Summary
Burada bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasındaki protein-protein etkileşimler çalışmaya açıklar. Bu yöntem gösteri transkripsiyon faktörleri ve hipoksi, transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler için uygundur.
Abstract
Düşük oksijen düzeyleri (hipoksi) hipoksi-indüklenebilir faktörü 1 (kurulan-1) bir ana düzenleyici hareket karmaşık adaptif yanıt çeşitli tetikler. Kurulan-1 bir heterodimeric oksijen düzenlenir α birimi (kurulan-1α) oluşur ve yapısal genler angiogenez dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde dahil düzenleyen β alt birim (kurulan-1β) olarak da bilinen aril hidrokarbon reseptör nükleer ışınlama (ARNT), ifade , arttığından ve glikoliz. Kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması yolu sinyal hipoksi anlama anahtarıdır. Kurulan-1α istikrar düzenlemenin yanı sıra, hipoksi da kurulan-1α ve ARNT dahil olmak üzere birçok transkripsiyon faktörleri nükleer translocation tetikler. Özellikle, bu tür protein-protein etkileşimleri (PPIs) eğitim için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu nerede protein düzeyleri Yapay protein overexpression artan sistemleri temel alır. Protein overexpression kez zamansal ve mekansal yapılardan kaynaklanan fizyolojik olmayan sonuçlara yol açar. Burada biz değiştirilmiş bir co-immunoprecipitation tarif protokol endojen nükleer proteinler hipoksi tedavi sonrasında ve kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi göstermek için kavramının bir kanıtı olarak. Bu iletişim kuralı, hipoksik hücrelerin hipoksik koşullarda hasat edildi ve Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (DPBS) yıkama arabellek ayrıca protein yıkımı veya protein kompleksi azaltmak için kullanımdan önce hipoksik koşulları için önceden denge ayrılma sırasında reoxygenation. Ayrıca, nükleer kesirler daha sonra konsantre ve endojen nükleer proteinler stabilize ve sık görülen bir protein overexpression sırasında olası sahte sonuçları önlemek için elde. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve transkripsiyon Co düzenleyiciler hipoksik koşullarda endojen ve yerel Hofstede göstermek için kullanılabilir.
Introduction
Yetersiz oksijen hücre ve vücut dokuları sağlandığında hipoksi oluşur. Kök hücre farklılaşması, inflamasyon ve kanser1,2gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler kritik bir rol oynar. Hipoksi-indüklenebilir faktörler (HIFs) oluşan bir oksijen düzenlenir α alt birim ve yapısal ifade β alt birim olarak da bilinen ARNT3heterodimers işlev. Kurulan-α alt birimleri (kurulan-1α, kurulan-2α ve kurulan-3α) ve üç kurulan-β alt birimleri (ARNT/kurulan-1β, ARNT2 ve ARNT3) üç izoformlarının bugüne kadar tespit edilmiştir. Kurulan 2α, kurulan-3α, ARNT2 ve ARNT3 daha ifade desenleri4ile ilgili bir kısıtlama ise kurulan-1α ve ARNT ubiquitously, ifade edilir. Kurulan-1 protein kompleksi hipoksi yanıt anahtar düzenleyicisidir. Hipoksik koşullarda kurulan-1α stabilize hale gelir, o zaman için çekirdek translocates ve ARNT5ile dimerizes. Daha sonra bu karmaşık hipoksi duyarlı öğeler (Xact_s_lastresourcemanager) olarak bilinen belirli nükleotit bağlar ve anjiogenezi, arttığından ve glikoliz6dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde ilgili hedef genlerin ifade düzenler. Bu "kanonik" Yanıt yanı sıra, hipoksi sinyal yolu da crosstalk için birden çok hücre tepkisini yolları çentik ve nükleer faktör kappa B (NF-κB) gibi sinyal ile bilinen7,8,9.
Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinlerin daha iyi yolu sinyal hipoksi anlamak için önemlidir. Oksijen seviyesi duyarsız ve yapısal ifade, ARNT aksine kurulan-1α protein düzeyleri sıkıca Hücresel oksijen düzeyleri tarafından düzenlenmektedir. Normoxia (% 21 oksijen) kurulan-1α hızla bozulmuş10,11proteinlerdir. Kurulan-1α kısa yarılanma normoxia, belirli teknik sorunlar hücre özleri protein tespiti için hem de kurulan 1α etkileşim proteinlerin tanımlanması için sunar. Ayrıca, hipoksik koşulları12,13,14altında çekirdek içine kurulan-1 kompleks de dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon faktörleri translocate. ÜFE çalışmaları için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu fizyolojik olmayan overexpression proteinlerin kullanarak gerçekleştirilir. Bu tür protein overexpression kaynak aşırı yük, stokiometrik dengesizlik, önüne gelenle yatıp kalkan etkileşimleri ve yol modülasyon15,16da dahil olmak üzere birden çok mekanizmalar aracılığıyla farklı hücresel kusurları neden olduğu bildirilmiştir. ÜFE çalışmalar açısından yanlış pozitif veya bile yanlış negatif, sonuçlarına bağlı olarak protein özellikleri ve işlevleri overexpressed proteinlerin protein overexpression yol açabilir. Bu nedenle, ÜFE çalışmaları için geçerli yöntemleri fizyolojik ilgili PPIs hipoksik koşullarda ortaya çıkarmak için değiştirilmesi gerekir. Daha önce kurulan-1 ve Ets aile transkripsiyon faktörü Hes1 organizatörü yanıt hipoksi17katkı GA-bağlayıcı protein (GABP) hipoksik P19 hücrelerdeki arasındaki etkileşimi göstermiştir. Burada, bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasında PPIs çalışmaya açıklar. Kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi kavramının bir kanıtı olarak gösterilir. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve hipoksik koşullarda transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimleri gösteren için uygundur dahil ama bunlarla sınırlı olmamak üzere kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan embriyonik böbrek 293A kullanır bu protokolü bölüm (HEK293A) hücre, s insan Araştırma Etik Komitesi Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur ve kuralları izler.
1. indüksiyon HEK293A hücrelerindeki hipoksi
- Dört 10 cm yemekleri ve tohum 3-5 x 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM, 4,5 g/M glikoz) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 2 mM L-glutamin, takıma çanak başına 106 HEK293A hücre hazırlamak 110 mg/L sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin. Bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka hücrelerde kültür.
Not: Hücre tohum bir biyolojik güvenlik kabini (BSC) yapılmalıdır. BSC yerleştirilmesi için tüm malzemeler yüzeylerin % 70 etanol ile sildi. - tohum sonra 24 h hücreleri % 80-90 confluency, ulaştığında kuluçka torpidoda hipoksi subchamber içine iki tabak koymak ( Tablo malzemelerigörmek) ve O % 12 ile % 5 CO2 37 ° C ve diğer iki normoxia (% 21 O yemekleri tutun 2, 37 ° C'de % 5 CO2 ) 4 h için bir dizi normoxic ve hipoksik hücrelerin hipoksi tedavi tarafından western blot değerlendirmek ve diğer co-immunoprecipitation deneyleri için hücre kümesi kullanmak için kullanın.
Not: Oksijen düzeyleri ayarlanabilir 0-%5 ve hipoksi tedavi süresi hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir ve çalışma amacı.
2. tüm cep telefonu ve nükleer çıkarma
Not: Bu protokol için kullanılan arabellekleri hakkında bilgi için bkz. Tablo 1 .
-
Normoxia kontrol hücreleri hasat.
- Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) hücrelerle durulama 10 mL pipet kullanarak.
Not: pipet ile hücre monolayer dokunmaktan kaçının. Yıkama sırasında hücre kaybı önlemek için DPBS hücre kültür plaka duvar aşağı yavaşça pipette. - 5 mL pipet plaka içine buz gibi DPBS ve buz gibi PBS plaka yüzeyi kapalı hücre hücre sıyırıcı kazıyorum.
- Hücre süspansiyon 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve buz üzerinde tutun.
- Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) hücrelerle durulama 10 mL pipet kullanarak.
-
Hipoksik koşullarda kültürlü hücre hasat.
- Hipoksik koşullarına DPBS hipoksi subchamber (%1 O2 ve %5 CO2 37 ° C'de) DPBS dolu bir ele geçen 100 mL deneme cam reaktif şişe için 24 saat önceden yerleştirerek önceden equilibrate.
- Tedavi hipoksi hücre hasat öncesinde yaklaşık 1 h %1 O2 ve %5 CO2equilibrated torpidoda işleme TMMOB buza içeren bir buz kutusu yerleştirin. Hipoksi subchamber üzerinden önceden dengelenmiş hipoksik DPBS işlem odasına içeren şişe aktarmak ve buza koyun.
- hipoksi tedavi, aşağıdaki 4 h %1 O2 ve %5 CO2önceden dengelenmiş oldu işlem odasına hipoksi subchamber hücreleri aktarın.
- Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve hücreleri ile 10 mL 10 mL ile buz gibi önceden dengelenmiş hipoksik DPBS pipet sonra durulayın.
- 5 mL 5 mL ile buz gibi önceden dengelenmiş DPBS pipet ve hücreleri hücre sıyırıcı kazıma çıkarmak ekleyin.
- Hücre kültür plaka eğilme ve 10 mL pipet kullanarak müstakil hücreleri toplamak. DPBS hücre süspansiyon 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve buz üzerinde tutun.
- İkisi de % 1 O2 ve %5 için CO2önceden dengelenmiş olmuştur işleme ve tampon odaları torpidoda arası kapıyı açın. 15 mL Konik Boru işleme odası tedavi hipoksi hücrelerden arabellek odasına içeren buz aktarmak. Arabellek odası kapıyı açıp hücreleri tamamen torpidoda kaldırmak.
- Santrifüjü 1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından hem 2.1 normoxic hücrelerden ve 2.2 hipoksik hücrelerden cips
-
Bütün hücre özleri hazırlayın.
- Buz gibi radyo immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabelleği 50 mM Trisaminomethane hidroklorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM sodyum klorür (NaCl), % 1 tergitol tipi NP-40 (NP-40), % 0.5 sodyum deoxycholate, içeren 500 µL hücre granül resuspend ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile takıma % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), ( Tablo malzemelerigörmek) hücre topakları yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından.
- Hücre lysates yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarmak ve ara sıra vortexing ile 30 dk için buz üzerinde tutun.
- Hücre lysates 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi
- Süpernatant, aliquot 50 µL süpernatant ile 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak ve-80 ° C'de depolayın
-
Nükleer bir çıkarma kullanarak nükleer özleri hazırlayın (tablo malzemeleri görmek) kit.
- Yavaşça lizis arabellek NL 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 0.1 M dithiothreitol (DTT) ile takıma 500 µL hücre granül hücre topakları yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından resuspend.
- Hücre süspansiyon ve 10 için girdap deterjan solüsyonu NP 25 µL eklemek s maksimum hızda.
- 4 ° C'de 5 min için 10.000 x g , santrifüj
- Süpernatant (sitoplazmik özler), aliquot 50 µL süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüpler, içine, toplamak ve-80 ° C'de depolayın
- Hücre çekirdeği içinde 500 µL lizis arabelleği için 5 vortexing 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 0.1 M DTT ile desteklenmiştir NL içeren pelet resuspend s maksimum hızda.
- 10.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve nükleer Pelet kaydedin.
- Nükleer Pelet ayıklama arabellek 1 proteaz inhibitörü kokteyl x ile yukarı ve aşağı birkaç kez Pelet pipetting takıma NX1 50 µL resuspend.
- Kuluçkaya buz üzerinde 30 dk, vortexing 10 s maksimum hızda her 5 dak.
- 4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g , santrifüj
-
Nükleer özler desalt.
- Süpernatant birim başına 100 µL maksimum hacmi ile mini diyaliz cihazların içine adım 2.5.9 ve transfer toplamak.
- Mini Diyaliz cihazları kap ve bir can kurtarma aleti koyun.
- Can kurtarma aleti önceden soğutulmuş diyaliz arabelleği (20 mM Tris-HCl pH 7.4, % 20 gliserol, 100 mM potasyum klorür (KCl), 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 0.2 mM phenylmethylsulfonyl Flor (PMSF) ve 0,5 mM DTT) 500 mL içeren bir ölçek koymak ve nazik karıştırma ile 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
Dikkat: PMSF zararlıdır. Cilt veya inhalasyon ile doğrudan temas önlemek. - Mini Diyaliz cihazları köşesinden örnekleri toplamak ve yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın.
- 12.000 x g 4 ° c, aliquot 25 µL her süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüp içine, 10 min için de santrifüj kapasitesi ve-80 ° C'de depolayın
3. Protein ifade ve kurulan-1α hücre altı yerelleştirme hipoksi tedavisi algılama tarafından değerlendirilmesi
- Tüm cep telefonu protein konsantrasyonu belirlemek veya nükleer/sitoplazmik Mikroplaka tahlil kitinin bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil üreticisinin yönergeleri18göre kullanarak ayıklar.
- 1 x Laemmli örnek arabelleği %5 2-Mercaptoethanol içeren hücre lysates sulandırmak ve 95 ° c 5 dakika kaynatın.
Uyarı: yanıklara neden beri Isıtma blok yüzeyine dokunmayın. -
Proteinler Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez tarafından (SDS-sayfa) ayırın.
- Protein (25 µg) eşit miktarda bir SDS-sayfa prekast degrade jelleri (4-%20), her kuyuya molekül ağırlığı işaret 3 µL ile birlikte yükleyin.
- Jel içeren 2.5 mM Tris, 19.2 mM glisin, % 0,01 SDS, PH8.3 200 V 30 dk için arabellek çalıştırma.
-
Jel üzerinden protein nitroselüloz membran için transfer.
- Transfer sandviç (filtre kağıdı-jel-membran-filtre kağıdı) jel ile anot tarafı ve kaset katot tarafındaki membran üzerinde topla.
- 2.5 mM trisaminomethane (Tris), 19.2 mM glisin ve % 20 metanol içeren aktarım arabellek ile dolu transfer tankı kaset yerleştirin.
Dikkat: Metanol yanıcı ve yanıcı sıvı depolama kabine içinde saklanmalıdır. - Transfer için 1 h 100 V soğuk oda içinde yerine getirir.
- 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, bir shaker üzerinde oda sıcaklığında 1 h için 0,1 ara 20 ve % 5 yağsız süt içeren 10 mL engelleme arabellek blot engelleyin.
- Gecede 4 ° C'de aynı engelleme arabellekte anti-kurulan-1α antikor (1/500 seyreltme) ile leke kuluçkaya
- Leke 50 mL TBS-T. ile her zaman 5 min için 3 kez yıkamak
- Leke horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Konjüge ikincil antikor (1/1000 seyreltme) 10 mL TBS-T içeren % 5 Sigara yağlı kuru süt oda sıcaklığında 1 h için.
- Leke 50 mL TBS-T. ile her zaman 5 min için 3 kez yıkamak
- Mix 500 µL her, gelişmiş chemilumescent (ECL) Reaktif A ve B 1.5 mL microcentrifuge tüp ve girdap kısa bir süre içinde.
- ECL substrat leke için geçerli ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
-
Bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tabanlı görüntüleme sistemi kullanarak chemiluminescent sinyalleri yakalamak.
- Kağıt mendil ile membran kenarına dokunarak aşırı ECL substrat drenaj ve bir levha koruyucu membran yerleştirin.
- Membran kamera tabanlı görüntüleme sistemi CCD örnek tepsiye yerleştirin.
- Görüntü işleme yazılımı başlatmak ( Tablo malzemelerigörmek) ve aşağıdaki ayarlarla çekim: → yeni protokol → tek kanal → protokolü Kur → jel görüntüleme dosya (uygulama: kimya; Görüntüleme alanı: Bio-Rad hazır jel; Pozlama: görüntüleme Yazılımı otomatik olarak yoğun bantları için çekim hızı optimize eder) → Çalıştır iletişim kuralı
Not: Çekim hızı en iyi görüntüleri elde etmek için el ile ayarlanabilir.
4. Immunoprecipitation ve algılama Immunoprecipitated proteinlerin
- TBS arabelleği 1.5 mL microcentrifuge tüpler 500 µL protein A/G sepharose boncuk 50 µL yıkayın ve boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından cips
- Süpernatant atın ve boncuk TBS arabellek 100 µL içinde resuspend.
- Fare monoklonal anti-ARNT antikor (1,4 mg/mL) veya fare immünoglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL) 0.7 mg fare IgG 500 µL TBS arabelleği başlamaktan tarafından hazırlanan 2 µL ekleyin.
- Bir tüp rotator boncuklar içeren 1.5 mL microcentrifuge tüpler yerleştirin ve soğuk odada 10 rpm'de 2 h için kuluçkaya.
Not: tüpler yavaşça işlemek ve tüpün dibinde boncuk içeren süspansiyon tutun. - Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından boncuk cips ve supernatants atın.
- Nükleer protein lysate 180 mM NaCl, % 20 gliserol, % 0,2 NP-40 ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), oluşan IP arabellek adım 2.6.5 800 µL içinde elde edilen 200 µg sulandırmak. Adım 4.5 gecede 4 ° C'de elde antikor birleştiğinde boncuk ile lysate kuluçkaya
- Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından boncuk cips, supernatants atmak ve 3 kez ile 1 mL boncuk yıkama buz gibi TBS % 0,2 içeren NP-40.
- Boncuk 50 µL Laemmli örnek arabelleği 95 ° c 5 dakika kaynatın.
- 10.000 x g 4 ° C'de 5 min için de boncuk santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve boncuk atmak.
Not: Süpernatant 4 ° C-20 ° C veya kısa vadeli için uzun süre saklanabilir. - Daha önce açıklandığı adım 3.3 itibaren Batı leke tarafından kurulan-1α olup olmadığını immunoprecipitated protein kompleksleri gelen belirlemek.
Not: Protein miktar için bu adım gerekli değildir. Tam birim (50 µL) SDS-sayfa prekast degrade jelleri (4-%20) her kuyuya her örnek süpernatant yük
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücresel yanıt hipoksi, ifade olarak değerlendirmek için düzeyleri ve kurulan-1 karmaşık aşağıdaki hipoksi tedavi bileşenlerinin hücre altı yerelleştirme incelenmiş. HEK293A hücreleri 4 h için hipoksik koşullarda kültürlü veya normoxia denetimler olarak devam etti. Bütün hücre içinde kurulan-1α ve ARNT protein düzeyleri incelenmiş veya nükleer/sitoplazmik tarafından western blot ayıklar. Toplam hücresel lysates ARNT düzeyleri önemli ölçüde değildi, ancak beklenen, toplam kurulan-1α düzeyleri hipoksi tarafından upregulated olduğu gibi (Şekil 1A) değiştirilmiş. Ayrıca, nükleer birikimi kurulan-1α ve ARNT sitoplazmik ifade bazı test hücre hatları19tespit edilmedi, ancak önceki raporlar ile tutarlı olan ARNT HEK293A hücrelerinde (Şekil 1B), hipoksi indüklenen.
Daha sonra kurulan-1α ve hipoksi tedavi aşağıdaki ARNT arasındaki etkileşimi gösterdi. Nükleer özler normoxic için maruz HEK293A hücrelerden hazırlanmıştır veya 4 h Co-immunoprecipitation deneyleri için hipoksik koşulları nükleer özler HEK293A hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 2' de gösterildiği gibi kurulan-1α co-immunoprecipitated hipoksik HEK293A hücreleri nükleer özleri gelen ARNT birlikte oldu.
Birlikte ele alındığında, açıklanan protokol başarıyla hücrelerdeki hipoksik yanıt ikna etmek için kullanılabilir ve daha fazla endogenously fizyolojik protein bağlantısını belirlemek için kurulan-1α/ARNT kompleksleri çekirdek içinde dile getirdi.
Şekil 1: Protein ifade ve hipoksi tarafından kurulan-1 bileşenlerinin hücre altı yerelleştirme. (A)HEK293A hücreleri toplam kurulan-1α veya ARNT ifadesinde Immunoblot analizi. Hücreleri hipoksi 4 h (H) için maruz veya normoxia (N) tutulur. Bütün hücre özleri gelen proteinler SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve immunoblotting anti-kurulan-1α, anti-ARNT ve anti-gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) antikorlar tarafından incelendi. GAPDH yükleme denetimi olarak kullanıldı. (B) HEK293A hücrelerinin hücre altı fraksiyonları kurulan-1α ve ARNT ifadede Immunoblot analizi. HEK293A hücreleri için 4 h (H) hipoksik koşullarda kültürlü veya normoxia (N) tutulur. protein nükleer veya sitoplazmik özleri gelen 25 µg anti-kurulan-1α, anti-ARNT, Anti-yin ve yang 1 (YY1) kullanarak immunoblotting tarafından analiz ve anti-GAPDH antikorlar. YY1 ve GAPDH sırasıyla nükleer ve sitoplazmik kesirler için denetimleri yükleme olarak kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Kurulan-1α hipoksik koşullarda ARNT ile etkileşim. HEK293A hücreleri hipoksi 4 h için maruz veya normoxia denetimler olarak devam etti. Nükleer HEK293A hücreleri özler hazırlanmıştır ve immunoprecipitations bir anti-ARNT antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Nükleer (giriş) ayıklar ve immunoprecipitated proteinler anti-kurulan-1α, anti-ARNT ve anti-YY1 antikorları kullanarak immunoblotting tarafından analiz edildi. IgG negatif kontrol co-immunoprecipitation deneyler için kullanılan süre YY1 giriş için bir yükleme denetimi olarak kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözüm | Bileşenleri | Yorumlar |
| Diyaliz arabellek | 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), % 20 gliserol, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF ve 0,5 mM DTT | PMSF ve DTT kullanımdan hemen önce ekleyin. |
| Çalışan arabellek | 2.5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19.2 mM glisin ve % 0,01 SDS | 100 mL 10 Tris/glisin/SDS arabellek x 900 mL GKD2ile O. mix |
| Aktarma arabelleği | 2.5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19.2 mM glisin ve % 20 metanol | 100 mL 10 Tris/glisin arabellek x 200 mL metanol ve 700 mL GKD2O. ile karıştırın |
| TBS arabellek | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) ve 150 mM NaCl | Mix 100 mL 10 x TBS arabellek 900 mL GKD2O. |
| TBS-T arabellek | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl ve % 0.1 ara 20 | Mix 100 mL 10 x TBS arabellek 900 mL GKD2O ve 1 mL Tween 20. |
| Arabellek engelleme | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, % 0,1 ara 20 ve % 5 yağsız süt | Bloting-Grade engelleyici 5 g 100 mL TBS-T arabelleği geçiyoruz. |
| IP arabellek | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, % 20 gliserol, % 0,2 NP-40 ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl | Proteaz inhibitörü kokteyl kullanımdan hemen önce ekleyin. |
Tablo 1: Çözüm hazırlık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kurulan-1 karmaşık Hücresel oksijen homeostazı bir ana Regülatörü ve genlerin farklı hücresel adaptif yanıt-e doğru hipoksi katılan bir bolluk düzenler. Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinler hipoksik sinyal iletimi anlamak için önemlidir. Co-immunoprecipitation deneyleri genellikle PPIs çalışmaları için hücresel sinyal iletim yollarının betimlemek için kullanılır. Ancak, protein overexpression hala yaygın olarak kullanılır ve bu deneysel eserler yol açabilir. Buna ek olarak, kurulan-1α oldukça kararsız bir proteindir ve yeniden oksijenasyonu11sırasında hızla bozulmuş olur. Buna ek olarak, hipoksi en memeli hücre hatlarında kurulan-1 bileşenlerinin nükleer translocation tetikler. Bu nedenle, geleneksel co-immunoprecipitation protokolleri fizyolojik ilgili kurulan-1 etkileşen proteinler hipoksi tedavi aşağıdaki tanımlaması için optimize edilmiş olması gerekir. Burada, hipoksi, kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi göstermek için kullanılan bir değiştirilmiş co-immunoprecipitation protokolü açıklar.
Kurulan-1α yıkımı sırasında yeniden oksijenasyonu önlemek için hipoksik hücrelerin hipoksik koşulları için önceden dengelenmiş hangi kuluçka torpidoda işleme TMMOB içinde hasat edildi. DPBS yıkama arabellek da kullanımdan önce hipoksik koşullarına equilibrated. İşlenmeye hazır yok hipoksi iş istasyonu ise hipoksik hücrelerin ile önceden dengelenmiş hipoksik DPBS yıkanmış ve bundan sonra hızlı bir şekilde hasat buzda. Hipoksi kurulan-1 bileşenleri nükleer translocation tetikleyebilir ve o protein overexpression artefactual sonuçlar neden olabilir göz önüne alındığında, endojen nükleer proteinler bu protokol için kullanılmıştır. Nükleer özler co-immunoprecipitation iletişim kuralı kullanımı da olmuştur başkaları tarafından20bildirdi. Bütün hücreli proteinler tarafından seyreltilmiş üzerinden nükleer proteinler olasılığını en aza indirir çünkü nükleer proteinler arasındaki etkileşimler incelenmesi için teknik bir avantaj temsil eder. Ayrıca, nükleer özleri kullanımı maruz kalma en aza indirerek non-spesifik etkileşimlerin son derece bol alakasız sitoplazmik protein, başta azaltılması için ve nükleer protein istikrar iyileştirilmesi için yardımcı olabilir proteaz sitoplazma içinde mevcut. Biz sadece kurulan-1α ve endojen nükleer özleri kullanarak ama bütün kullanmayan GABPα arasındaki etkileşimi algılayabilir gibi endojen nükleer özleri bütün hücre özleri yerine kullanım co-immunoprecipitation için önemli bir teknik gelişme gösterir hücre17ayıklar.
Açıklanan protokolünde çeşitli koşulları daha da sonuçlarını iyileştirmek için optimize edilebilir. Biz 4 h için % 1 oksijen ile tedavi bunları HEK293A hücrelerindeki hipoksi indüklenen. Ancak oksijen düzeyleri ve hipoksi tedavi süresi farklı hücre türleri için çeşitli ve çalışma amaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, kurulan-1α ve kurulan 2α differentially hipoksi tarafından bir hücre türü belirli bir şekilde, farklı rolleri farklı biyolojik bağlamlarda gösteren düzenlenmiş. Oysa kurulan-2α da hafif hipoksi (%5 O2) altında etkindir ve daha aktif aşağıdaki Kronik hipoksi tedavi (48-72 saat olur Nöroblastom hücrelerde, kurulan-1α yoğun hipoksi (%1 O2), kısa dönemlerde en etkin olduğunu gösterilmiştir hipoksik pozlama)21. 0-%5 O2 düzeyleri yaygın olarak kullanılan vitro hipoksi tedavisi % 1-5 nerede O2, 0.1-%1 O2 ve 0 – %0,1 O2 sık hafif tanımlanan hipoksi, hipoksi ve kanda oksijen azlığı, sırasıyla22. Tuz konsantrasyonu optimizasyonu, özellikle PPIs23' te iyonik etkileşimler için kritik bir rol oynamaktadır bu yana gerektiren başka bir parametredir. Nükleer özleri genellikle yüksek tuz konsantrasyonları içeren bir arabellek kullanarak çıkarılan nükleer proteinler ile bu çalışmada kullanılmıştır. Bu nedenle, nükleer özleri önce co-immunoprecipitation deneyleri desalted gerekebilir. Burada, nükleer özleri içeren 100 mM KCl diyaliz arabellek kullanarak ve diyaliz özleri 180 mM 150 mM, yakın bir final tuz konsantrasyonu için fizyolojik benzer olduğu orantılı olarak elde etmek için NaCl içeren IP arabellek karışık desalted hücre içi PPIs koşulları. Son tuz konsantrasyonu faiz PPIs özellikleri bağlı olarak değiştirilebilir. Bu protokol için GAPDH bütün hücre özleri ve sitoplazmik kesirler için yükleme denetimi olarak kullanıldı. Biz herhangi bir hipoksi indüklenen düzenleyici üzerinde önemli etkisi GAPDH ifade HEK293A hücrelerdeki gözlemlemek değil. Ancak, GAPDH daha önce upregulated olmak hipoksi belirli hücre türleri24tarafından gösterilmiştir. Bu düşünceyle, bir alternatif uygun yükleme denetimleri gerekli olduğunda kullanmanız gerekebilir25. Ayrı ayrı, biz arka plan boncuk veya geçerli protokolünde kullanılan antikor kaynaklanan sinyal önemli bir düzeyde gözlenen. Arka plan azaltmak için bir çamaşır adımları (10-15 dk) uzatmak veya 3'ten fazla yıkama (5-10 kez) gerçekleştirin. Alternatif olarak, yıkama arabellek iyonik gücü de tuz konsantrasyonu 150 den 500 mm yıkama sırasında titrating tarafından artırılabilir. Lysates aynı zamanda protein A/G sepharose boncuk için döndürme 4 ° C'de 1 h ile kuluçka tarafından önceden temizlenebilir.
Bu iletişim kuralı için nükleer özleri sınırlıdır ve bu nedenle PPIs çalışma mitokondri ve endoplazmik retikulum gibi diğer hücresel kompartmanlarda içinde için uygun olmayabilir. Benzer diğer geleneksel co-immunoprecipitation iletişim kuralları için bu yöntem PPIs gerçek zamanlı olarak çalışmaya veya PPIs doğrudan veya dolaylı olup olmadığını belirlemek için kullanılamaz.
Özetle, biz roman fizyolojik ilgili kurulan-1 etkileşen proteinlerin tanımlanması için değiştirilmiş co-immunoprecipitation iletişim kuralı sağlar. Bu iletişim kuralı da transkripsiyon faktörleri ve hipoksik koşullarda transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler incelenmesi için uygundur. Bu iletişim kuralı hipoksi koşullar altında co-immunoprecipitation deneyleri için özel olarak tasarlanmış olsa da, normoxia kontrol hücreleri için açıklanan protokolünün bir parçası da normoxia koşullar altında nükleer PPIs eğitim için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Dr. günah Tiong Ong hipoksi iş istasyonu kullanım için teşekkür ederiz. Bu eser aşağıdaki tarafından desteklenmiştir: Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, MOE 1T1-02/04 ve MOE2015-T2-2-087 (için içeride), Lee Kong Chian Okulu tıp, Nanyang Teknoloji Üniversitesi açılış hibe M4230003 (P.O.B.), İsveçli Araştırma Konseyi Aile Erling Persson Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Stichting af Jochnick Vakfı, İsveç Diyabet Derneği, Scandia sigorta şirketi, diyabet araştırma ve Sağlık Vakfı, yatak von Kantzow'ın Vakfı, Diyabet, Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı Stratejik araştırma programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
