Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Att upptäcka Protein subcellulär lokalisering av grönt fluorescerande Protein taggning och 4', 6-diamidin-2-fenylindol färgning i Caenorhabditis elegans

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College/CUNY

Summary

Detta protokoll visar hur att spåra en protein translokationen i cellkärnan under värmestress med hjälp av ett grönt fluorescerande protein (GFP)-fusionsprotein som markör och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) färgning. Den DAPI färgning protokoll är snabb och bevarar god Jordbrukarsed och protein subcellulär lokalisering signalerna.

Abstract

I detta protokoll, ett grönt fluorescerande protein (GFP) fusionsprotein och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) färgning används för att spåra protein subcellulär lokalisering ändringar; i synnerhet betona en translokationen i cellkärnan under en värme skick. Proteiner reagerar på motsvarande sätt till externa och interna signaler. En gemensam mekanism är att ändra dess subcellulär lokalisering. I artikeln beskrivs ett protokoll för att spåra protein lokalisering som inte kräver en antikropp, radioaktiv märkning eller confocal Mikroskop. I den här artikeln används GFP att tagga målproteinet EXL-1 i C. elegans, en medlem av familjen klorid intracellulära kanal proteiner (klickar), inklusive däggdjur CLIC4. En integrerad translationell exl-1::gfp transgena linje (med en promotor och en full gensekvens) skapades av omvandling och γ-strålning och uttrycker stabilt genen och god jordbrukarsed. Ny forskning visade att vid värmestress, inte oxidativ stress, EXL-1::GFP ackumuleras i kärnan. Överlappande GFP signalen med både kärnor strukturen och DAPI signaler bekräftar EXL-1 subcellulär lokalisering ändringarna under stress. Detta protokoll presenterar två olika fixering metoder för DAPI färgning: etanol fixering och aceton fixering. DAPI färgning protokollet presenteras i denna artikel är snabb och effektiv och bevarar både GFP signalen och protein subcellulär lokalisering ändringarna. Denna metod kräver endast ett fluorescens Mikroskop med Nomarski, en FITC-filter och ett DAPI filter. Den är lämplig för små laboratoriemiljö, grundutbildningsprogram student forskning, high school student forskning och bioteknik klassrum.

Introduction

En förändring av protein subcellulär lokalisering är en gemensam mekanism som svar på inre eller yttre signaler som värmestress, svält, oxidativ stress, apoptos, protein fosforylering och andra. Till exempel inducerar värmestress medlem FOXO DAF-16 translokationen i cellkärnan1,2och pro-apoptotiska BCL-2 proteinet bud translocates till mitokondrierna vid mottagande död signalering3,4. Det finns olika tekniker att upptäcka dessa ändringar. En kombination av western blotting och biokemiskt isolera subcellulära strukturer (t.ex., mitokondrier eller atomkärnor) kunde väl uppnå mål3. Det kräver dock en specifik antikropp mot proteinet av intresse. Således blir en väletablerad antikropp nyckeln till framgång. En alternativ metod är att märka olika subcellulära strukturer eller organeller med olika markörer såsom grönt fluorescerande protein (GFP), röd fluorescens protein (RFP), gul fluorescens protein (YFP) och mCherry, och under tiden märka proteinet av intresse med andra markörer. Sedan Följ dem under en confocal Mikroskop för att lokalisera mål5,6. Radioaktiva isotoper är ett alternativt val för märkning målproteiner och sedan upptäcka deras subcellulär lokalisering7. Denna metod kräver dock ordentlig utbildning och hantering av radioaktivt avfall. Under sådana omständigheter som avsaknaden av en specifik antikropp, frånvaron av en ordentlig markör, eller Scarcenessen av utrustning såsom confocal Mikroskop måste ett alternativt tillvägagångssätt övervägas. För att identifiera en protein translokationen i cellkärnan, är det attraktivt att bara märka målproteiner med en markör och färga atomkärnor med kemiska reagens 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eftersom detta endast kräver regelbunden fluorescens Mikroskop.

Immunolabeling C. elegans med antikroppar är utmanande på grund av den låga permeabiliteten av antingen äggskalet eller kollagena nagelbanden kring djuret. Under tiden, eftersom C. elegans proteiner är signifikant skilda från deras ryggradsdjur orthologs, ge några kommersiella företag C. elegans med specifika produkter. Det är svårt för ett litet laboratorium att generera C. elegans antikroppar för sig själva. Forskare inom gemenskapen använder ofta märkta proteiner som markörer för att demonstrera ett protein lokalisering eller gen uttryck. Denna artikel använder EXL-1::GFP som ett exempel för att spåra en protein translokationen i cellkärnan under värme stress8. En integrerad translationell exl-1::gfp in djur genomet används stabilt uttrycka genen med gfp fusion. Forskning visade att exl-1 uttrycks i tarmen, kroppen väggen muskler och andra subcellulära strukturer8. Detta protokoll visar hur synkronisera maskar till den fjärde larvstadium (L4), utföra en värme stress experiment och beteende DAPI färgning, etanol fixering, aceton fixering och imaging i regelbundna fluorescens Mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. lösningar

  1. NGM plattor
    1. I en 2 L Erlenmayerkolv, tillsätt 3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton och 975 mL dH2O. täcker mynningen av kolven med aluminiumfolie. Autoklav kolven för 50 min. Cool det för 20 – 30 min.
    2. Lägg sedan till steriliserade lösningar: 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol i etanol, 1 mL 1 M MgSO4och 25 mL 1 M KPO4 (pH 6.0) buffert. Snurra lösningarna för att blanda dem väl.
    3. Använder en flytande dispenser, fördela NGM lösningen på 60 mm Petri plattor. Fyll plattorna 2/3 full av agar. Förvara dem i en lufttät behållare vid 4 ° C för framtida bruk.
  2. 1 M KPO4 buffert (pH 6.0)
    1. Lös upp 10.83 g KH2PO4 och 3,56 g K2HPO4 i dH2O och sedan justera den totala volymen 100 ml. Autoklav lösningen för 15 min.
  3. M9
    1. Lös upp 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl i dH2O, tillsätt 1 mL 1 M MgSO4och justera den totala volymen till 1 L.
  4. 10 µg/mL DAPI
    1. Tillsätt 1 µL av 10 mg/mL DAPI in 999 µL av dH2O.
  5. 95% alkohol (v/v)
    1. Mät 95 mL 100% alkohol och Tillsätt destillerat vatten för att justera volymen till 100 mL.
  6. 30% aceton (v/v)
    1. Tillsätt 30 mL aceton till dH2O och justera den totala volymen 100 ml.

2. värme Stress

  1. Generera en extrachromosomal matris linje med en translationell konstruktion av mål gener9,10. Alternativt skaffa sådan rader från Caenorhabditis genetik Center (CGC), som är en offentlig resurs för C. elegans forskning, eller från en tidigare publicerad forskningslaboratorium.
  2. Integrera de extrachromosomal linjerna i genomet genom att exponera maskar till 3.800 Rad γ-strålning9. Markera raderna stabilt uttryckt så att varje djur uttrycker en markör protein såsom en god Jordbrukarsed eller rulle.
  3. Ta bort mutationer som genereras under strålningen, ropen raderna minst 2 x. Använd denna transgena linje för att upptäcka protein uttryck mönster förändringar under stress.
  4. Förbereda NGM mask plattor som beskrivs i steg 1,1. Streak en OP50 klon och kultur bakterierna i flytande LB buljong över natten. Utsäde NGM plattorna med flytande OP50 kultur och inkubera plattorna i en inkubator i 37 ° C över natten för att växa en bakterier gräsmatta som en näringskälla för maskar. Kyla ner plattorna vid rumstemperatur i minst 30 min innan användning.
  5. Växer den transgena linjen vid 20 ° C utan svält för minst 2 generationer före värme stress analysen.
  6. Plocka 8 – 10 ung dräktig vuxna (livmodern fylld med ägg) till en ny mask tallrik, så låt dem lägga ägg för ca 3-5 h och ta bort alla vuxna från plattorna.
  7. Om du vill synkronisera maskar, låt Äggen kläcks och växer larverna för ca 48 h till den fjärde larvstadium (L4). Undersöka deras vulva struktur (en halvmåne struktur) för att identifiera L4 scenen (figur 1, pil)11.
  8. Placera masken plattorna med L4 larver i en 35 ° C inkubator för 2 – 5 h att uppnå värmestress. Placera en termometer i inkubatorn att noggrant mäta temperaturen.

3. DAPI färgning

  1. Etanol fixering
    1. Tillsätt 10 µL av M9 bufferten i mitten av en glasskiva.
    2. Plocka de värme-chockade maskarna från steg 2,8 och sätta dem i M9 bufferten på en glasskiva.
      1. Alternativt tvätta plattan med M9, Centrifugera det 1 000 x g för 1 min i rumstemperatur, och kasta bort supernatanten. Lägg till maskar i glas-bilden.
    3. Använd en mjuk servett rinna någon överflödig vätska. Titta på detta steg under en dissekera Mikroskop.
    4. Tillsätt 10 µL 95% alkohol på maskar och låt dem lufttorka. Titta på processen i dissekera Mikroskop, och inte låta djuren få alltför torr. Omedelbart efter det att etanolen har avdunstat från djuren, gå vidare till nästa steg.
      Obs: Etanol avdunstar mycket snabbt.
    5. Upprepa steg 3.1.4 två gånger så att maskarna är fasta.
      Obs: Det är normalt för de djur som ser mörkare och förvrängd.
    6. Tillsätt 10 µL av DAPI (10 µg/mL) till maskar. Omedelbart täcka dem med ett täckglas och försegla bilden med transparent lack gel.
    7. Visa djuren efter ca 10 min på fluorescens Mikroskop.
  2. Aceton fixering (ett alternativt tillvägagångssätt)
    1. Tvätta bort värme-chockade plattan från steg 2,8 med M9, Centrifugera det 1 000 x g för 1 min i rumstemperatur, och kasta bort supernatanten. Tvätta pelleten med 1 mL av dH2O, samla pelleten och kasta bort supernatanten.
    2. Tillsätt 400 µL av 30% aceton för 15 min. Centrifugera vid 1 000 x g för 1 min i rumstemperatur och Kassera supernatanten. Använd 500 µL av dH2O tvätta djuren 2 x. Kassera supernatanten.
    3. Tillsätt 200 µL av DAPI (10 µg/mL), eller 4 x mängden totala maskar volym, i röret för 15 min.
    4. Centrifugera vid 1 000 x g i 1 min och kasta bort supernatanten. Tvätta pelleten 2 x med 500 µL av dH2O. Placera maskar på objektglas, täck dem med coverslips, försegla bilden med transparent lack gel och observera djuren i fluorescens Mikroskop.

4. mikroskopbilder

  1. Slå på UV ljuskällan och fluorescens Mikroskop. Slå på datorn ansluten till mikroskopet.
  2. Läsa in bilden på mikroskopet fluorescens. Använd en låg effekt objektiv (10 X) att hitta maskar, öka förstoring makt till 400 X och fokusera på preparatet.
  3. Öppna programvaran medföljer mikroskopet. Klicka på ”förvärv” i menyn; Klicka på ”kamera” och välj kamera ansluten till mikroskopet; Detta tillåter den valda kameran att kommunicera med programvaran.
    Obs: Olika Mikroskop kan variera i drift.
  4. Under samma ”förvärv”, klicka på ”flerdimensionell förvärv”. Detta öppnar ett nytt fönster ”flerdimensionell förvärv” navigering. Klicka på knappen ”Multichannel”, och alla tillgängliga kanaler visas.
  5. Välj blå, grön och DIC (differential störningar kontrast) att observera preparatet. I ”flerdimensionell förvärv” navigation, lämna den ”blå-DAPI”, ”Green-GFP” och ”grå-DIC”, ”Nomarski” kanaler på; Högerklicka på andra kanaler, till exempel ”Red-rodamin” och ”White-ljusa fält”, att stänga dem.
  6. Mät först, exponeringstiden för varje kanal:
    1. Vänsterklicka på ”blå-DAPI” kanal för att markera den och klicka sedan på ”åtgärd” för att ta en levande bild under DAPI kanalen med den automatisera exponeringstiden. Ett nytt fönster med en levande bild visas.
    2. På vänster sida av fönstret live-bild, manuellt justera exponeringstiden vid behov att göra bilden som önskas.
    3. Slutligen, klicka på ” ”OK ”i fönstret live-bild. Detta ställer in exponeringstiden under kanalen DAPI.
  7. Upprepa steg 4,6 för de andra kanalerna, ”Green-GFP” och ”grå-DIC”, ”Nomarski”, ställa in exponeringstider för dessa kanaler.
  8. Klicka på ”Start” för att automatiskt samla in 3 bilder under de 3 olika kanalerna i ordning (se ovan) med specifika exponeringstider som anges i fönstret ”flerdimensionell förvärv” navigering.
  9. Om du vill spara filen, gå till huvudmenyn, klicka på ”File” och sedan på ”Spara som”. Indatafilens namn och namnet på mappen. Spara filen som standardfilformat att bevara imaging detaljinformationen för framtida referens.
  10. Att exportera filen i andra format:
    1. Gå till ”fil” och klicka på ”Exportera”. Detta kommer att öppna upp en export inställning fönster.
    2. Ange filnamn och mappnamn. Kontrollera ”skapa en projektmapp” att bättre organisera data. Programvaran tillåter även användaren att ange 4 andra alternativ: ”generera samman bilder”, ”Använd färg för bilder kanal”, ”Använd kanal namn” och ”sammanfogad bild endast”.
    3. Välj en önskad filtyp från droppa-ned menyn, såsom ”TIF”, ”BMP”, ”PSD”, eller ”JPG” och andra typer. Klicka sedan på ”Start” för att exportera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klorid intracellulära kanal proteiner (CLIC) är multifunktionella proteiner som bevaras mycket över arter12. Mycket forskning visar att klickar reglera cellulär stress, autofagi, apoptos, carcinogenes, angiogenes och makrofag medfödda immunsvaret i däggdjur system13,14,15,16 ,17. Det finns två CLIC homologs i C. elegans: exl-1 och exc-4. Vår senaste studie visade att exl-1 reglerar djurs stress management8. Vi integrerade en translationell exl-1::gfp konstruktion i en djurens arvsmassa och skapade transgena linjerna, som stabilt express gene exl-1 med en god Jordbrukarsed som markör (figur 2A och 2B). Under värmestress ackumuleras EXL-1::GFP i kärnan i regionen intestinal eftersom den starka GFP-signalen överlappar med nucleus struktur (figur 2 C -E). För att bekräfta den subcellulära lokaliseringen, användes DAPI färgning som en strategi för att färga atomkärnor. Använda etanol fixering för DAPI färgning visar tydliga atomkärnor i djurens kroppen (figur 3B). Aceton fixering uppnår också liknande resultat (figur 3E). De överlappande GFP och DAPI signalerna bekräftar att EXL-1::GFP verkligen samlat i kärnor i regionen intestinal (figur 3 c, F).

Figure 1
Figur 1: Bilder av en fjärde larver (L4) etapp C. elegans under olika förstoring befogenheter. (A) 63 X, (B) 115 X, och (C) 400 X förstoring makt. Pilarna pekar på vulva på en L4 mask; Obs halvmåne struktur. Skalstapeln = 100 µm i alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Under värmestress, EXL-1::GFP ackumuleras i kärnor av inälvan. (A) Normaski bild av en tarmregionen innan värme chock. (B) en stark signal om GFP observerades i regionen intestinal innan värme chock. (C) Normaski bild av tarmregionen efter värme chock (pilarna peka på atomkärnor av intestinal regionen). (D) en stark signal om GFP ackumuleras efter värme chock. (E) överlappande bild av god Jordbrukarsed och Normaski. Alla bilder är tagna med 400 X förstoring makt. Skalstapeln = 50 µm i alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: EXL-1::GFP translokationen i cellkärnan bekräftas av DAPI färgning. (A-C) Använda etanol fixering för DAPI färgning. (D-F) Använda aceton fixering för DAPI färgning. I A och Dvisar grön färg god Jordbrukarsed signal i tarmregionen. I B och Evisar blå färg atomkärnor av DAPI färgning. C och F visar överlappande bilder av GFP, DAPI och Normaski. Skalstapeln = 50 µm i alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande bild: Aceton fixering bevarar preparatet och 60 dagar efter aceton fixering, god Jordbrukarsed och DAPI signaler kan fortfarande observeras. (A) Green är för god Jordbrukarsed. (B) blå är för DAPI signal. (C) överlappande bild av god Jordbrukarsed, DAPI och DIC. Alla bilder är tagna under 400 X förstoring makt. Skalstapeln = 50 μm. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den här artikeln presenteras en snabb och effektiv metod för att verifiera protein subcellulär ändringar från cytoplasman till kärnan. Proteinuttryck visades av en god Jordbrukarsed fusion, medan kärnan strukturen kontrollerades av DAPI färgning (figur 3). Eftersom immunfärgning C. elegans proteiner är utmanande, de flesta C. elegans protein subcellulär lokaliseringar kännetecknas genom att tagga dem med markör proteiner som GFP, Laz, mCherry och andra18,19 , 20 , 21. i denna artikel, gfp användes att tagga mål genen exl-1 för att demonstrera dess protein cellulär lokalisering. För att bekräfta cellkärnelokalisering, användes DAPI färgning. Två alternativa metoder presenterades för DAPI färgningen. Båda visade effektivt stark kärnor i worms inom en anständig arbetande tid (mindre än 1 h). Etanol fixering är lämplig för en liten provsamling som en kvalitet observation (samla mindre än 50 maskar). Att förhindra maskar torkar helt är nyckeln. När 95% alkohol avdunstar från maskar, omedelbart gå vidare till nästa steg. Aceton fixering är lämpad för en storskalig provsamling såsom en kvantitativ analys (samla över 50 djur). Dock på grund av flera steg i tvätta provet, förloras vissa exemplar. Således, det rekommenderas att noggrant avlägsna supernatanten och behålla så många maskar som möjligt. När de är förseglade, kan diabilder som följd av aceton fixering lagras i en vecka vid 4 ° C.

Detta protokoll kan anpassas till andra proteiner av intresse att spåra subcellulär lokalisering ändringar. Förutom den värmestress som presenteras här, kunde andra stress analyser bedömas såsom oxidativ stress, tungmetall stress, diet och andra. Protein subcellulär lokalisering förändring kunde också undersökas genom att ändra den genetiska bakgrunden av proteinet av intresse. Exempelvis kan transgena linjen korsas in en annan mutant's bakgrunden, så att den nya genetisk interaktionen kan identifieras. RNA-interferens (RNAi) kan också användas för att slå ner specifika gener och undersöka resulterande protein subcellulär lokalisering förändringen. Dessa program är av stort intresse att identifiera roman reglerande komponenter. För en okänd protein, bör olika experimentella förhållanden testas, såsom testning reagens halterna, hur länge den stress och de särskilda utvecklingsstadierna av maskar. I vår studie har försökt vi olika löptider, från 30 min till 5 h och olika värme stress temperaturer. En värme chock vid 35 ° C för 3 h visar tydligt en protein translokationen i cellkärnan.

Ytterligare tillämpningar av DAPI färgning inkluderar undersökning av meios och Mitos processen i worms, särskilt i könsceller celler22,23,24,25, och en sammanräkning av antalet kärnor i en genetiska mutant's bakgrund20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

C. elegans stammar används i denna studie erhölls från stadens Caenorhabditis genetik, som stöds av den National Institutes of Health - Office av infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Detta arbete stöds av NIH: 1R03AG048578-01 till Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 till Jun Liang och PSC-CUNY 66184-00 44 och 67248-00 45 till Jun Liang. Vi tackar Cathy Savage-Dunn för vänligen dela hennes laboratorium utrymme. Alla fluorescens bilder samlades på Queens College Core Facility. Vi tackar William J. Rice för hans synpunkter på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).

Tags

Biologi fråga 137 värmestress subcellulär lokalisering ändra cellkärnelokalisering grön fluorescens protein DAPI färgning etanol fixering aceton fixering
Att upptäcka Protein subcellulär lokalisering av grönt fluorescerande Protein taggning och 4', 6-diamidin-2-fenylindol färgning i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. … More

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter