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Generazione di un modello di cancro al seno metastatico murino ortotopico ed eseguendo murino mastectomia radicale

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Vi presentiamo un modello murino ortotopico di cancro del seno e mastectomia radicale modello con tecnologia di bioluminescenza per quantificare il carico del tumore per simulare la progressione del cancro al seno umano.

Abstract

Modelli di topo in vivo per valutare la progressione del cancro al seno sono essenziali per la ricerca sul cancro, compresi gli sviluppi preclinici droga. Tuttavia, la maggior parte dei dettagli pratici e tecnici comunemente è omessi nei manoscritti pubblicati che, pertanto, rende difficili da riprodurre i modelli, in particolare quando si tratta di tecniche chirurgiche. Bioluminescenza tecnologia consente la valutazione delle piccole quantità di cellule tumorali anche quando un tumore non è palpabile. Utilizzando le cellule tumorali che esprimono luciferasi, stabiliamo una tecnica di inoculazione ortotopico cancro al seno con un tasso alto tumorigenesi. Metastasi del polmone è stato concluso utilizzando una tecnica di ex vivo . Abbiamo, quindi, stabilire un modello di mastectomia con un tasso basso di ricorrenza locale per valutare l'onere di tumore metastatico. Qui, descriviamo, in dettaglio, le tecniche chirurgiche di impianto ortotopico e mastectomia per cancro al seno con un tasso di tumorigenesi alta e bassa percentuale di recidiva locale, rispettivamente, per migliorare l'efficienza del modello di cancro al seno.

Introduction

Modelli animali svolgono un ruolo chiave nella ricerca sul cancro. Quando un'ipotesi è dimostrata in vitro, devono essere testato in vivo per valutare la sua rilevanza clinica. Metastasi e progressione del cancro sono spesso meglio catturati dai modelli animali rispetto ai modelli in vitro, ed è essenziale per testare un nuovo farmaco in un modello animale come uno studio preclinico per droga sviluppo1,2. Tuttavia, i dettagli tecnici degli esperimenti sugli animali spesso non sono ben descritti in articoli pubblicati, che lo rende difficile da riprodurre con successo il modello. Infatti, gli autori che hanno stabilito questi modelli ortotopici di inoculazione e mastectomia è attraversato da lunghi e rigorosi processi di prova ed errore. Il tasso di successo del tumorigenesis dopo l'inoculazione delle cellule di cancro è uno dei fattori chiavi per determinare il successo e l'efficienza di un animale di Studio3. La linea cellulare e il numero di celle per inoculare, il sito di inoculazione e il ceppo dei topi sono tutti fattori importanti. È noto che ci sono enormi variazioni nei risultati degli esperimenti sugli animali a causa di differenze individuali, rispetto alle tecniche in vitro. Pertanto, utilizzando un modello ben consolidato con una tecnica standard è importante per ottenere risultati stabili, per migliorare l'efficienza degli esperimenti sugli animali e per evitare risultati falsi.

Questo documento fornisce tecniche ben consolidate4 per generare modelli del cancro al seno orthotopic e mastectomia del mouse. Questi metodi mirano 1) per simulare la progressione del cancro al seno umano e corsi del trattamento e 2) di condurre esperimenti in vivo con una maggiore efficienza e più alti tassi di successo rispetto ad altri inoculazione di cancro al seno o tecniche di mastectomia. A inoculazione di orthotopic del cancro delle cellule, per simulare la progressione del cancro al seno umano, scegliamo il cuscinetto grasso mammario #2 come un sito di inoculazione, che si trova nel petto. Nella maggior parte degli studi, le cellule di cancro al seno sono inoculate sottocute5. Questa tecnica non richiede intervento chirurgico e, quindi, è semplice e diretto. Tuttavia, il microambiente sottocutaneo è abbastanza differente dal microambiente della ghiandola mammaria, che si traduce nella progressione del cancro diversi e profili molecolari anche6,7. Alcuni studi riportano la ghiandola mammaria #4, che si trova nell'addome, come un sito di inoculazione6. Tuttavia, poiché #4 ghiandole mammarie sono situati nell'addome, il modello metastatico più comune è la carcinosi peritoneale7, che si verifica con meno del 10% di carcinoma mammario metastatico cancro8. Cancro al seno generato dalla tecnica ha presentata qui, nella ghiandola mammaria #2, si riproduce per metastasi al polmone, che è una delle più comuni al seno cancro metastatico siti9.

Con questa tecnica, l'obiettivo è anche di raggiungere un più alto tasso di tumorigenesi con variabilità di dimensione minima del tumore rispetto ad altre tecniche di inoculazione del cancro al seno. A tale scopo, le cellule tumorali sospese in una miscela di proteine gelatinoso vengono inoculate sotto visione diretta attraverso un'incisione di parete di cassa anteriore mediana. Questa tecnica produce un tasso di tumorigenesi alta con minore variabilità rispetto all'iniezione sottocutanea o non-chirurgico, come precedentemente segnalato3,7e delle dimensioni del tumore.

Introduciamo anche una tecnica di mastectomia radicale del mouse in cui il tumore al seno ortotopico è resecato con i tessuti circostanti e i linfonodi ascellari. In ambito clinico, lo standard di cura per malati di cancro al seno senza malattia di metastasi a distanza è mastectomia10,11. Prima di una mastectomia, metastasi di linfonodo ascellare è esaminata dalla biopsia di linfonodo di imaging e sentinella. Se non c'è nessuna evidenza di metastasi di linfonodo ascellare, il paziente viene quindi trattato con una mastectomia totale o parziale, in cui la resezione di linfonodo ascellare è omesso. Mastectomia totale è una tecnica per resecare il cancro al seno con il tessuto del seno tutto in blocco, considerando che la mastectomia parziale deve resecare il tumore al seno con un margine del circostante tessuto mammario normale solo, così conservando il tessuto restante del seno normale nella paziente. Tuttavia, i pazienti che conservano la restante tessuto normale del seno dopo una mastectomia parziale richiedono radioterapia postoperatoria per evitare la ricorrenza locale10. I pazienti che hanno metastasi di linfonodo ascellare si impegnano mastectomia radicale che rimuove il cancro al seno con normale tutti i linfonodi ascellare e del tessuto del seno e invasero tessuti en bloc10,11. Nel modello del topo, sorveglianza per radiazioni di metastasi e/o post-operatorio di linfonodo ascellare non è ragionevole o fattibile. Quindi, utilizziamo la tecnica di mastectomia radicale per evitare la metastasi di linfonodo ascellare o locale.

Inoculazione delle cellule del cancro attraverso la vena della coda è la più comune del polmone metastasi del mouse modello12, il cosiddetto "metastasi sperimentale". Questo modello è facile da generare e non richiedono un intervento chirurgico; Tuttavia, esso non imitare la progressione del cancro al seno umano che può causare un comportamento diverso malattia metastatica. Al fine di simulare il ciclo di trattamento di cancro al seno umano cui metastasi si verifica spesso dopo mastectomia, il tumore primario è rimosso dopo inoculazione di orthotopic del cancro delle cellule. Questa tecnica produce meno ricorrenza locale rispetto alla resezione del tumore semplici, come precedentemente segnalato13ed è utile per nuove terapie, studi preclinici e per gli studi di ricerca del cancro della mammella metastatico. Le tecniche qui descritte sono applicabili per la maggior parte degli esperimenti di modello ortotopico di cancro al seno. Tuttavia, è importante considerare che la miscela di proteine gelatinoso può influenzare il microambiente e chirurgia può influenzare la risposta di stress/immunitario14. Pertanto, gli investigatori studiando il microambiente e/o la risposta di stress/immunitario dovrebbero essere informati di potenziali fattori di confondimento.

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Protocol

Approvazione da parte del Comitato di uso e Roswell Park Cancer completa centro animale istituzionale Care è stata ottenuta per tutti gli esperimenti.

Nota: Nove a dodici settimane-vecchi topi BALB/c femminili sono ottenuti. 4T1-luc2 cellule, una linea di cellule di adenocarcinoma mammario di topo derivata da topi BALB/c è stata studiata per esprimere luciferasi, vengono utilizzate. Queste cellule sono coltivate in mezzo 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% siero bovino fetale (FBS).

1. preparazione degli strumenti

  1. Scongelare una miscela di proteina gelatinoso congelati (ad es., Matrigel) sul ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto.
  2. Pulire e autoclave due insiemi di strumenti chirurgici (microdissection forbici, pinzette Adson e un porta-aghi) prima dell'intervento. Preparare sterilizzato 5-0 suturare di seta e asciugare sterilizzante (quando sono previsti interventi chirurgici seriale).
  3. Clip capelli petto middle dei topi utilizzando un clipper e contrassegnare i topi per identificazione perforando l'orecchio prima del momento dell'intervento.
  4. Preparare il tavolo di procedura, che può essere immediatamente utilizzato per l'operazione.
    1. Diffondere un tampone assorbente e fissare gli angoli con del nastro, Difficoltà ogive di anestesia con nastro, mettere sterilizzante e disinfettante (clorexidina, iodio e 75% etanolo) accanto allo spazio di manovra e posizionare i topi nell'ordine di funzionamento.

2. preparazione delle cellule (per 10 topi)

Nota: Le cellule devono essere inoculate entro 1 h dopo essere distaccata dal piatto per evitare di attuabilità delle cellule in diminuzione. In particolare, la sospensione cellulare dovrebbe essere miscelata in miscela proteica gelatinosa entro 15 min dopo aver scollegato le cellule dal piatto per mantenere la loro vitalità.

  1. Cultura 4T1-luc2 cellule, una linea cellulare di adenocarcinoma mammario topo esprimendo la luciferasi, in RPMI 1640 media con 10% FBS in un incubatore a 37 ° C in 5% CO2.
  2. Lavare le cellule aderenti 4T1-luc2 in un piatto di 10 cm con tampone fosfato salino (PBS) usando una pipetta sierologica di 10 mL. Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% utilizzando una pipetta P1000 e, quindi, incubare il campione a 37 ° C per 5 min. Quindi, aggiungere 4 mL di coltura (RPMI-1640 con 10% FBS) utilizzando un 5ml sierologici pipetta e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica 15 mL in una cappa di coltura del tessuto. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 5 min.
  3. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 2 mL di PBS; quindi, contare le celle utilizzando l'emocitometro.
  4. Sospendere 2 x 106 cellule 4T1-luc2 in 40 μL di PBS freddo (pH 7.4, 4 ° C) nella coltura del tessuto cappa.
  5. Mescolare la sospensione cellulare 40-μL con 360 µ l della miscela proteica gelatinoso in una microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio nella cappa di coltura del tessuto.
    Nota: La concentrazione finale è 1 x 10520 μL (1:9 PBS: miscela gelatinosa della proteina). Per il modello ortotopico (senza mastectomia), 1 x 10420 μL della concentrazione finale è stato usato, per evitare di raggiungere criteri di eutanasia (tumore dimensioni > 2 cm) entro due settimane.

3. cancro inoculazione delle cellule

  1. Messo i topi in camera di induzione di anestesia con 2-4% di isoflurano e 0,2 L/min di flusso di ossigeno fino a quando i topi respirano con calma (2 – 3 min).
  2. Afferrare il mouse e iniettare per via sottocutanea 0,05 mg/kg buprenorfina nella sua spalla.
  3. Confermare un'anestesia adeguata dalla mancanza di reazione a un pizzico di punta. Inserire il naso del mouse nel foro della maschera del mouse, che permette di anestesia inalatoria con 2-4% isoflurane e 2 L/min flusso di ossigeno collegato ad un'unità di carbone canister.
  4. Trattenere gli arti del mouse utilizzando nastro lab e sterilizzare la sua pelle utilizzando clorexidina, iodio e 75% di etanolo, utilizzando tamponi di cotone.
  5. Fare un'incisione cutanea di 5 mm al centro della parete di cassa anteriore utilizzando forbici sterili microdissection, ascensore sul lato destro pelle accanto l'incisione e staccare la pelle dalla parete della cassa, usando le forbici e poi, invertire la pelle per esporre il diritto #2 cuscinetto di grasso mammario.
  6. Attentamente e iniettare 20 μL della sospensione di cellule di cancro usando una siringa da insulina 1 mL con un ago di 28,5 G nel cuscinetto grasso sotto visione diretta attraverso la ferita.
    Nota: L'ago passa attraverso la ferita, non la pelle. Tenere premuto l'ago nel cuscinetto grasso per 5 prima di s a tirarlo fuori, che permette un tempo per la miscela di proteine gelatinoso a solidificare.
  7. Chiudere le incisioni cutanee da cuciture, con punti di sutura non riassorbibile sterile 5-0.
  8. Dopo la chirurgia, restituire gli animali in una gabbia pulita e monitorarli fino a quando essi hanno recuperato e stanno muovendo liberamente (dopo ~ 1 – 2 min). Se un animale non sembra essere in buona salute entro 24 h dalla chirurgia, amministrare buprenorfina (0,2 mg/kg).
  9. Rimuovere le suture in anestesia (Vedi punto 3.1) 7D dopo l'intervento chirurgico.

4. mastectomia

Nota: La tempistica della mastectomia è molto importante. Se è fatto troppo presto, non si verifica la metastasi del polmone. Se è fatto troppo tardi, il tumore primario ha invaso i principali vasi sanguigni, che rendono difficile una completa resezione oncologica. Così, più punti di tempo sono stati testati per mastectomia determinare quale punto di tempo prodotto il giusto equilibrio in attesa per la metastasi prima resezione è diventato troppo impegnativa. Dopo oltre 50 esperimenti del mouse in questo modo, è stato dimostrato che la mastectomia a 8 giorni dopo l'inoculazione delle cellule di cancro (o quando le dimensioni del tumore raggiungono 5 mm) era l'ideale tempo punto per ottenere che l'equilibrio13.

  1. Anestetizzare un mouse con 2-4% inalato isoflurano e iniettare buprenorfina (Vedi punti 3.1 e 3.2).
  2. Trattenere il mouse e sterilizzare la sua pelle (Vedi punto 3.4).
  3. Fare un'incisione cutanea di 5 mm 2 mm a sinistra dalla cicatrice chirurgica che è stata effettuata presso l'inoculazione delle cellule di cancro iniziale, usando le forbici di microdissection. Estendere l'incisione verso la radice dell'arto anteriore per rimuovere il tumore, pelle compreso la cicatrice chirurgica e la lesione a contatto con il tumore, così come il bacino di linfonodo ascellare in cui la maggior parte del tempo non esiste alcun nodo linfatico visibile al momento del mastect omy13. Assicurarsi di non danneggiare la vena ascellare.
  4. Chiudere i difetti della pelle da cuciture, usando suture non assorbibili sterile 5-0 in forma di una "Y".
  5. Lo stesso come descritto al punto 3.8, restituire il mouse ad una gabbia pulita e monitor fino a quando non hanno recuperato.
  6. Rimuovere le suture in anestesia (Vedi punto 3.1) 7 giorni dopo la chirurgia.

5. bioluminescenti quantificazione del tumore primario (inoculazione di Orthotopic senza mastectomia) o metastasi del polmone (modello di mastectomia)

Nota: Per la quantificazione degli oneri di tumore primario, la bioluminescenza è misurata 2 volte alla settimana dal giorno dopo l'inoculazione di orthotopic. Per la quantificazione di metastasi del polmone, la bioluminescenza è misurata 2 volte alla settimana dal giorno dopo la mastectomia.

  1. D-luciferina, sciogliere in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) ad una concentrazione finale di 15 mg/mL in una cappa di coltura del tessuto. Aliquotare in luce-schermato 1,5 mL microcentrifuga tubi. Conservare la soluzione diluita a-80 ° C.
    Nota: Per un mouse 20g, 200 µ l di diluito D-luciferina è richiesto.
  2. Aprire il software di imaging e fare clic su inizializzare.
    Nota: Si impiegano circa 15 minuti per raffreddare il charge coupled device (CCD). Quando il CCD raggiunge la temperatura impostata, il colore della barra di temperatura cambia da rosso a verde.
  3. Anestetizzare i topi con 2-4% isoflurane in una camera di induzione dedicato prima di formazione immagine (Vedi punto 3.1).
  4. Pesare i topi.
  5. Iniettare D-luciferina 150 mg/kg per via intraperitoneale nel punto di metà di-addome, utilizzando un ago di 28,5 G.
  6. Montare ogni mouse con un cono di naso all'interno del sistema di imaging in posizione supina (posto un massimo di cinque topi allo stesso tempo). Mantenere l'anestesia presso isoflurane 1% - 3% (in 100% di ossigeno) attraverso i coni di naso durante l'imaging.
  7. Acquisire un'immagine ogni 5 minuti per rilevare la bioluminescenza picco per 50 minuti (o fino alla bioluminescenza confermato picco).
    1. Selezionare luminescenza come Auto, Binning come Mediume campo visivo come D.
    2. Fare clic su Acquisisci per acquisire l'immagine.
  8. Restituire i topi a loro strisciamenti e monitorarli finché non hanno recuperato (Vedi punto 3.8).

6. polmonare metastasi del tumore onere quantificazione di Ex Vivo Imaging

Nota: Quantificazione di metastasi del polmone è applicabile per l'inoculazione di orthotopic con e senza modelli di mastectomia. Nel modello di mastectomia, ex vivo imaging o sopravvivenza osservazione viene scelto, a seconda dello scopo. Nel modello ortotopico inoculazione (senza mastectomia), la maggior parte dei casi produrre criteri di tumore primario dimensione eutanasia (> 2 cm) circa 21 giorni dopo l'inoculazione.

  1. Quantificare le lesioni metastatiche del polmone 21 giorni dopo l'inoculazione delle cellule di cancro di ex vivo imaging.
  2. Anestetizzare i topi con 2-4% isoflurane in una camera di induzione dedicato (Vedi punto 3.1).
  3. Pesare i topi.
  4. Iniettare 150mg/kg D-luciferina intraperitonealmente (Vedi punto 5.6).
  5. Eutanasia i topi di dislocazione cervicale, 15 min dopo le iniezioni.
  6. Aprire l'addome tagliando la pelle e il peritoneo presso il metà di-addome, utilizzando forbici Mayo curve. Estendere l'incisione sia destra che sinistra. Estrarre il fegato con una pinza fino a quando il diaframma è visualizzato; quindi, tagliare il diaframma.
  7. Utilizzando le forbici di Mayo curve, tagliare le costole bilaterale da caudale (12 costole) a cephalad (1 ° costole) per esporre i polmoni lanciando la parete del torace anteriore.
  8. Identificare l'esofago toracico, che si presenta come un cordone che collega i polmoni alla colonna vertebrale, sollevando i polmoni utilizzando forcipe e, quindi, tagliare l'esofago usando le forbici di microdissection.
  9. Sollevare il polmoni bilaterali e cuore usando il forcipe (applicando trazione tirando verso il basso, in direzione di cephalad a caudale) e, quindi, tagliare la trachea e i grossi vasi all'apice del polmone presso il cephalad, usando le forbici microdissection.
    Nota: Ciò consente l'isolamento del polmone e del cuore dal corpo.
  10. Togliere il cuore dai polmoni utilizzando le forbici microdissection.
  11. Mettere i polmoni in una capsula di Petri di 10 cm.
  12. Acquisire l'immagine di bioluminescenza (vedere i passaggi 5.7.1 e 5.7.2) 5 min dopo l'eutanasia (20 min dopo l'iniezione di luciferina).

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Representative Results

Lo scopo del modello ortotopico è quello di imitare la progressione del cancro umano (cioè, la crescita del tumore primario seguita da metastasi linfonodali e metastasi del polmone quindi distanti)15. Dopo l'inoculazione delle cellule di cancro, la bioluminescenza è quantificata regolarmente (due o tre volte / settimana) (Figura 1A). La bioluminescenza nei polmoni è più profondo e più piccolo della lesione primaria. La bioluminescenza riflette principalmente l'onere di tumore primario in topi dal vivo3 (Figura 1B e 1C). Le dimensioni del tumore inoltre è stata misurata tramite la misura della pinza. Il volume del tumore è stato stimato utilizzando la seguente equazione: volume = (lunghezza) x (larghezza)22 (Figura 1). Quantificazione degli oneri del tumore tramite bioluminescenza e la pinza misura ha mostrato un andamento simile nei risultati rappresentativi (Figura 1B e 1D); Tuttavia, abbiamo incontrato a volte discrepanze. Diamo per scontato che quantificare l'onere di tumore primario che utilizza la bioluminescenza è più accurata rispetto a misurare le dimensioni del tumore da pinza quando le dimensioni del tumore sono inferiore a 1,5 cm. Perché riflette vitali le cellule tumorali, anche un piccolo numero di cellule può essere rilevato da bioluminescenza, e solo le cellule tumorali possono essere rilevati all'interno del tumore, non compreso le cellule immuni di infiltrazione o che circondano le cellule stromal3. Questo modello è utile nel valutare l'efficacia di regressione del tumore mediata da farmaco anti-cancro e risposte immunitarie3,7,16. La massa tumorale delle metastasi del polmone può essere quantificata anche da ex vivo imaging in questo modello (Figura 1E); Tuttavia, il limite è che i topi devono essere euthanized per quantificare il carico del tumore metastatico.

Lo scopo del modello mastectomia è 1) riprodurre lo standard di trattamento di cura del cancro al seno umano, che è la rimozione chirurgica del tumore primario17, e 2) consentire la quantificazione seriale dell'onere del tumore metastatico in vivo. Questo modello è particolarmente utile nello studio preclinico dello sviluppo di approcci terapeutici13. Come precedentemente pubblicati, un inibitore di Src, AZD0530, che ha mostrato l'efficacia del modello preclinico topi ma non è riuscito in un test clinico per il trattamento di cancro al seno, ha mostrato efficacia nella lesione primaria che utilizzano inoculazione di orthotopic senza mastectomia ma non metastasi del polmone che utilizzano il modello di mastectomia presentato qui. Anche se i farmaci anti-cancro (ad es. antracicline) vengono talvolta utilizzati in esseri umani come terapia neoadiuvante per trattare i tumori primari del seno, la maggior parte delle droghe è utilizzata come terapia adiuvante dove le droghe sono date dopo l'intervento chirurgico per ridurre il rischio di ricorrenza di trattamento del cancro clinicamente non rilevabile o come trattamento palliativo per cancro metastatico1,7,18. Così, questo modello di mastectomia è stato stabilito, che imita il processo di trattamento umano11.

Otto giorni dopo l'inoculazione delle cellule di cancro, il tumore primario è chirurgicamente rimosso (Figura 2). Per provare uno qualsiasi dei efficacies di droga per le lesioni metastatiche, dovrebbe essere amministrato dopo la mastectomia. Questo modello consente per quantificazione di lesione metastatica polmonare, come pure la quantificazione di lesione metastatica del corpo intero, purché l'onere di tumore metastatico ha una bioluminescenza rilevabile utilizzando imaging in vivo. Il tasso di recidiva locale di parete di cassa anteriore è piuttosto basso. Nella nostra esperienza, il tasso di recidiva locale era inferiore al 5% negli esperimenti oltre 50 topi. Tuttavia, se la bioluminescenza giorno postoperatorio 1 supera 1.00 e + 06 fotoni (10 volte più grande di altri individui), c'è un'alta possibilità di un tumore residuo locale13. Se ci sono cellule tumorali residuo presente, viene visualizzata la finestra di un tumore palpabile entro due settimane. Quando c'è un locale del tumore residuo, la bioluminescenza riflette principalmente quella ricorrenza locale piuttosto che eventuali lesioni metastatiche. Tumori residui locali sono noti a comportarsi in modo molto diverso da metastasi distanti19; così, quegli animali con la ricorrenza locale (< 5% nella nostra esperienza) dovrebbero essere esclusi da qualsiasi ulteriore analisi. Questo modello di mastectomia permette anche per il tumore metastatico seriale onere monitoraggio senza dover eutanasia degli animali. Inoltre, tale monitoraggio bioluminescenti può essere confermata da ex vivo quantificazione di metastasi del polmone. Invece di quantificare le metastasi del polmone da ex vivo imaging, avendo così a eutanasia degli animali, sopravvivenza di topi dopo il trattamento chirurgico può anche essere controllata come endpoint clinici traducibile (Figura 2D). Poiché non vi è nessuna lesione primaria, topi non possono soddisfare criteri di tumore l'eutanasia, che sono generalmente definiti come un formato di tumore di > 2 cm o ulcerazione del tumore primario. In questo modello di mastectomia 4T1, tutti i topi morivano entro 60 giorni dopo l'inoculazione delle cellule di cancro dovuto la metastasi.

Figure 1
Figura 1: Panoramica del modello ortotopico senza mastectomia. (A), questo pannello mostra un corso a tempo del trapianto orthotopic del modello utilizzando il modello syngeneic 4T1. (B), questo pannello mostra la bioluminescenza di corpo intero di un modello ortotopico che riflette principalmente il tumore primario. La barra di errore indica l'errore standard della media (n = 10). (C), questo pannello mostra seriale immagini del corpo intero bioluminescenza (dello stesso mouse). La barra della scala indica 1 cm. (D) questo pannello mostra la dimensione reale del tumore del pannello B, misurata da pinze. La barra di errore indica l'errore standard della media (n = 10). (E), questo pannello mostra polmone ex vivo bioluminescenza immagini di 10 topi di modello ortotopico (n = 10). La barra della scala indica 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Panoramica del modello di mastectomia. (A), questo pannello mostra un corso di tempo della mastectomia modello dopo 4T1 orthotopic syngeneic impianto. La barra della scala indica 1 cm. (B), questo pannello mostra la bioluminescenza corpo intero del modello mastectomia, che riflette principalmente lesione metastatica. La barra di errore indica l'errore standard della media (n = 10). (C), questo pannello mostra seriale immagini del corpo intero bioluminescenza (dello stesso mouse). Utilizzando ex vivo imaging, è stato confermato che i segnali erano da metastasi del polmone, e nessuna ricorrenza locale è stata confermata da formazione immagine whole-body dopo rimozione del polmone. Barra della scala = 1 cm. (D) questa curva di sopravvivenza di spettacoli il Kaplan-Meier pannello del modello mastectomia senza qualsiasi trattamento farmacologico. Topi sono stati eutanasizzati quando hanno raggiunto i criteri di eutanasia con qualsiasi condizione morbosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per l'ultimo decennio, abbiamo stabilito più modelli murini cancro, compresi seno cancro modelli3,7,13,16,20,21. Precedentemente, abbiamo dimostrato che inoculazione di orthotopic seno cancro delle cellule nel tessuto della ghiandola mammaria sotto visione diretta prodotto un tumore più grande con minore variabilità di dimensioni rispetto ad iniezione delle cellule intorno al capezzolo senza un'incisione chirurgica7 . Questo modello è stato migliorato al momento utilizzando una sospensione cellulare in una miscela di proteine gelatinoso. Le forme del tumore generato dalle cellule gelatinoso proteine miscela-sospeso erano in tonda con minore variabilità, mentre quelle generate dalle cellule di PBS-sospeso erano sparsi nella ghiandola mammaria3.

Abbiamo ulteriormente verificato che i tumori generati dal metodo di impianto chirurgico orthotopic presentato qui altamente espressi i geni cui reti di interazione sono importanti nella progressione del cancro rispetto a quelli generati da non-chirurgico o sottocutaneo iniezione7. Questi risultati implicano che questo modello imita il cancro al seno umano migliore rispetto al non-chirurgico orthotopic o l'impianto sottocutaneo7. Inoltre abbiamo dimostrato che questo modello è adatto per valutare la regressione immuno-mediata di cancro al seno con rigetto allogenico3. Tuttavia, incisione cutanea può anche causare l'infiammazione intorno ai14di tumore. Pertanto, a seconda l'ipotesi testato dallo sperimentatore, è importante considerare l'infiammazione come un possibile fattore di confondimento.

Diverso da neoadiuvante impostazione, la stragrande maggioranza delle terapie sistemiche è somministrata dopo il tumore primario del seno è chirurgicamente rimosso11. Ad oggi, la maggior parte degli studi preclinici per lo sviluppo di nuovi farmaci valuta la risposta ai farmaci nel tumore primario, ma non a lesioni metastatiche1,18. Questa discrepanza tra modelli animali e trattamento umano è importante perché il profilo di genica delle lesioni metastatiche è significativamente diverso da quelli della lesione primaria22, che ha implicazioni importanti per la biologia del cancro e trattamento , soprattutto nell'era della terapia mirata22. Pertanto, l'efficacia del farmaco per la terapia adiuvante deve essere valutata in lesioni metastatiche, non solo nel tumore primario. Abbiamo verificato i tempi della formazione di metastasi di linfonodo e del polmone dopo l'inoculazione di orthotopic, utilizzando il 4T1 seno cancro orthotopic modello16. Inoltre abbiamo dimostrato che una resezione del tumore primario ha migliorato la sopravvivenza nel cancro della mammella metastatico che utilizzano il modello di mastectomia23. Così, abbiamo cercato di stabilire un modello di mastectomia dopo l'impianto delle cellule di cancro ortotopico. Tuttavia, molto tempo è stato speso per stabilire questo modello basso di ricorrenza locale. Perché le cellule tumorali sono iniettate attraverso incisione chirurgica, le cellule tumorali migrano facilmente nella ferita. Inoltre, le cellule tumorali invadono i tessuti a contatto diretto con il tumore, come il muscolo circostante di parete toracica e la pelle. Le cellule tumorali, anche metastasi ai linfonodi ascellari senza formare una massa ascellare visibile al momento della mastectomia. Mentre la rimozione del tumore può essere una tecnica più semplice, facendo così non è traducibile alla mastectomia nel trattamento del cancro al seno come causa della ricorrenza locale13. Così, questo modello"mastectomia radicale" è stato istituito al fine di rimuovere tutte le cellule tumorali dalla parete di cassa anteriore e bacino di linfonodo ascellare, come descritto nella Figura 2. Abbiamo confermato la metastasi del polmone dall'istologia e polmone ex vivo imaging, e non c'era nessuna lesione brillante presente da formazione immagine whole-body dopo rimozione del polmone. In questo modello di orthotopic 4T1, le cellule tumorali alla fine metastasi ai polmoni, in tutti i casi entro 21 giorni. Tuttavia, i tempi della metastasi dipendono dalle dimensioni del tumore primario; quindi, meno la dimensione del tumore primario variabilità è importante per il monitoraggio non solo il tumore primario, ma anche la difficoltà del tumore metastatico. Utilizzando la miscela proteica gelatinoso, variabilità di dimensioni del tumore può essere minimizzato. Tuttavia, la miscela di proteine gelatinoso può colpire anche il microambiente tumorale. Pertanto, il potenziale confondenti associati all'uso di miscela gelatinosa proteina dovrebbe essere considerato, secondo l'ipotesi dello sperimentatore.

Utilizzando queste tecniche e le cellule tumorali che esprimono luciferasi consentono per la quantificazione degli oneri del tumore con meno errori di misura, anche nei tumori non palpabile. Ci sono due sistemi reporter, bioluminescenti e fluorescenti, per visualizzare i segnali in animali vivi. Mentre è stato segnalato che il segnale di fluorescenza e bioluminescenza può essere abbastanza luminoso per la quantificazione, quando il segnale di destinazione è molto basso, il segnale di fondo di fluorescenza è superiore, che riduce la precisione del dosaggio. In opposizione, la bioluminescenza è rilevato con maggiore precisione a un segnale inferiore con meno interferenze di sfondo24. Di conseguenza, la maggior parte ricercatori preferiscono usare sistemi reporter bioluminescenza in diretta24,25esperimenti sugli animali. Tuttavia, quantificazione degli oneri del tumore di bioluminescenza ha i suoi limiti. Cellule che esprimono luciferasi brillano quando luciferina raggiunge le cellule tumorali da perfusione cardiovascolare26. Se la lesione ha una superficie di ipossia e/o ipoperfusione, luciferina non è trasportato alle cellule e il valore di bioluminescenza potrebbe, quindi, essere misurato per essere inferiore il carico effettivo del tumore. Infatti, abbiamo sperimentato quantificazione di bioluminescenza inappropriati quando raggiunge la dimensione del tumore più di 1,5 cm. Diamo per scontato che sia dovuto il descritto hypoxic e/o condizione hypoperfused. Così, quando il tumore raggiunge una dimensione palpabile, la difficoltà del tumore è quantificata mediante pinza misura sia di bioluminescenza. Una limitazione importante di quantificazione di bioluminescenza da considerare è la pelliccia nera dei topi. Anche dopo la pelliccia viene rimosso, c'è la pigmentazione della pelle27. Mentre bioluminescenza possa essere rilevato e quantificato in topi con pelliccia nera, esso è diminuito e, pertanto, è importante confrontare i topi dello stesso colore pelliccia a vicenda al fine di ridurre gli effetti confondenti di pelliccia colore sulla quantificazione bioluminescenti. L'uso di cellule che esprimono luciferasi fornisce alcune modalità unica per lo studio. Ad esempio, luciferasi secretable possono essere utilizzato per la quantificazione degli oneri del tumore di misurazione sangue o urina bioluminescenza28. Nel modello presentato qui, la quantificazione degli oneri diretta del tumore delle cellule tumorali possibili animali vivi con luciferasi non secretable è semplice e semplice, che non necessita di raccolta dei campioni di sangue o nelle urine.

Simile ai modelli che ha introdotto qui, la produzione di una più efficiente esperimento sugli animali producendo un più alto tasso di successo del tumorigenesis con minore variabilità è la chiave per dimostrare i risultati. Nel presente modello, una volta un investigatore ha imparato la tecnica, è facile da raggiungere un tasso di tumorigenesi del 100%. Abbiamo ottenuto anche tassi più elevati di tumorigenesi tranne i modelli che abbiamo introdotto; Inoltre, abbiamo stabilito un modello ortotopico di cancro del colon utilizzando la sospensione cellulare in una miscela di proteine gelatinoso, insieme alla tecnologia di bioluminescenza per quantificare l' onere di tumore21. In conclusione, il modello animale qui presentato fornisce un modello murino adatto per intraprendere gli studi di cancro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da grant NIH R01CA160688 e Susan G. Komen Foundation investigatore avviata ricerca grant (IIR12222224) ai topi K.T. bioluminescenza immagini sono state acquisite da risorsa condivisa traslazionale Imaging risorsa condivisa a Roswell Park Comprehensive Cancer Center, che è stato sostenuto dal cancro centro assistenza Grant (P30CA01656) e la strumentazione ha condiviso grant (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

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Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

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