verschiedenen Populationen27, 28,29. Hier, einen Ansatz für die Untersuchung von molekularen und Immunophenotypic Heterogenität der Zelle Bevölkerungen wurden beschrieben in der Kombination von einzelligen qPCR mit Index sortieren ermöglicht schnelle und reproduzierbare Ergebnisse ohne komplizierte Analyse in kurzer Zeitrahmen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse vom schwedischen Krebsgesellschaft, The Swedish Research Council, der schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung, die schwedische Kinderkrebsstiftung, die Ragnar Söderberg Foundation, und The Knut und Alice Wallenberg Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
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