Summary
Her beskriver vi en co-immunoprecipitation-protokoll for å studere protein-protein interaksjoner mellom endogene kjernefysiske proteiner under hypoxic forhold. Denne metoden er egnet for demonstrasjon av samspillet mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer på hypoksi.
Abstract
Lavt oksygennivå (hypoksi) utløse en rekke adaptive svar med hypoksi-induserbart faktor 1 (HIF-1) kompleks som en master regulator. HIF-1 består av en heterodimeric oksygen regulert α undergruppe (HIF-1α) og constitutively uttrykt β delenhet (HIF-1β) også kjent som aryl hydrokarbon reseptor kjernefysiske translocator (ARNT), regulerer gener involvert i ulike prosesser inkludert angiogenese , erythropoiesis og Glykolysen. Identifikasjon av HIF-1 samspill proteiner er nøkkelen til forståelsen av hypoksi signalveien. I tillegg til regulering av HIF-1α stabilitet utløser hypoksi også kjernefysiske translokasjon av mange transkripsjonsfaktorer inkludert HIF-1α og ARNT. Spesielt, er de fleste av dagens metoder brukes til å studere slik protein-protein interaksjoner (PPIs) basert på systemer der protein nivå er kunstig økt gjennom protein overuttrykte. Protein overuttrykte ofte fører til ikke-fysiologiske resultater som følge av timelige og romlig gjenstander. Her beskriver vi en modifisert co-immunoprecipitation protokollen etter hypoksi behandlingssøkende endogene kjernefysiske proteiner, og som et bevis på konseptet, å vise interaksjonen mellom HIF-1α og ARNT. I denne protokollen, hypoxic cellene ble høstet under hypoxic forhold og Dulbecco's Phosphate-Buffered saltvann (DPBS) vaskebuffer var også pre equilibrated hypoxic forhold før behandling å begrense protein fornedrelse eller protein kompleks dissosiasjon under reoxygenation. I tillegg kjernefysiske fraksjoner ble senere trukket ut å konsentrere seg og stabilisere endogene kjernefysiske proteiner og unngå mulige falske resultater ofte sett under protein overuttrykte. Denne protokollen kan brukes å demonstrere endogene og native interaksjoner mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer under hypoxic forhold.
Introduction
Hypoxia oppstår når utilstrekkelig oksygen angis til celler og vev i kroppen. Det spiller en avgjørende rolle i ulike fysiologiske og patologiske prosesser som stamcelleforskningen differensiering, betennelse og kreft1,2. Hypoksi-induserbart faktorer (HIFs) fungerer som heterodimerer består av en oksygen regulert α delenhet og en constitutively uttrykt β delenhet ARNT3også. Tre isoformene HIF-α underenheter (HIF-1α, HIF-2α og HIF-3α) og tre HIF-β underavdelinger (ARNT/HIF-1β, ARNT2 og ARNT3) har blitt identifisert hittil. HIF-1α og ARNT uttrykkes overalt, mens HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 og ARNT3 har mer begrenset uttrykk mønstre4. HIF-1 proteinet er viktig regulator av hypoksi respons. Under hypoxic forhold, HIF-1α blir stabilisert, translocates til kjernen og dimerizes med ARNT5. Deretter Dette komplekset binder til spesifikke nukleotider kjent som hypoksi forståelsesfull elementer (HREs) og regulerer uttrykket av målet gener involvert i ulike prosesser inkludert angiogenese, erythropoiesis og Glykolysen6. I tillegg denne "kanoniske" respons, hypoksi signalveien kalles også å crosstalk med flere cellulær respons signalnettverk trasé som hakk og kjernefysiske faktor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
Identifikasjon av romanen HIF-1 samspill proteiner er viktig for en bedre forståelse av hypoksi signalveien. I motsetning til ARNT, som ufølsom for oksygen og constitutively uttrykt, er HIF-1α protein nivå tett regulert av mobilnettet oksygennivået. På normoxia (21% oksygen) er HIF-1α proteiner raskt dårligere10,11. Den korte halveringstiden av HIF-1α på normoxia presenterer bestemte tekniske utfordringer for påvisning av protein fra cellen ekstrakter og identifikasjon av HIF-1α-samspill proteiner. Videre translocate flere transkripsjonsfaktorer inkludert de av HIF-1 komplekset i kjernen under hypoxic forhold12,13,14. De fleste av dagens metoder brukes for PPI studier utføres ved hjelp av ikke-fysiologiske overuttrykte proteiner. Slike protein overuttrykte har blitt rapportert til forskjellige mobilnettet defekter gjennom flere mekanismer, inkludert ressurs overbelastning, stoichiometric ubalanse, promiskuøse interaksjoner og veien modulering15,16. I PPI studier, kan protein overuttrykte føre til falsk positiv eller selv falsk negativt, resultater avhengig av protein egenskapene og funksjonene til overexpressed proteiner. Gjeldende metoder for PPI studier har derfor, for å avsløre de fysiologisk relevante PPIs under hypoxic forhold. Vi har tidligere vist samspillet mellom HIF-1 og Ets familie transkripsjon faktoren GA-bindende protein (GABP) i hypoxic P19 celler, noe som bidrar til responsen til Hes1 promoter hypoksi17. Her beskriver vi en co-immunoprecipitation-protokoll for å studere PPIs mellom endogene kjernefysiske proteiner under hypoxic forhold. Samspillet mellom HIF-1α og ARNT vises som et bevis på konseptet. Denne protokollen er egnet for å vise interaksjonen mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer under hypoxic forhold, inkludert men ikke begrenset til identifisering av HIF-1 samspill proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen delen, som bruker menneskelige embryonale nyre 293A (HEK293A) celle, s følger retningslinjene for menneskelig forskning etikk i Nanyang Technological University, Singapore.
1. innledning av oksygenmangel i HEK293A celler
- Forberede fire 10 cm retter og frø 3 – 5 x 106 HEK293A celler per fat i 10 mL Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM, 4,5 finans glukose) supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 110 mg/L natrium pyruvate, 100 U/mL penicillin og 100 mg / mL streptomycin. Kultur cellene i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Merk: Cellen såing bør gjennomføres i en biologiske sikkerhetskabinett kabinett (BSC). Overflater av alle materialer som skal plasseres i BSC tørkes med 70% etanol. - 24 timer etter seeding, når cellene har nådd 80-90% confluency, sette to retter i hypoksi subchamber i inkubator glovebox'en (se Tabell for materiale) med 1% O2 og 5% CO2 på 37 ° C, og holde de to andre retter på normoxia (21% O 2, 5% CO2 på 37 ° C) for 4 h. bruke ett sett med normoxic og hypoxic celler å evaluere hypoksi behandling ved western blot og utnytte det andre settet med celler for co-immunoprecipitation eksperimenter.
Merk: Oksygennivå kan settes til 0-5%, og varigheten av hypoksi behandling kan varieres avhengig celle og studere mål.
2. hele cellen og kjernefysiske utvinning
Merk: Se tabell 1 for buffere i denne protokollen.
-
Høste normoxia kontroll cellene.
- Fjerne kultur media ved aspirasjon og skyll cellene med 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) bruker en 10 mL pipette.
Merk: Unngå å berøre den cellen monolayer med pipette. Under vasken, Pipetter forsiktig DPBS ned veggen av celle kultur plate for å unngå tap av cellen. - Pipetter 5 mL iskalde DPBS inn platen og skrap cellene av overflaten av platen i iskalde PBS med cellen skraper.
- Overføre celle suspensjon til 15 mL konisk rør og holde på isen.
- Fjerne kultur media ved aspirasjon og skyll cellene med 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) bruker en 10 mL pipette.
-
Høste celler kultivert under hypoxic forhold.
- Pre equilibrate DPBS hypoxic forhold ved å plassere en avdekket 100 mL eksperiment glass reagensflasken fylt med DPBS i hypoksi subchamber (1% O2 og 5% CO2 på 37 ° C) for 24 timer i forveien.
- Ca 1 time før høsting hypoksi behandlet cellene, Plasser en isen boksen som inneholder is til behandling Mysteriekammeret glovebox'en, som har vært equilibrated 1% O2 og 5% CO2. Overføre flasken inneholder den pre equilibrated hypoxic DPBS fra hypoksi-subchamber til behandling chamber og plassere den på is.
- 4 h etter hypoksi behandling, overføre cellene fra hypoksi-subchamber til behandling kammeret som har vært pre equilibrated 1% O2 og 5% CO2.
- Fjerne kultur media ved aspirasjon og skyll cellene når med 10 mL iskald pre equilibrated hypoxic DPBS med en 10 mL pipetter.
- Legge til 5 mL iskald pre equilibrated DPBS med en 5 mL Pipetter og fjerne cellene ved skraping med en celle skraper.
- Tilt celle kultur plate og samle frittliggende cellene med en 10 mL pipette. Overføre celle suspensjon i DPBS til 15 mL konisk rør og holde på isen.
- Åpne døren mellom behandling og buffer kammer av en glovebox, begge har vært pre equilibrated 1% O2 og 5% CO2. Overføring 15 mL konisk rørene på is som inneholder hypoksi behandlet celler fra behandling kammer til buffer kammeret. Åpne døren til buffer kammeret og fjerne celler helt fra en glovebox.
- Pellets både normoxic cellene fra 2.1 og hypoxic cellene fra 2.2 med sentrifugering 1000 x g i 5 min på 4 ° C.
-
Forberede hele cellen ekstrakter.
- Resuspend celle pellets i 500 µL av iskalde radio immunoprecipitation analysen (RIPA) lyseringsbuffer inneholder 50 mM Trisaminomethane hydroklorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM natriumklorid (NaCl), 1% tergitol-type NP-40 (NP-40), 0,5% natrium deoxycholate, og 0,1% natrium dodecyl sulfate (SDS), med 1 x protease hemmer cocktail (se Tabell for materiale) av pipettering celle pellets opp og ned flere ganger.
- Overføre celle lysates til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og holde på is 30 min med sporadiske vortexing.
- Sentrifuge celle lysates 13 000 x g i 10 min på 4 ° C.
- Samle på supernatant, aliquot 50 µL nedbryting av i 1,5 mL microcentrifuge rør, og lagre på-80 ° C.
-
Forberede kjernefysiske ekstrakter bruker en kjernefysisk utvinning kit (se tabell for materiale).
- Forsiktig resuspend celle pellets i 500 µL av lysis buffer NL supplert med 1 x protease hemmer cocktail og 0.1 M dithiothreitol (DTT) av pipettering celle pellets opp og ned flere ganger.
- Legg til 25 µL av rengjøringsmiddel NP celle suspensjon og vortex for 10 s med maksimal hastighet.
- Sentrifuger 10.000 x g i 5 min på 4 ° C.
- Samle nedbryting (cytoplasmatiske utdrag), aliquot 50 µL av nedbryting i 1,5 mL microcentrifuge rør, og lagre på-80 ° C.
- Resuspend pellets inneholder cellen atomkjerner i 500 µL av lyseringsbuffer NL supplert med 1 x protease hemmer cocktail og 0.1 M DTT med vortexing for 5 s med maksimal hastighet.
- Sentrifuge 10.000 x g i 5 min på 4 ° C, og lagre det kjernefysiske pellet.
- Resuspend den kjernefysiske pellet i 50 µL av utvinning Buffer NX1 supplert med 1 x protease hemmer cocktail av pipettering pellet opp og ned flere ganger.
- Inkuber for 30 min på is, vortexing for 10 s hver 5 min med maksimal hastighet.
- Sentrifuger 12.000 x g i 10 min på 4 ° C.
-
Desalt kjernefysiske ekstrakter.
- Samle nedbryting fra trinn 2.5.9 og overføre til mini dialyse enheter med største volum 100 µL per enhet.
- Cap mini dialyse enhetene og plassere dem i en flotasjon enhet.
- Sett flotasjon enheten i et beaker med 500 mL pre kjølt dialyse buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glyserol, 100 mM kalium klorid (KCl), 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) og 0,5 mM DTT) og ruge i 30 min på 4 ° C med mild omrøring.
Forsiktig: PMSF er farlig. Unngå direkte kontakt med huden eller innånding. - Samle prøvene fra hjørnet av mini dialyse enhetene og overføre til nye 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Sentrifuge 12.000 x g i 10 min ved 4 ° C, aliquot 25 µL av hver nedbryting i en 1,5 mL microcentrifuge tube, og lagre på-80 ° C.
3. evaluering av hypoksi behandling av gjenkjenning av Protein uttrykk og Subcellular lokalisering av HIF-1α
- Bestemme protein konsentrasjonen av hele cellen eller kjernefysiske/cytoplasmatiske ekstrakter bruker microplate analysen av et bicinchoninic syre (BCA) protein analysen kit i henhold til produsentens instruksjoner18.
- Fortynne celle lysates i 1 x Laemmli eksempel buffer inneholder 5% 2-Mercaptoethanol og kok til 95 ° C i 5 minutter.
Forsiktig: Berør ikke overflaten av oppvarming blokken, siden det kan forårsake brannskader. -
Separate proteiner av natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side).
- Laste inn like mye protein (25 µg) i hver brønn en SDS side precast gradient gelé (4-20%), sammen med 3 µL av molekylvekt merket.
- Kjør gel kjører buffer med 2,5 Tris, 19,2 mM glysin, 0,01% SDS, PH8.3 i 30 min 200 V.
-
Overføre proteiner til fra gel til nitrocellulose membranen.
- Samle overføring sandwich (filter papir-gel-membran-filter papir) gel på siden anode og membranen på katoden side av kassetten.
- Sett kassetten i overføring tanken fylt med overføring buffer med 2,5 trisaminomethane (Tris), 19,2 mM glysin og 20% metanol.
FORSIKTIG: Metanol er brannfarlig og skal lagres i brennbar væske lagring skap. - Gjennomføre overføringen 1t 100 V på kalde rommet.
- Blokkere blot i 10 mL blokkerer buffer inneholder 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1 mellom 20 og 5% ikke-fett melk 1t ved romtemperatur i en shaker.
- Inkuber blot med anti-HIF-1α antistoff (1/500 fortynning) i samme blokkerer bufferen overnatting på 4 ° C.
- Vask blot 3 ganger i 5 min hver gang med 50 mL TBS-T.
- Inkuber blot med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundære antistoff (1/1000 fortynning) i 10 mL TBS-T som inneholder 5% ikke-fett tørr melk 1t ved romtemperatur.
- Vask blot 3 ganger i 5 min hver gang med 50 mL TBS-T.
- Mix 500 µL hver av forbedret chemilumescent (ECL) reagens A og B i en 1,5 mL microcentrifuge rør og vortex kort.
- Bruke ECL underlaget blot og ruge i 1 min i romtemperatur.
-
Ta chemiluminescent signalene bruker en kostnad - sammen enhet (CCD) kamera-baserte tenkelig system.
- Avløp overskytende ECL substrat ved å berøre kanten av membranen med en papir og plassere membranen i en ark beskytter.
- Plass membranen eksempel skuffen på CCD kamera-baserte tenkelig system.
- Starte bildebehandling (se Tabell for materiale) og ta bilder med følgende innstillinger: fil → nye protokollen → enkeltkanals → konfigurere protokollen → Gel imaging (programmet: Chemi; Tenkelig område: Bio-radian klar gel; Imaging eksponering: Programvaren vil automatisk optimalisere eksponeringstid for intens band) → Kjør protokollen
Merk: Eksponeringstid kan angis manuelt å oppnå optimale bilder.
4. Immunoprecipitation og oppdagelse av Immunoprecipitated proteiner
- Vaske 50 µL av protein A/G sepharose perler i 500 µL av TBS buffer i 1,5 mL microcentrifuge rør og pellets perler med sentrifugering 3000 x g i 2 minutter på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og resuspend perler i 100 µL TBS bufferen.
- Legg 2 µL av musen monoklonale anti-ARNT antistoff (1,4 mg/mL) eller mus immunglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL) som ble utarbeidet av gjenoppbygge 0,7 mg musen IgG 500 µL TBS buffer.
- Plasser 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder perlene i et rør rotator og ruge 2 h 10 RPM i kalde rommet.
Merk: Håndtere rør forsiktig og holde suspensjon som inneholder perler nederst på røret. - Pellets perler med sentrifugering 3000 x g i 2 minutter på 4 ° C og kast supernatants.
- Fortynne 200 µg av kjernefysiske protein lysate fikk i trinn 2.6.5 i 800 µL IP bufferstørrelsen som består av 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glyserol, 0,2% NP-40 og 1 x protease hemmer cocktail. Ruge på lysate med antistoff-kombinert perler fikk i trinn 4.5 overnatting på 4 ° C.
- Pellets perler med sentrifugering 3000 x g i 2 minutter på 4 ° C, forkaste supernatants og vaske perlene 3 ganger med 1 mL iskald TBS 0,2 prosent NP-40.
- Kok perlene i 50 µL Laemmli eksempel buffer ved 95 ° C i 5 minutter.
- Sentrifuge perler på 10.000 x g i 5 min på 4 ° C, samle nedbryting og kaste perler.
Merk: Nedbryting kan lagres på 4 ° C på kort sikt eller 20 ° C på lang sikt. - Oppdage tilstedeværelsen av HIF-1α fra immunoprecipitated protein komplekser ved western blot som tidligere beskrevet i trinn 3.3 og utover.
Merk: Protein kvantifisering kreves ikke for dette trinnet. Laste inn full volum (50 µL) nedbryting av hver prøve av i hver brønn en SDS side precast gradient gelé (4-20%)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere i cellulær respons til hypoksi, uttrykket nivåer og subcellular lokalisering av komponentene i HIF-1 komplekse følgende hypoksi behandling ble undersøkt. HEK293A celler ble kultivert hypoxic vilkår 4 h eller holdt på normoxia kontroller. HIF-1α og ARNT protein nivå ble undersøkt i hele cellen eller kjernefysiske/cytoplasmatiske ekstrakter ved western blot. Som forventet, total HIF-1α nivåer var upregulated av hypoksi, mens ARNT nivåer i totale mobilnettet lysates ikke var betydelig endret (figur 1A). I tillegg indusert hypoksi kjernefysiske opphopning av både HIF-1α og ARNT i HEK293A celler (figur 1B), som er i samsvar med tidligere rapporter, selv om cytoplasmatiske uttrykk for ARNT ikke ble funnet i noen av de testede celle linjer19.
Neste, vi viste samspillet mellom HIF-1α og ARNT etter hypoksi behandling. Kjernefysisk ekstrakter var forberedt fra HEK293A cellene utsatt for normoxic eller hypoxic betingelser for 4 h. Co-immunoprecipitation eksperimenter ble utført med kjernefysiske utdrag fra HEK293A celler. Som vist i figur 2, var HIF-1α co-immunoprecipitated sammen med ARNT fra kjernefysiske ekstrakter hypoxic HEK293A celler.
Sammen protokollen beskrevet kan med hell brukes til induserer hypoxic svar i celler og hvis du vil fastslå fysiologiske protein binding av endogenously uttrykt HIF-1α/ARNT komplekser i kjernen.
Figur 1: Regulering av protein uttrykk og subcellular lokalisering av HIF-1 komponenter av hypoksi. (A) Immunoblot analyse av totale HIF-1α eller ARNT uttrykket i HEK293A celler. Cellene ble utsatt for hypoksi 4 h (H) eller holdt på normoxia (N). Proteiner fra hele celle ekstrakter var atskilt med SDS side og analyseres av immunoblotting med anti-HIF-1α, anti-ARNT og anti-glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) antistoffer. GAPDH ble brukt som en lasting. (B) Immunoblot analyse av HIF-1α og ARNT uttrykk i subcellular fraksjoner av HEK293A celler. HEK293A celler ble kultivert hypoxic vilkår 4 h (H) eller holdt på normoxia (N). 25 µg protein fra kjernefysiske eller cytoplasmatiske ekstrakter ble analysert av immunoblotting anti-HIF-1α, anti-ARNT, anti-yin og yang 1 (YY1) og anti-GAPDH antistoffer. YY1 og GAPDH ble brukt som lasting kontroller for kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: HIF-1α samhandler med ARNT hypoxic vilkår. HEK293A celler ble utsatt for hypoksi 4 h eller holdt på normoxia kontroller. Kjernefysisk utdrag fra HEK293A cellene var forberedt og immunoprecipitations ble utført med et anti-ARNT antistoff. Kjernefysiske ut (innganger) og immunoprecipitated proteiner ble analysert av immunoblotting ved hjelp av anti-HIF-1α, anti-ARNT og anti-YY1 antistoffer. YY1 ble brukt som en lasting innganger mens IgG ble brukt som kontrollen negative for co-immunoprecipitation eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsning | Komponenter | Kommentarer |
| Dialyse buffer | 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20% glyserol, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF og 0,5 mM DTT | Legge til PMSF og DTT umiddelbart før bruk. |
| Kjører buffer | 2,5 Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glysin og 0,01% SDS | Bland 100 mL 10 x Tris/glysin/SDS buffer med 900 mL ddH2O. |
| Overføre buffer | 2,5 Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glysin og 20% metanol | Bland 100 mL 10 x Tris/glysin buffer med 200 mL metanol og 700 mL ddH2O. |
| TBS-buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6) og 150 mM NaCl | Bland 100 mL 10 x TBS buffer med 900 mL ddH2O. |
| TBS-T buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl og 0,1% mellom 20 | Mix 100 mL 10 x TBS buffer med 900 mL ddH2O og 1 mL av mellom 20. |
| Blokkerer buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0,1% mellom 20 og 5% ikke-fett melk | Oppløse 5 g av Blotting-Grade blokkering i 100 mL TBS-T buffer. |
| IP-buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glyserol, 0,2% NP-40 og 1 x protease hemmer cocktail | Legg protease hemmer cocktail umiddelbart før bruk. |
Tabell 1: Løsning forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIF-1 komplekset er en master regulator mobilnettet oksygen homeostasis og regulerer en mengde tilblivelse involvert inne forskjellige mobilnettet adaptive svar til hypoksi. Identifikasjon av romanen HIF-1 samspill proteiner er viktig for forståelsen av hypoxic signaltransduksjon. Co-immunoprecipitation eksperimenter brukes vanligvis for PPIs studier for å avgrense mobilnettet signaltransduksjon trasé. Men protein overuttrykte er fremdeles mye brukt, og dette kan føre til eksperimentelle gjenstander. I tillegg HIF-1α er et svært ustabile protein og blir raskt dårligere under re oksygenering11. I tillegg utløser hypoksi kjernefysiske translokasjon HIF-1 komponenter i de fleste pattedyr linjer. Konvensjonelle co-immunoprecipitation protokollene må derfor være optimalisert for identifikasjon av fysiologisk relevante HIF-1 samspill proteiner etter hypoksi behandling. Her beskriver vi en modifisert co-immunoprecipitation-protokoll som brukes til å vise interaksjonen mellom HIF-1α og ARNT på hypoksi.
For å unngå nedbrytning av HIF-1α under re oksygenering, ble hypoxic cellene høstet i behandling Mysteriekammeret inkubator glovebox'en som var pre equilibrated hypoxic forhold. Vaskebuffer DPBS var også equilibrated hypoxic forhold før bruk. Hvis det er ingen hypoksi arbeidsstasjon tilgjengelig for behandling, kan hypoxic cellene vasket med pre equilibrated hypoxic DPBS og deretter høstet raskt på is. Vurderer at hypoksi kan utløse kjernefysiske translokasjon av HIF-1 komponenter og at protein overuttrykte kan indusere artefactual resultater, ble endogen kjernefysiske proteiner brukt i denne protokollen. Bruk av kjernefysisk ekstrakter i co-immunoprecipitation protokollen har også blitt rapportert av andre20. Det representerer en teknisk fordel for studiet av interaksjoner mellom kjernefysiske proteiner, fordi det reduserer sjansen for kjernefysisk proteiner fra blir utvannet ut av hele celle proteiner. Videre kan bruk av kjernefysisk ekstrakter være nyttig for reduksjon av ikke-spesifikk samspill, spesielt fra svært rikelig irrelevante cytoplasmatiske proteiner, og forbedring av kjernefysiske protein stabilitet ved å minimere eksponering proteaser i cytoplasma. Bruk av endogene kjernefysiske utdrag stedet for hele cellen ekstrakter for co-immunoprecipitation viser en betydelig teknisk forbedring, som vi finner bare samspillet mellom HIF-1α og GABPα bruker endogene kjernefysiske ekstrakter, men ikke bruker hele cellen ekstrakter17.
I beskrevet protokollen, kan flere betingelser være ytterligere optimalisert for å forbedre resultatene. Vi indusert oksygenmangel i HEK293A celler ved å behandle dem med 1% oksygen 4 h. Men oksygen nivåer og varigheten av hypoksi behandling kan variere for forskjellige celletyper, og justert i henhold til målene av studien. For eksempel HIF-1α og HIF-2α kan være ulikt regulert av hypoksi i en celle type bestemt måte, som indikerer deres forskjellige roller i ulike biologiske sammenhenger. Det har vist at neuroblastom celler, HIF-1α er mest aktiv i korte perioder med intens hypoksi (1% O2), mens HIF-2α er også aktiv under mild hypoksi (5% O2) og blir mer aktive følgende kronisk hypoksi behandling (48-72 timer med hypoxic eksponering)21. 0-5% O2 nivåer brukes vanligvis for i vitro hypoksi behandlinger, hvor 1 – 5% O2, 0,1 til 1% O2 og 0-0,1% O2 er ofte definert som mild hypoksi og hypoksi, anoxia, henholdsvis22. Saltkonsentrasjon er en annen parameter som krever optimalisering, spesielt siden det spiller en avgjørende rolle for ioniske interaksjoner i PPIs23. Kjernefysisk ekstrakter ble brukt i denne studien med kjernefysiske proteiner vanligvis utdraget benytter en buffer som inneholder høye konsentrasjoner av salt. Derfor må kjernefysiske ekstrakter være avsalte før co-immunoprecipitation eksperimenter. Her, desalted vi kjernefysiske ekstrakter bruker dialyse bufferen som inneholder 100 mM KCl og blandet dialyzed ekstrakter med IP bufferen som inneholder 180 mM NaCl proporsjonalt for å oppnå en siste saltkonsentrasjon nær 150 mM, som er lik fysiologiske intracellulær PPIs forhold. Den endelige saltkonsentrasjon kan endres avhengig av egenskapene til PPIs rundt. I denne protokollen, ble GAPDH brukt som en lasting for hele cellen ekstrakter og cytoplasmatiske fraksjoner. Vi observerer ikke en betydelig hypoksi-indusert regulerende effekt på GAPDH uttrykk i HEK293A celler. Men har GAPDH tidligere vist å være upregulated av oksygenmangel i visse cellen typer24. En må bruke alternativ riktig lasting kontroller når det er nødvendig med dette i bakhodet,25. Separat, observerte vi en betydelig grad av bakgrunn signal stammer fra enten perler eller antistoffer brukes i gjeldende protokollen. For å redusere bakgrunnen, kan forlenge vask trinnene (10-15 min) eller utfører mer enn 3 vasker (5-10 ganger). Ioniske styrke vaskebuffer kan eventuelt også økes ved titrating salt konsentrasjonen fra 150 til 500 mM under vasker. Lysates kan også være godkjent på forhånd av rugende med protein A/G sepharose perler 1t på 4 ° C med rotasjon.
Denne protokollen er begrenset til kjernefysiske ekstrakter og som sådan kan ikke være egnet for studiet av PPIs i andre cellulære avdelinger som mitokondrier og det endoplasmatiske retikulum. Ligner andre konvensjonelle co-immunoprecipitation protokoller, denne metoden kan ikke brukes til å studere PPIs i sanntid eller å fastslå om PPIs er direkte eller indirekte.
I sammendraget gir vi en modifisert co-immunoprecipitation-protokoll for identifikasjon av romanen fysiologisk relevante HIF-1 samspill proteiner. Denne protokollen er også egnet for studiet av interaksjoner mellom transkripsjonsfaktorer og transcriptional co regulatorer under hypoxic forhold. Selv om denne protokollen er utformet spesielt for co-immunoprecipitation eksperimenter under hypoksi forhold, kan en del av beskrevet protokollen for normoxia kontroll cellene også brukes til å studere de kjernefysiske PPIs under normoxia forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Assoc. Prof synd Tiong Ong for bruk av hypoksi arbeidsstasjonen. Dette arbeidet ble støttet av følgende: Singapore Utdanningsdepartementet, MOE 1T1-02/04 og MOE2015-T2-2-087 (til Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University oppstart grant M4230003 (til P.O.B.), den svenske Research Council, den Familie Erling Persson Foundation, Novo Nordisk stiftelsen Stichting af Jochnick Foundation, den svenske Diabetes Association, Scandia forsikringsselskapet, Diabetes Research og velvære Foundation, køye von Kantzow Foundation, den Strategisk forskningsprogram i Diabetes ved Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, og Knut og Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
