Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لاستخراج الحمض النووي الفيروس سريعاً من الدم كله فيروس معطل. الاستخراج تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء. الأسلوب لا تعتمد على مرافق المختبرات، ويمكن استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية).
Abstract
التشخيص السريع للعدوى أمر أساسي لإدارة تفشي واحتواء المخاطر، والعناية بالمرضى. أننا أظهرنا سابقا طريقة للمنظمة السرير السريع لفيروس الإيبولا أثناء أخذ عينات من الدم لإجراء اختبارات الحمض النووي آمنة (غ) عن طريق إضافة المخزن مؤقت تحلل تجارية/ربط مباشرة إلى أنابيب جمع الدم فراغ. باستخدام هذا النهج المنظمة السرير، وقد وضعنا آمنة وسريعة ومبسطة سرير نا استخراج أسلوب للكشف عن الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة اللاحقة. استخراج نا تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء.
بعد أن يتم جمع الدم في المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، المحتويات مختلطة بقلب الأنبوب باليد، وهي المحتضنة الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الزجاج المغناطيسي الجسيمات (مجبس) هي إضافة إلى الأنبوب، والمحتويات مختلطة بالتقليب أنبوب جمع باليد. ثم يتم جمع مجبس جانب أنبوب جمع الدم باستخدام حامل مغناطيسي أو مغناطيس وشريط المطاطي. مجبس غسلها ثلاث مرات، وبعد إضافة شطف المخزن المؤقت مباشرة في أنبوب جمع، الناس مستعدون للاختبارات نا، مثل قبكر أو حلقة متحاور التضخيم (المصباح)، دون إزالة مجبس من رد فعل. طريقة استخراج نا لا يعتمد على أي مرافق المختبرات، ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية وأجنحة العزل في المستشفى). عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك محمولة، يمكن الحصول على تشخيص داخل 40 دقيقة لجمع الدم.
Introduction
في حالات تفشي الفيروس، عند المرضى الذين تقتصر على أجنحة العزل في المستشفى أو عندما يحتاج إلى تشخيص سريع، يتحتم تشخيص جزيئي نقطة من رعاية آمنة وبسيطة ودقيقة لاحتواء المريض الرعاية والمخاطر. تفشي الفيروسية الأخيرة اثنين، لفيروس الإيبولا (أبوف) في غرب أفريقيا (2013) وفيروس زكى في أمريكا الجنوبية (2015)، زاد الاهتمام بتحسين العناية بنقطة الجزيئية الاختبارات التشخيصية، مثل النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح)1،2 و recombinase بوليميريز التضخيم (الجيش الوطني الرواندي)3،4. RT-مصباح والجيش الوطني الرواندي هي الاختبارات الجزيئية السريعة والحساسة، والمحددة التي يمكن أن يؤديها على الاستعدادات نموذج مبسط. لهذا الفيروس زكى، الرايت-مصباح قد اقترن بتدفق أفقي مقايسة (الوكيل)، الذي يمكن الكشف عن الفيروس Zika في عينات غير تنقية الدم كله داخل 30 دقيقة1؛ ومع ذلك، أبوف، التي تصنف على أنها ممرض مجموعة 4 مخاطر وهو معد للغاية، العينات تحتاج إلى معالجة إطار السلامة الأحيائية من المستوى 4 (BSL-4) الشروط وغير نشط قبل إجراء أي إجراءات تشخيصية آمنة.
واستخدمت أساليب المنظمة مبسطة أبوف، مثل إضافة المخازن المؤقتة لتحلل عينة2،3،،من45، أثناء اندلاع؛ ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق التعامل مع ظروف BSL-4 مع معدات المختبرات، مثل خزانات السلامة البيولوجية BSL-3 وأجهزة الطرد المركزي، وكتل تدفئة والماصات، كحد أدنى. هذه المعدات عادة غير موجود في أجنحة العزل أو في مستشفيات ميدانية. للتغلب على هذا التحدي، بذلت محاولات إجراء عمليات التشخيص في حقائب3، وكان العديد من الأجهزة المحمولة والأجهزة المتقدمة [مثلجهاز محمول لاستخراج الحمض النووي (غ)]6. ومع ذلك، عينات أبوف الإيجابية لا تزال بحاجة ليكون غير نشط قبل أن يمكن استخدام هذه الأجهزة.
سابقا أبلغنا أسلوب المنظمة فيروس سرير سريع لفيروس اللقاحية، أبوف7و فيروس جدري بقر8 قبل إضافة المخزن المؤقت تحلل التجارية/ملزمة أنابيب جمع الدم فراغ العادية، مما يسمح للمباشرة نقل الدم من المريض إلى المخزن المؤقت للمنظمة7. هذه المنظمة مباشرة وفورية في نظام مغلق ويلغي الحاجة للتعامل مع العينات باستخدام أي احتواء صارمة، مثل شروط BSL-47، ويمكن التعامل مع العينات BSL-2 في الظروف العادية. هذا الأسلوب المنظمة متوافق مع عدة أنظمة استخراج نا، مثل الروبوتات واليد تنقية مجموعات7؛ ومع ذلك، هذه الأساليب تتطلب معدات المختبرات، مثل الروبوتات وأجهزة الطرد المركزي، والكهرباء، والتي لا تكون دائماً موجودة في إعدادات الحقل، أو داخل أجنحة العزل في المستشفى.
وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة ومبسطة يدوي نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية اللاحقة. طريقة استخراج نا لا يتطلب أي معدات خلاف حامل مغناطيس/مغناطيسية. لا توجد أجهزة الطرد المركزي، تدفئة كتل، أو الكهرباء اللازمة لاستخراج نا. ومن ثم، هذا الأسلوب لا يعتمد على مرافق المختبرات ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية، في أجنحة العزل في المستشفى، أو مع إعدادات الموارد المنخفضة). طريقة استخراج نا سريعة وبسيطة ويمكن استخدامها مباشرة في أي اختبارات نا المتلقين للمعلومات، مثل قبكر أو RT qPCR مصباح RT-مصباح. عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك متحاور يحركها البطارية محمولة، يمكن الحصول على تشخيص سرير داخل 40 دقيقة لجمع الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اللجنة المعنية "أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية"، أعطت إقليم العاصمة المستنيرة، وجميع الأساليب الموصوفة هنا قد أعفيت من استعراض منظومة اللجنة الأخلاقية، وفقا للقانون الدانمركي في مشاريع التنمية المقايسة.
1. إعداد أنابيب فراغ جمع الدم للفيروس المنظمة واستخراج نا السريع
تحذير: يحتوي على المخزن المؤقت المستخدم لهذا البروتوكول جوانيدينيوم ثيوسيانات (جتك) وغير الأيونية خافض للتوتر السطحي، ومهيجات. اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة واستخدام غطاء تدفق، وارتداء القفازات عند التعامل مع الأمر. تجنب أي الجلد والاتصال بالعين. إذا كان المخزن المؤقت هو المسكوب، السطحية الملوثة يجب ابدأ أن تطهيرها مباشرة مع الكلورامين أو هيبوكلوريت الصوديوم (المكونات النشطة في "بليتش") نظراً لأن هذا الخليط يمكن أن يؤدي إلى تشكيل مادة السيانيد السامة. أولاً، يمسح حتى المخزن المؤقت الذي امتد مع الأنسجة ماصة. بعد ذلك، تنظيف السطح مع الإيثانول 70%، ومن ثم بالماء، وأخيراً، استخدام الكلورامين أو هيبوكلوريت الصوديوم.
- إعداد أنابيب فراغ جمع الدم، حقن 1.6 مل من المخزن المؤقت تحلل تجارية محددة في أنبوب فراغ يدتا 4 مل من ثقب غطاء الأنبوبة باستخدام إبرة 25 × 1 وحقنه 3 مل.
ملاحظة: لا تقم بإزالة غطاء أنبوب الفراغ. يجب المحافظة على الفراغ. - تخزين أنابيب الفراغ الذي يحتوي على المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
ملاحظة: الأنابيب مستقرة على الأقل 1 سنة بعد إعدادها.
2-إعداد المخازن المؤقتة لاستخراج نا
- إعداد المخازن المؤقتة لاستخراج نا، مكان اثنين 1.8 مل ومل 4.5 اثنين واحد 3.6 مل أنابيب في حامل.
- إضافة، عن طريق بيبيتينج، 960 ميليلتر من الزجاج المغناطيسي الجسيمات (مجبس) إلى الأنبوبة نظيفة 1.8 مل والتسمية مع مجبس. ريسوسبيند تعليق تجاوب تماما قبل بيبيتينج أنه.
ملاحظة: مجبس تميل إلى جمع بسرعة في الجزء السفلي من الأنبوب. - إضافة، عن طريق بيبيتينج، 4 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وأنا إلى أنبوب مل 4.5 نظيفة وتسميته كالبنك الدولي-1.
تنبيه: يغسل المخزن المؤقت يحتوي كلوريد جوانيدينيوم، ومهيجة. اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة واستخدام غطاء تدفق، وارتداء القفازات عند التعامل مع الأمر. تجنب أي الجلد والاتصال بالعين. - إضافة 1.5 مل أغسل المخزن المؤقت الثاني لأنبوب نظيفة 3.6 مل، بيبيتينج، وتسميته كالبنك الدولي-2.
- إضافة، عن طريق بيبيتينج، 3 مل أغسل المخزن المؤقت الثالث إلى أنبوب مل 4.5 نظيفة وتسميته كالبنك الدولي-3.
- إضافة، عن طريق بيبيتينج، 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى أنبوب نظيف 1.8 مل وتسميته كاجتماع المجلس التنفيذي.
- تخزين المخازن المؤقتة الكوتيد في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
ملاحظة: الأنابيب مستقرة لمدة شهر واحد على الأقل بعد إعدادها.
3-الدم مجموعة من المرضى الذين يعانون من علامات وأعراض الإصابة بعدوى الفيروس
تنبيه: اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة عند جمع الدم كله من المريض. ارتداء القفازات والنظارات. إذا كان المريض بمعزل عن غيرها، يرجى اتباع إجراءات السلامة البيولوجية المستوى 4.
- جمع الدم كله عن طريق الحقن الوريدي من المريض واستخدام إبرة فراشة مع أنابيب التمديد العيار الصغير وأنبوب فراغ جمع دم الذي يحتوي على مخزن مؤقت تحلل/ملزمة. بقية ذراع المريض في وضع الهبوط ووضع أنبوب جمع أقل من إبرة الفراشة. أدخل إبرة فراشة في هذا السياق المريض وإرفاق أنبوب جمع الدم إلى تمديد العيار الصغير.
ملاحظة: هذا سوف يمنع التدفق الخلفي. - بعد جمع الدم وخلط محتويات الأنبوبة بالتقليب الأنبوب 5-10 مرات.
ملاحظة: بسبب الفراغ المتبقي في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على 1.6 مل من المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، سيكون حجم العينة التي يتم جمعها تلقائياً 1.6 مل. - تطهير الجزء الخارجي الأنبوبة باستخدام الإيثانول 70%.
- احتضان هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا ويمكن تخزين أنابيب جمع الدم الكامل في-20 درجة مئوية، 5 درجة مئوية، 25 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية على الأقل 1 في الشهر7. - مواصلة مباشرة إلى أسلوب استخراج نا مبسطة.
4-تبسيط استخراج نا من الدم كله
- لتنقية نا من تحلل/ربط المخزن المؤقت معطل جمع الدم، مزيج محتويات الأنبوبة بالتقليب الفراغ الأنبوبة باليد x 5-10.
- إزالة غطاء الأنبوبة بعناية، والاضطلاع بالغطاء.
- صب قاسمة المعدة من مجبس (1 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
- ضع غطاء جديد من أنبوب جمع دم غير مستخدمة على الأنبوبة التي تحتوي على العينة.
- وضع إصبع على الغطاء التأكد من أن يتم إغلاق الأنبوب محكم وخلط محتويات الأنبوبة بالتقليب أنابيب جمع الدم باليد 5-10 مرات.
- ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وإبقاء إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
- الوجه صاحب المغناطيسي مع الأنبوب بضع مرات باليد للتأكد من أن تجمع جميع مجبس إلى جانب الأنبوب مع المغناطيس.
ملاحظة: يمكن استبدال حامل المغناطيسي مع مغناطيس ممدود وشريط المطاطي. - قم بإزالة غطاء الأنبوب وتجاهل محتويات الأنبوبة باستخدام ماصة المتاح أو ببساطة عن طريق صب المحتويات إلى أنبوب جمع 50 مل.
ملاحظة: تجنب الهباء الجوي من أنبوب جمع 50 مل بإغلاق الأنبوب بغطاء. - صب قاسمة استعداد البنك الدولي-1 (4 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
- ضع الغطاء على الأنبوب ووضع إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
- إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية، والحفاظ على الغطاء وشددت بشكل أمن مع إصبع.
ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب. - ريسوسبيند مجبس واسطة التقليب أنابيب جمع الدم باليد 5-10 مرات.
- كرر الخطوات من 4.6-4.8.
- صب قاسمة استعداد البنك الدولي-2 (1.5 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
- ضع الغطاء على الأنبوب وإزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية.
ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب. - وضع إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
- ريسوسبيند مجبس واسطة التقليب أنابيب جمع الدم لبضع ثوان من جهة.
- كرر الخطوة 4، 6-4، 8.
- صب قاسمة استعداد البنك الدولي-3 (3 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
- ضع الغطاء على الأنبوب وإزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية.
ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب. - وضع إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
- ريسوسبيند مجبس واسطة التقليب أنابيب جمع الدم باليد 5-10 مرات.
- كرر الخطوات من 4.6-4.8.
- صب قاسمة استعدادا لاجتماع المجلس التنفيذي (100 ميليلتر) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
- ضع الغطاء على الأنبوب وإزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية.
ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب. - ريسوسبيند مجبس في المجلس التنفيذي بالتنصت على أنابيب جمع الدم 5-10 مرات بأصبع.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا، ويمكن تخزين الأنابيب عند-20 درجة مئوية. - ونقل أحد الحبرية (5-8 ميليلتر) مجبس ريسوسبينديد إلى المصب نا التضخيم رد فعل مزيج من 1.5 مل ماصة المتاح (التضخيم نا أي المتلقين للمعلومات التشخيصية الاعتداء مثل يمكن استخدام مصباح/RT-مصباح أو فحوصات qPCR/RT-قبكر) باستخدام.
ملاحظة: سوف تتمسك مجبس الناس، لذا يجب التأكد من استخدام مجبس التضخيم نا المتلقين للمعلومات كرد فعل. مزيج من تعليق تجاوب قبل الاستخدام. بعد خلط، جمع مجبس في الجزء السفلي من الأنبوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول المعروضة هنا هي بسيطة وفعالة ويمكن تطبيقها على نطاق واسع لأي التحليل الجزيئي المراد تنفيذها على عينات الدم كله المعدية غير نشط مع المخزن المؤقت تحلل/ملزمة. ويبين الشكل 1، بما في ذلك إعداد الدم جمع أنابيب فراغ7 (الشكل 1A)، جمع الدم7 (الشكل 1B)، استخراج NA ( سير العمل للمنظمة الدم واستخراج نا 1 الأرقام - ح 1)، وتحليل نا المصب (1I الشكل).
سبب البروتوكول استخراج نا مبسطة، لا تتم إزالة مجبس من الخطوة شطف، وعليه، الناس تميل إلى التمسك مجبس. يجب إجراء التحليل الجزيئي أي المتلقين للمعلومات، مثل قبكر أو تحليل مصباح، مباشرة على مجبس (1I الشكل و الشكل 2) لضمان تحقيق نتيجة إيجابية.
طريقة استخراج نا عينات الدم كله تتسم بالكفاءة، وإيجابية الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الفيروس مع الأحمال الفيروسية منخفضة كما يمكن استخراج نسخ/مل 130-3,000 وتحليلها باستخدام قبكر أو RT-قبكر (الشكل 3).
باستخدام طريقة استخراج نا مصباح أو RT-مصباح وجهاز محمول متحاور يحركها البطارية لعينات الدم كله مصابات بالفيروس، يمكن الحصول على تشخيص داخل 40 دقيقة من جمع الدم (الشكل 4).
الشكل 1 : سير العمل لاستخراج عينات الدم كله نا مبسطة. (أ) تحضير أنابيب جمع الدم فراغ المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة باستخدام إبرة وحقنه. (ب) جمع الدم باستخدام إبرة فراشة. (ج) مكان أنابيب جمع الدم في حامل، إزالة الغطاء، وصب في مجبس في الأنبوب. (د) إغلاق الأنبوب بغطاء جديد، وخلط المحتويات بقلب الأنبوب باليد. (ه) جمع مجبس إلى جانب أنابيب جمع الدم بالتقليب الأنبوبة في حامل المغناطيسية. (و) إزالة المادة طافية ماصة المتاح باستخدام. (ز) من أجل غسل أو شطف المخازن المؤقتة مباشرة في أنبوب جمع الدم وتكرار الإجراءات التي تظهر في ألواح د - و. (ح) هذا الفريق يظهر مجبس جاهزة للاستخدام المباشر في قبكر، رد فعل RT-قبكر أو مصباح RT-مصباح. (أنا) نقل واحد الحبرية (5-8 ميليلتر) من مجبس لأنبوب تفاعل PCR أو مصباح استخدام ماصة المتاح من 1.5 مل. لوحة A و B: تم تعديل هذا الرقم من روسينستيرني et al. 7- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : كشف نا من عينات الدم كله الحاملات للفيروس 28 المستخرجة باستخدام الأسلوب استخراج نا مبسطة. عينات الدم كله (1.6 مل) اختبار سلبي لفيروس قد ارتفعت مع أما فيروس الحمض النووي [فيروس ابشتاين-بار (EBV) (2.0 × 104 -1.0 × 103 نسخ/مل)] أو فيروسات رنا [فيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) (6.0 × 105 -3.0 × 103 نسخ/مل)] فيروس حمى الضنك (DENV) أو (1.7 × 108 -1.7 × 106 نسخ/مل). ناس استخرجت باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه، وحللت ناس المستخرجة في تكرار qPCR داخلية محددة، الرايت-بكر، ومصباح أو RT-مصباح، مع أو بدون مجبس. العاشر-المحور على أسلوب الكشف نا، y=-محور = النسبة المئوية للعينات الإيجابية في قبكر/مصباح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : حساسية طريقة استخراج نا مبسطة. دليلاً على مفهوم الأسلوب، كان ارتفعت الفيروس سلبية الدم كله مع مختلف الاستعدادات الحمض النووي الريبي أو فيروس الحمض النووي التي تحتوي على حمولة فيروسية محددة، وناس استخرجت باستخدام طريقة استخراج نا مبسطة. وقد ارتفعت الدم كله سلبي (A) (1.4 مل) مع 200 ميليلتر لتخفيف إذ المعيار أبوف أعدت لأغراض التشخيص (انيفد)، الذي أعد من التفشي الأخير في غيكيدو/غينيا (2.0 × 106 نسخ/مل). تم تحليل ناس المستخرجة في تكرار أبوف محددة RT-qPCR داخلية7 cycler حرارية MX3005P استخدام. (ب) كل الدم (1.2 مل) قد ارتفعت مع 400 ميليلتر لتخفيف الوقت عينة موحد مصل "فيروس التهاب الكبد جيم الذين" (1.2 × 106 وحدة دولية/مل). حللت ناس المستخرجة في التكرارات بداخلية خاصة بفيروس التهاب الكبد جيم RT-qPCR cycler حرارية MX3005P استخدام. وقد ارتفعت الدم كله (ج) (1.2 مل) مع 400 ميليلتر من تركيزات مختلفة من EBV (2.0 × 104 نسخ/مل و 8.0 × 103 نسخ/مل، 2.7 × 103 نسخ/مل و 9.3 × 102 نسخ/مل). حللت ناس المستخرجة في التكرارات qPCR EBV محددة داخل المنظمة. وقد ارتفعت الدم كله (د) (1.2 مل) مع 400 ميليلتر لتخفيف إذ فيروس BK (1.3 × 104 نسخ/مل). حللت ناس المستخرجة في التكرارات qPCR BK محددة داخل المنظمة. العاشر-محور = التركيز النهائي للفيروس في عينة الدم كله ارتفعت (نسخ/مل أو وحدة دولية/مل)، ص-محور = Ct-القيمة (يعني ± التنمية المستدامة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تبسيط استخراج نا ومصباح RT أو مصباح باستخدام جهاز محمول متحاور. (أ) بسبب الافتقار إلى عينات الدم كله أبوف-الإيجابية في الإدارة من الفيروسات والتشخيص الميكروبيولوجي الخاصة، أعلن معهد المصل، الدانمرك، كان ارتفعت 1.4 مل دم كله سلبي مع 200 ميليلتر لتخفيف مختلفة أبوف المعايير المعدة لأغراض التشخيص (انيفد). عينات ارتفعت خضع لاستخراج نا استخدام أسلوب استخراج نا مبسطة وتم تحليلها بواسطة فعل محددة أبوف RT-مصباح. كعنصر تحكم سلبية، أدرج عينة دم كله سلبي. X-محور تركيز أبوف النهائي في عينة الدم كله ارتفعت (نسخ/مل)، ص=-محور = مين إلى إيجابية. (ب) لإثبات المفهوم، مختبرين الدم كله (1.6 مل) من المرضى 7، تشخيص إيجابية ل EBV (13,000-500 نسخة/مل) في قسم من الفيروسات والتشخيص الميكروبيولوجي الخاصة، أعلن معهد المصل، الدانمرك، خضع نا استخراج باستخدام الأسلوب استخراج نا مبسطة وحللت بفعل مصباح EBV على حدة باستخدام جهاز متحاور مع "المارد الثاني" يحركها البطارية المحمولة. كعنصر تحكم سلبية، أدرج نموذج برفو B19-إيجابية. العاشر-محور = الحمل الفيروسي من EBV في عينة المرضى (نسخ/مل)، ص-محور = مين إلى إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة وبسيطة دليل سرير نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية المتلقين للمعلومات. ووضعت طريقة استخراج نا وصف المراد تنفيذها مباشرة على عينات الدم كله في أنابيب جمع الدم الفراغ الذي يحتوي على المخزن المؤقت (جدول المواد) تحلل/ملزمة7. هذا المخزن المؤقت المحدد يحللها أبوف7 وهو العنصر الحاسم في الأسلوب. بعد جمع الدم، نوصي بحضانة الأنبوب على الأقل 20 دقيقة7 ضمانا المنظمة كاملة للعينة. المنظمة أبوف السرير يلغي الحاجة للتعامل مع أية عينات إيجابية أبوف تحت شروط صارمة من احتواء، مثل شروط BSL-4، ويسمح للعينات للتعامل معها في ظل الظروف العادية BSL-2. فمن المحتمل أن الأخرى خطر المجموعة أربعة مسببات الأمراض، مثل إبطال الفيروس آسا وفيروس ماربورغ، وفيروس الحمى النزفية "القرم الكونغو" أيضا بهذا المخزن المؤقت، ولكن يبقى هذا سيظهر.
وصف طريقة استخراج نا وضعت المراد تنفيذها بجوار مريض في جناح عزل مستشفى أو في مستشفى ميداني، ويتطلب بالتالي لا معدات المختبرات، مثل أجهزة الطرد المركزي، وكتل التدفئة أو الكهرباء. كل ذلك يتطلب الأسلوب استخراج نا هي الأنابيب التي تحتوي على وحدة تخزين ثابتة مجبس أو المخازن المؤقتة للمياه والصرف الصحي وحامل مغناطيسية والماصات المتاح. قبل إعداد هذه الأنابيب التي تحتوي على مخازن يبسط البروتوكول لأن فإنه يلغي الحاجة الماصات، وبدلاً من ذلك، يتم سكب في مخازن الكوتيد مباشرة في أنابيب العينة. صاحب المغناطيسي المصيد مجبس المحتوية على الجمعية الوطنية ويتوسط تناول خطوات الغسيل بصورة سهلة. يمكن أن يكون محل صاحب المغناطيسي مع مغناطيس عادية وشريط المطاطي في حالة حامل مغناطيسي غير متوفرة؛ ومع ذلك، صاحب المغناطيسي يقلل من خطر التدريب العملي على إسقاط الأنبوب وتسرب المحتويات عند تطبيق المغناطيس والمطاطي. بسبب لزوجة عينة الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، تستخدم الماصات المتاح لإزالة المادة طافية/سائل/يغسل المخازن المؤقتة من الأنبوب. الممصات المتاح يمكن أن تكون بديلاً من صب مباشرة من المحتويات من الأنبوب إلى أنبوب جمع نفايات، ولكن يرجى أخذ العلم لا لإنشاء أي قطيرات خارج الأنبوب. إذا تم إنشاؤها قطرات، السطحية الملوثة يجب ابدأ أن تطهيرها مباشرة مع الكلورامين أو هيبوكلوريت الصوديوم (المكونات النشطة في "بليتش") لأن هذا الخليط يمكن أن يؤدي إلى تشكيل مادة السيانيد السامة. ولذلك، إذا امتد أولاً، يمسح حتى الانسكاب مع أنسجة ماصة. بعد ذلك، تنظيف السطح مع الإيثانول 70%، ومن ثم مع الكثير من الماء، وأخيراً، استخدام الكلورامين أو هيبوكلوريت الصوديوم. وهذا يشمل جميع النفايات التي كانت على اتصال بتحلل/ربط المخزن المؤقت (بما في ذلك أنبوب جمع النفايات والماصات المتاح). بدلاً من ذلك، جمع كافة النفايات في حاوية نفايات منفصلة وتطهير خارج الحاوية مع الإيثانول 70% فقط.
يتم عادة التيد ناس من مجبس أثناء خطوة تدفئة، ولكن تم إزالة هذه الخطوة تدفئة في بروتوكول استخراج نا مبسطة للقضاء على استخدام الكهرباء والمعدات. ولذلك، الناس تميل إلى التمسك مجبس، التي، لذلك، يجب أن يضاف إلى المقايسة نا المصب على الكشف لكشف نا إيجابية. مجبس ينقلون إلى هذا المزيج رد فعل المتلقين للمعلومات باستخدام قطره واحدة من ماصة المتاح 1.5 مل. هذا بالإضافة إلى ليست دقيقة كإضافة العادي استخدام ماصة نصيحة زعنفة؛ ومع ذلك، الإضافة إلى أونبريسيسي من NA/مجبس للمصباح، RT-مصباح أو qPCR أو RT qPCR ميكس رد فعل لا تحول دون رد فعل أو التأثير إشارة fluorescence في لدينا التحليل التشخيصي داخلية. ومع ذلك، قد تختلف هذه من الفحص لفحص، ونوصي بأن يتم التحقق من صحة كل اختبار NA المصب، وأن حساسية المقايسة يتم اختباره باستخدام الأسلوب استخراج نا مبسطة. طريقة استخراج نا هي نسبيا الحساسة، وعينات الدم كله يحتوي على الحمض النووي أو فيروسات الرنا منخفضة كما يمكن بسهولة استخراج 3,000 نسخ/مل والكشف عنها في الاختبارات الجزيئية المتلقين للمعلومات، مثل قبكر. الحمل الفيروسي في العينات السريرية عادة عالية جداً أثناء المرحلة الحادة من العدوى، وفيروسات الحمى النزفية، مثل أبوف والفيروسات آسا وفيروس الحمى النزفية "القرم الكونغو"، عادة ما تحتوي على أكثر من 10 نسخ/مل5 9 ،،من1011. لذلك، الفيروسات في هذه العينات يمكن بسهولة الكشف عن استخدام هذا الأسلوب استخراج نا. بيد المنظمة مبلب الفيروسات عدا7أبوف واللقاحيه، وجدري بقر ما زال الفيروس8 سيظهر.
طريقة استخراج نا مبسطة يمكن أن يؤديها في أجنحة العزل في المستشفى أو في إعدادات الحقل، وهو مثالي للتشخيص الجزيئي نقطة من الرعاية. ومع ذلك، الأسلوب لا ينطبق للاستخراج نا الفائق بسبب التعامل مع التدريب العملي على من أنبوب مفتوحة. بسهولة يمكن إذا كانت هناك حاجة إلى الاستخراج نا الفائق، تكون تنقية نا استخراج الروبوتات7باستخدام عينات الدم كله المعطل. وثمة عيب آخر هو التعامل مع الكواشف الضارة مثل تحلل/ربط المخزن المؤقت [20-30 ٪ البولي إثيلين غليكول ف-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)--فينيل خماسي البروم ثنائي الفينيل و 30-50% جوانيدينيوم ثيوسيانات (جتك)]17 ويغسل المخزن المؤقت (30-50% جوانيدينيوم أنا كلوريد)17 في أنبوب مفتوحة خارج غطاء تدفق. ويرد المخزن المؤقت تحلل/الملزمة في شكل مركزة داخل فراغ أنبوب ومع جمع الدم 1:1 (v/v)، ينخفض التركيز قبل فتح الأنبوب. فتح فراغ أنبوب والإضافة/إزالة مجبس أو المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي هو الأول الذي يجري في غضون ثوان قليلة، ومن ثم، خطر استنشاق هباء الحد الأدنى. بعد إزالة المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-الأول من الأنبوب، لا الكواشف الضارة الأخرى المستخدمة في البروتوكول.
وقد وضعت العديد من الاختبارات الجزيئية نقطة الرعاية السريعة والأجهزة منذ اندلاع أبوف عام 20133،،من612،13،،من1415،16 . ومع ذلك، العديد من هذه الاختبارات لا تزال تتطلب التعامل مع تيار تصل المعدية خزانات السلامة البيولوجية BSL-3 والمادية، والحد أدنى، معدات مختبرات، مثل الماصات، وأجهزة الطرد المركزي، وكتل التدفئة أو الكهرباء. استخدام خزانات السلامة الأحيائية من تعقيد ويطيل تشخيص سريع. المنظمة وصف الفيروس السرير بمباشرة جمع الدم في أنابيب الفيروسات المنظمة جنبا إلى جنب مع أسلوب استخراج نا مبسطة يلغي الحاجة إلى خزانات السلامة البيولوجية، والكهرباء، ومرافق المختبرات. بالإضافة إلى ذلك، لأنه يمكن تنفيذها بجوار المريض طريقة استخراج نا مبسطة وجنبا إلى جنب مع فعل مصباح في جهاز محمول متحاور يحركها البطارية، يمكن الحصول على تشخيص جزيئي سرير آمنة داخل 40 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر سوزان لوبيز راسموسن وجنسن سولفيج Kolbjørn الخاصة بالمساعدة التقنية ومعالجة العينات السريرية. هذا المشروع هو جزء من مجموعة ابولامودراد، التي تلقت تمويلاً من "مبتكرة الطب المبادرة 2 مشترك التعهد" تحت منحة اتفاق N ° 115843. هذا "التعهد المشترك" يتلقى الدعم من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث وبرنامج الابتكار وافبيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
