Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Полнометражный отдельных proviral последовательности (ЗЕРКАЛЬНО) предоставляет эффективный и высокопроизводительный метод для амплификации и последовательности Single, вблизи полнометражный (нетронутыми и дефектных) proviruses ВИЧ-1 и позволяет для определения их потенциальных возможностей Репликация компетенции. САЛЬТО преодолевает ограничения предыдущих анализов, предназначенных для последовательности латентной водохранилище ВИЧ-1.

Abstract

Assay полноразмерные отдельных Proviral виртуализации (ЗЕРКАЛЬНО) является эффективной и высок объём метод, предназначенный для усиления и последовательности сингл, вблизи полнометражный (нетронутыми и дефектных), ВИЧ-1 proviruses. ОТРАЖЕНИЕ позволяет определять генетический состав интегрированных ВИЧ-1 в популяции клеток. Путем выявления дефектов в течение ВИЧ-1 proviral последовательности, которые возникают во время обратной транскрипции, например больших внутренних исключений, пагубные стоп-кодонов/Гипермутационный, фреймшифт мутации и мутации/удалений в СНГ выступающих элементов требуется для созревания вириона сальто можно определить комплексный proviruses состоянии репликации. САЛЬТО assay может использоваться для определения ВИЧ-1 proviruses, которые не имеют эти дефекты и поэтому потенциально репликации компетентным. САЛЬТО протокол включает в себя: lysis клеток инфицированных ВИЧ-1, вложенные PCR вблизи полнометражного ВИЧ-1 proviruses (с помощью грунтовки, ориентированные на ВИЧ-1 5' и 3' LTR), Очищение дна и количественной оценки, подготовки для виртуализации нового поколения (НГС), NGS, Библиотека de novo Ассамблеи proviral Сахалинской и простой процесс ликвидации для выявления репликации компетентных proviruses. ОТРАЖЕНИЕ предоставляет преимущества над традиционными методами, предназначенных для последовательности интеграции ВИЧ-1 proviruses, таких как сингл proviral последовательности. САЛЬТО усиливает и последовательностей вблизи полнометражные proviruses включение репликации компетентности должен определяться, а также использует меньше амплификации грунтовки, предотвратить последствия несоответствия грунт. ОТРАЖЕНИЕ является полезным инструментом для понимания генетических пейзаж комплексной proviruses ВИЧ-1, особенно в рамках скрытой водохранилище, однако ее использование может распространяться на любое приложение, в котором требуется генетический состав интегрированных ВИЧ-1.

Introduction

Генетическая характеристика латентной водохранилища ВИЧ-1, который упорно лиц на долгосрочной антиретровирусной терапии (АРТ), был жизненно важное значение для понимания, что большинство комплексной proviruses являются дефектные и репликации некомпетентность1 , 2. в процессе обратной транскрипции, ошибки вводятся в комплексной proviral последовательность. Некоторые механизмы, которые генерируют дефектных proviral последовательности включают ошибкам-фермента обратной транскриптазы ВИЧ-13, шаблон, Переключение4, и/или APOBEC-индуцированной Гипермутационный5,6. Два недавних исследования обнаружил, что примерно 5% ВИЧ-1 proviruses, изолированные от физических лиц на долгосрочной искусства являются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентным и может способствовать быстрому отскок в плазме крови ВИЧ-1 при прекращении искусства 1 , 2 , 7. предыдущие исследования выявили, что компетентные репликации ВИЧ-1 proviruses сохраняются в наивной и отдыха памяти CD4+ T клетки подмножеств (включая центральные, переходных и эффекторные клетки памяти T), указывая значение ориентация этих клеток в будущем искоренения стратегии2,8,9.

Ранние идеи в распределение, динамика и поддержание латентной водохранилища ВИЧ-1 были достигнуты за счет использования методов секвенирования сингл proviral (СФМ), генетически характеризуют суб геномных областей генома ВИЧ-110 ,11,12,13. SPS-это универсальный инструмент, состоянии последовательности одного Провирус ВИЧ-1 от в пределах одной инфицированной клетки. Однако СПС не может определить компетенцию репликации proviruses, поскольку он только последовательности суб геномных регионов и промахи proviruses, которые содержат большие изъятия в рамках сайтов связывания праймера. Предыдущие исследования продемонстрировал SPS завышает размер репликации компетентных водохранилище на 13 - 17 раз через избирательно секвенирования нетронутыми суб геномных регионов2.

Для устранения ограничений SPS, Хо и др. 4 и Брунер и др. 1 разработан анализов последовательности вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Это позволило частота генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентный, proviruses ВИЧ-1 в отдельных лиц на долгосрочной искусства будут определены. Эти анализы усиливается и виртуализации (через Сэнгер секвенирования) суб геномных регионов, которые затем были собраны для получения последовательности (нетронутыми или дефектных) Провирус ВИЧ-1. Три ограничения такого подхода являются: 1) использование нескольких последовательности грунтовки увеличивает риск непреднамеренного включения дефекты в proviral последовательности, 2) грунт несоответствия могут предотвратить усиление конкретных proviruses и 3) часто Вся proviral последовательность не может быть разрешен за счет формальность этих методов.

Чтобы преодолеть ограничения существующих полнометражного анализов proviral Секвенирование ВИЧ-1, мы разработали Full -Лength яндивидуальное Pантиретровирусные Sequencing (ЗЕРКАЛЬНО) assay. ОТРАЖЕНИЕ является секвенирование нового поколения (НГС)-на основе анализа, который усиливает и последовательностей вблизи полнометражный (нетронутыми или дефектных) ВИЧ-1 proviruses высокой пропускной способности и эффективным образом. САЛЬТО обеспечивает преимущества по сравнению с предыдущим анализов, как она ограничивает количество грунтовки использовать; Таким образом это снижает вероятность грунтовка несоответствия, которые могут ограничить численность населения proviruses захватили или непреднамеренно ввести дефекты в Вирусный последовательность. ОТРАЖЕНИЕ является также менее технически сложной, чем предыдущие анализы и включает 6 основных этапов: клетки 1) вызывает лизис инфицированных ВИЧ-1, 2) усиление одного ВИЧ-1 proviruses через вложенные ПЦР на ограничение разрежения с помощью грунтовки, специфичных для высоко сохранены HIV-1 5' и 3' U5 LTR региона (рис. 1а), 3) очистки и количественная оценка усиливается продукции, 4) подготовка библиотека усиливается proviruses NGS, 5) NGS и 6) de novo Ассамблея виртуализированного proviruses для получения Сахалинской каждого Индивидуальные Провирус.

Последовательности, генерируемые сальто может пройти строгий процесс ликвидации определить те из них, которые являются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентных (рис. 1 c)2. Генетически нетронутыми proviruses отсутствие все известные дефекты, которые привести поколения Провирус репликации некомпетентность. Эти недостатки включают в себя: инверсии последовательностей, большой внутренней удалений, Гипермутационный/пагубное стоп-кодонов, frameshifts или мутации в 5' упаковка сигнала или крупных сращивания донора (MSD) сайта.

Figure 1
Рисунок 1: важнейшие шаги в assay полнометражных последовательности отдельных proviral (ЗЕРКАЛЬНО). (A) ВИЧ-1 ДНК генома с сайтов связывания праймера в 5' и 3' регионах U5 LTR используется сальто для того чтобы усилить вблизи полнометражный (дефектных и нетронутыми) ВИЧ-1 proviruses через вложенные PCR. (B) макет 96-луночных ПЦР пластины, содержащих 80 образца скважин (20 скважин для каждого разведения), 4 отрицательный контроль скважины и 1 положительный контроль хорошо. (C) процесс ликвидации, используемый для идентификации генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентный, proviruses ВИЧ-1. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональные наблюдательные советы в университете Калифорнии Сан-Франциско и Западной Сиднее местного здравоохранения района, который включает Westmead институт медицинских исследований.

1. lysis клеток, инфицированных ВИЧ-1

Примечание: Клетки могут быть изолированы от периферической крови, leukapheresis образцы, Биопсия костного или биопсия тканей. Клеточных популяций могут быть отсортированы с помощью активированного флуоресценции клеток, сортируя (FACS).

  1. Подготовить литического буфера, содержащий 10 мм трис-HCl, 0,5% Nonidet P–40, 0,5% Tween-20 и 0,3 мг/мл протеиназы K. Для ячейки Пелле 100 мкл буфера lysis за 1 х 106 клеток. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубируйте на 55 ° C для 1 часа, после чего 85 ° C в течение 15 мин Лизируйте клетки и освободить геномной ДНК для амплификации PCR.
    Примечание: Лизис клеток является достаточным для получения геномной ДНК для амплификации. Без изоляции ДНК или очистки требуется. Протокол может быть приостановлена на данный момент и геномной ДНК может храниться при температуре-20 ° C на неопределенный срок.

2. усиление одного ДНК ВИЧ-1 Proviruses через вложенные PCR

  1. Смешать реактивы для первого раунда ПЦР (PCR1) перечислены в таблице 1 (см. Таблицу материалы). Мкл 38 мастер смеси до 85 скважин (80 образцов, 4 негативный контроль, 1 положительный контроль) 96-луночных ПЦР плиты (следовать макета в Рисунок 1B). Назначьте эту пластину «PCR1».
Реагент Конечная концентрация Объем для PCR1 плиты (мкл) Объем для PCR2 плиты (мкл)
Форвард грунтовка 1 МКМ 32.3 23,8
Обратный грунтовка 1 МКМ 32.3 23,8
Буфер (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 мм) 2 мм 129,2 95.2
dNTP (10 мм) 0,2 мм 64,6 47,6
ДНК-полимераза (5 U/мкл) 0,025 U/МКЛ 16.2 11,9
Сверхчистый H2O 2632.5 1939.7

Таблица 1: Реагенты и томов для ПЦР мастер смесей.

Примечание: Праймеры для PCR1 являются:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 положение 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 положение 9662-9686)

  1. После подготовки Мастер микс, переместите плиты PCR1 чистой отведенном для добавления геномной ДНК.
    1. Серийно разбавляют геномной ДНК от 1:3 для 1:81 с трис-HCl (рН 8 5 мм), подготовка 45 мкл каждого разведения (достаточно для 20 скважин для каждого разведения). 2 мкл разбавленного геномной ДНК, для каждого образца хорошо и 2 мкл трис-HCl (5 мм, pH 8) для каждого отрицательного контроля хорошо (последуйте за макет рис. 1B). Печать все скважин PCR1 плиты, исключая положительный контроль также, используя четкие клей уплотнение (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Выше рекомендуемых разведений служат лишь начальное руководство для определения конечной точки разрежения. Разведений будет зависеть от концентрации комплексной ДНК ВИЧ-1 в пределах образцы.
  2. Перемещение в область для добавления позитивного управления. 2 мкл позитивного управления (pNL4-3 разбавляют до 105 копий/мкл) позитивного управления хорошо PCR1 пластины и уплотнения пластину. Кратко спина PCR1 пластину в PCR пластины счетчика или центрифуги (400 x g 10 s при комнатной температуре) тянуть вниз любого остаточного содержания со стороны скважины.
  3. Запуск PCR1 пластину в Термоциклер: 94 ° C на 2 мин; затем 94 ° C за 30 сек, 64 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 3 циклов; 94 ° C за 30 сек, 61 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 3 циклов; 94 ° C за 30 сек, 58 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 3 циклов; 94 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 21 циклов; Затем, 68 ° C 10 мин (всего 30 циклов). Держите на 4 ° C.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и плита PCR1 хранится при температуре 4 ° C до 2 дней.
  4. Смешайте реактивы для второго раунда ПЦР (PCR2) перечислены в таблице 1. 28 мкл до 85 скважин (80 образцов, 4 негативный контроль, 1 положительный контроль) новой 96-луночных ПЦР плиты (следовать макета в Рисунок 1B). Назначьте эту пластину «PCR2».

Примечание: Праймеры для PCR2 являются:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 положение 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 положение 9650 9676)

  1. Кратко спина PCR1 пластину в PCR пластины счетчика или центрифуги (400 x g 10 s при комнатной температуре) тянуть вниз любого остаточного содержания со стороны скважины. 80 мкл трис-HCl (5 мм, pH 8), в каждой скважине PCR1 пластины.
    1. Передавать PCR2 пластину, используя многоканальные пипетки 2 мкл PCR1 пластины. Убедитесь, что образцы передаются также хорошо (то есть, 2 мкл от хорошо A1 PCR1 пластина переносится хорошо A1 PCR2 плита). Уплотнение PCR2 пластину, используя четкие клей уплотнение (см. Таблицу материалы).
    2. Кратко спина PCR2 пластину в PCR пластины счетчика или центрифуги (400 x g 10 s при комнатной температуре) тянуть вниз любого остаточного содержания со стороны скважины. Уплотнение PCR1 пластина с термосварки фильм для длительного хранения при температуре-20 ° C (см. Таблицу материалы).
  2. Запуск PCR2 пластину в Термоциклер: 94 ° C на 2 мин; затем 94 ° C за 30 сек, 64 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 3 циклов; 94 ° C за 30 сек, 61 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 3 циклов; 94 ° C за 30 сек, 58 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 3 циклов; 94 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s, 68 ° C в течение 10 мин для 31 циклов; Затем, 68 ° C 10 мин (всего 40 циклов). Держите на 4 ° C.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и плита PCR2 хранится при температуре 4 ° C до 2 дней.
  3. Кратко спина PCR2 пластину в PCR пластины счетчика или центрифуги тянуть вниз любого остаточного содержания со стороны скважины. 60 мкл трис-HCl (5 мм, pH 8), чтобы каждый хорошо с помощью многоканальных дозаторов.
    1. Запуск 15 мкл каждой скважины на 2 x 48-ну сборного 1% гелей агарозы, содержащие бромид ethidium (0.1\u20120.3 мкг/мл, смотрите Таблицу материалы). Используйте лестницы с диапазоном до 10 КБ (см. Таблицу материалы). Визуализация для выявления скважин, содержащий усиливается продукта и их приблизительные размеры. Сохраните изображение геля.
      Примечание: Убедитесь, что положительный контроль также содержит усиливается продукта. Если отрицательный контроль скважины содержат усиливается продукта, рассмотреть возможность загрязнения и игнорировать пластины.
  4. Определите разрежения, на котором не более 30% скважин являются позитивными для усиленные продукта.
    Примечание: Это разрежения конечной точки, в которой большинство (80 процентов) скважин содержат усиливается продукт от одного шаблона. Это раствора следует подготовить и используется в последующих PCRs для получения дополнительной proviral ампликонов. Запись приблизительный размер каждого усиливается продукта.

3. ДНК очищения и количественная оценка

  1. Кратко спина PCR2 пластину в PCR пластины счетчика или центрифуги тянуть вниз любого остаточного содержания со стороны скважины. Передачи 40 µL из скважин, содержащий усиливается продукта (на или ниже конечного разрежения) к новой плите 96-луночных midi (с хорошо объемом 0,8 мл, см. Таблицу материалы).
    Примечание: Запишите исходные и новые хорошо положение каждого усиливается продукта в таблицу как запись каждого усиливается продукта для виртуализации.
  2. Очистить амплифицированного ДНК продуктов с использованием магнитной бусины на основе ПЦР очистки комплект (см. таблицу материалы) для удаления грунтовки, нуклеотиды, ферменты, масла и соли. Перед началом, довести магнитные шарики до комнатной температуры и готовить свежие 80% этанола. Используйте новые наконечники при необходимости избежать перекрестного загрязнения образцов ДНК.
    1. Вихревые магнитные бусы чтобы убедиться, что они тщательно высокомобильна. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте 40 мкл бусины 40 мкл усиливается продукта в пластину 0,8 мл 96-луночных midi. Аккуратно Пипетка вверх и вниз по 10 раз перемешать. Кроме того mix решение запаечная пластина, затем встряхивания на шейкере Гонав при 1800 об/мин на 2 мин инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    2. Место пластину на магнитные стенд (см. Таблицу материалы) для 2 мин снимите и выбросьте супернатант.
    3. Вымойте бусы, добавив 200 мкл 80% этанола для каждой скважины с пластиной на стенде. Инкубации при комнатной температуре за 30 с. удалить и удалить супернатант. Повторите один раз. С помощью многоканальных дозаторов с тонкой советы, удалите любые излишки этанола после второй мыть. С плитой на стенде позволяют бусины в воздух сухой за 15 мин.
    4. Снять пластину от стенда. 30 мкл буфера (см. Таблицу материалы) для каждой скважины. Аккуратно Пипетка вверх и вниз по 10 раз перемешать. Кроме того mix решение запаечная пластина, затем встряхивания на шейкере Гонав при 1800 об/мин на 2 мин инкубировать при комнатной температуре на 2 мин.
    5. Поместите пластину на магнитного стенд на 2 мин, с использованием многоканальные пипетки, передачи 25 мкл супернатант (очищенная ДНК) к новой плите ПЦР 96-луночных. Убедитесь, что образцы передаются для скважины (т.е. супернатант хорошо A1 в 0,8 мл плиту передается хорошо A1 новой 96-луночных плиты).
      Примечание: 5 uL eluted образца оставил не передачу остаточных очистка бусин.
  3. Определять и записывать приблизительная концентрация каждого амплифицированного ДНК продукта после очистки, используя спектрофотометр (поглощение на длине волны 260 Нм).
    Примечание: Измерение приблизительная концентрация каждого усиливается продукта необходима на данном этапе для обеспечения не образцы будут потеряны во время очистки шагов и что приблизительная концентрация находится в пределах диапазона калибровочной кривой, используемых в следующий этап ( 0,001 – 1 нг/мкл ДНК в 100 мкл тома). Протокол может быть приостановлена здесь и уборка образцы можно хранить при температуре-20 ° C на срок до 6 месяцев.
  4. Количественную оценку концентрации ДНК каждого очищенного продукта с помощью количественной dsDNA комплекта (см. таблицу материалы).
    Примечание: Это включает использование стандартной кривой для определения концентрации dsDNA в образце. Комплект включает буфер (10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, pH 7.5), стандарт dsDNA lamda и флуоресцентные краски. Держите все реагенты на льду. Обложка трубка, содержащая краска с фольгой, чтобы избежать воздействия на свет. Измерение концентрации каждого усиливается продукта в трех экземплярах.
    1. Разбавить буфер 1 x в стерильных DNase бесплатно H2O. Добавить 99 µL из буфера на соответствующее количество пустых скважин (3 раза количество усиливается продуктов, чтобы быть измерены, см. таблицу 2 для примера макета) плиты культуры ткани с плоским дном. Добавьте 100 мкл буфера 3 лунками.
    2. Для каждого усиливается продукта измеряется, добавить 1 мкл очищенная ДНК (от шага 3.2.5) в трех экземплярах каждый хорошо содержащие буфер (см. таблицу 2 для примера макета).
    3. Для подготовки стандартов, разбавить lamda dsDNA 10 раз от 2 нг/мкл до 0,002 нг / мкл. Добавить 100 мкл каждого dsDNA стандартные 3 скважины.
      Примечание: После шаг 3.4.4, конечная концентрация стандартов будет варьироваться от 1 до 0,001 нг/мкл
    4. Разбавьте 1: 200 Люминесцентную краску с буфером. Быстро добавьте 100 мкл каждый хорошо содержит образцы, бланки и стандартов. Смешайте вверх и вниз, с пипеткой. Крышка с фольгой, чтобы избежать контакта с светом.
    5. Читать флуоресценции выбросов на Считыватель микропланшетов (возбуждения на 480 Нм, выбросы на 520 Нм). Рекордные результаты в таблицу.
    6. Определите концентрацию dsDNA каждого образца с помощью измерений флуоресценции Записанная. Вычтите флуоресценции, измеряется в пустой скважин от образцов и стандартов. Определите средний флуоресценции для каждого образца и стандарт от triplicates. Нарисуйте калибровочной кривой, основанные на измерениях флуоресценции стандартов. Определите концентрацию образцы относительно стандартов.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Стандарт (1 нг/мл) Стандарт (0,1 нг/мл) Стандарт (0.01 нг/мл) Стандарт (0,001 нг/мл) Пустой
100 мл 100 мл 100 мл 100 мл 100 мл буфера
B Стандарт (1 нг/мл) Стандарт (0,1 нг/мл) Стандарт (0.01 нг/мл) Стандарт (0,001 нг/мл) Пустой
100 мл 100 мл 100 мл 100 мл 100 мл буфера
C Стандарт (1 нг/мл) Стандарт (0,1 нг/мл) Стандарт (0.01 нг/мл) Стандарт (0,001 нг/мл) Пустой
100 мл 100 мл 100 мл 100 мл 100 мл буфера
D Пример 1: Пример 2: Пример 3: Пример 4: Пример 5: Пример 6: Пример 7: Пример 8: Пример 9: Пример 10: Пример 11: Пример 12:
1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера
E Пример 1: Пример 2: Пример 3: Пример 4: Пример 5: Пример 6: Пример 7: Пример 8: Пример 9: Пример 10: Пример 11: Пример 12:
1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера
F Пример 1: Пример 2: Пример 3: Пример 4: Пример 5: Пример 6: Пример 7: Пример 8: Пример 9: Пример 10: Пример 11: Пример 12:
1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера 1 мл ДНК + 99 мл буфера
G
H

Таблица 2: Пример макет 96-луночных пластины для количественного определения dsDNA.

  1. Развести каждого очищенного продукта (полученный на шаге 3.2.5) с H2O 0.2 нг/мкл.

4. последовательность библиотеки подготовка

  1. Усиливается и очищенный proviral ДНК подготовиться NGS, с помощью подготовки библиотеки ДНК NGS комплекта (см. Таблицу материалы). Следуйте инструкциям производителя для всех tagmentation, амплификации PCR и очистке шаги [за исключением того, что реакция томов, включая ввода ДНК (из шага 3.5) может вдвое расширить использование библиотеки Подготовка реагентов].
  2. Нормализовать библиотек вручную с помощью ПЦР основе количественной оценки NGS библиотеки комплекта (см. Таблицу материалы) для определения индивидуальной концентрации Провирус. Объединить отдельные Провирус библиотек в эквимолярных количествах до конечной концентрации 4 Нм, или как указано поставщиком службы виртуализации.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и Объединенные библиотеки хранятся при температуре-20 ° C.
  3. Количественного определения окончательного объединения библиотеки, используя тот же комплект количественной оценки dsDNA, используемые на шаге 3.4. Следуйте инструкциям производителя. Определить средний фрагмент длины, запустив 1 мкл пуле библиотеки на систему автоматизированной электрофорез с помощью соответствующего комплекта (см. Таблицу материалов). Для определения Молярность пуле библиотеки используйте концентрации и средняя фрагмент длины.
  4. Объединить 5 мкл пуле библиотеки с 5 мкл 0,2 N NaOH чтобы денатурировать библиотеки. 5 мкл 200 мм трис-HCl для нейтрализации. Разбавьте окончательный библиотека для 12: 5 вечера с охлажденной гибридизации буфера (доступно с ДНК библиотеки подготовка комплекта) непосредственно перед последовательности.
  5. Выполнить 2 x 150 нуклеотидов (nt) в паре конец последовательности на соответствующей платформе NGS (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Когда 96 proviral библиотеки, индексируются в перспективе, это дает около 20 миллионов в паре конец читает за запуск или 200.000 читает на отдельных Провирус библиотека для анализа после снятия мультиплексирования. Объект последовательности обычно выполняются шаги 4.4 и 4.5.

5. Ассамблея De Novo виртуализированного ВИЧ-1 Proviruses

Примечание: Для получения генетических последовательность каждого усиливается Провирус, Сахалинской являются de novo собран из парных конец читает. Многие платформы (например, CLC Genomics Workbench14), позволяют Дизайн пользовательских рабочих процессов для Ассамблеи de novo . Другим открытым исходным кодом, как FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17и флэш-18 также может быть использован для обработки операций чтения, а также инструменты, такие как Bowtie219 и20 пики для чтения карт и de novo Ассамблеи. Шаги для de novo Ассамблеи ВИЧ-1 Сахалинской с использованием определенной коммерческой платформы (см. Таблицу материалов), излагаются ниже (Рисунок 2). По запросу предоставляется файл настраиваемого рабочего процесса.

  1. Импортировать последовательности и проверить качество: импорт парной последовательности считывает (в формате fastq.gz) в программное обеспечение, которое затем будет сочетаться как единый комплекс парных читает. Создать последовательность КК доклад и рассмотреть качество ваших данных.
  2. Контроль качества
    1. Выполните чтение обрезки сообщению КК. Удалите адаптер последовательности и неоднозначные нуклеотидов. Трим пятнадцать 5' и два 3' терминала нуклеотидов. Отменить читает менее 50 нуклеотидов в длину. Используйте ограничение качества 0,001, соответствующий балл phred КК 30.
  3. Слияние совпадающих пар
    1. Образуют единый расширенный чтений путем слияния парных вперед и обратить вспять читает с перекрывающихся областей.
  4. De novo Ассамблея
    1. Использовать родной CLC геномики de novo ассемблер слово (или k-mer) размером 30 nt и максимальный размер пузырька 65 nt собирать случайные подвыборки 10000 non перекроя парных читает. Ожидаемый охват для de novo собрал contig это ~ 200 x для последовательности ~ 9 КБ.
      Примечание: Этот подвыборка может уменьшить вычислительную нагрузку, таким образом, что большинство стандартных настольных компьютеров могут обрабатывать Ассамблеи и анализа и с учетом clonality каждого Провирус (одна библиотека является одной Провирус), это не ограничивать разнообразие.
  5. Повторное сопоставление все чтения Сахалинской
    1. Чтобы получить последовательность консенсуса Заключительный большинства каждого Провирус, карта полное чтение, равным contig de novo собрал. Принимать только Сахалинской с минимальным средний охват 1000 x и убедитесь, что длина окончательный contig соответствует размер группы на оригинального геля агарозы (шаг 2.8.1). Сохраните последовательность консенсуса Заключительный большинства как файл .fasta.
      Примечание: Большинство Сахалинской может быть собран с использованием выше шаги. Однако в некоторых случаях для одного Провирус, собраны несколько Сахалинской с аналогичные покрытия. В этих обстоятельствах, Сахалинской выравниваются вблизи полнометражный (~ 9 КБ) последовательность консенсуса из того же участника и вручную собраны в единый contig. Все операции чтения, затем сопоставляются вручную собрал contig и окончательного консенсуса принял, если читать освещение даже на Ассамблее и не одного присутствуют нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) > 40%.
  6. Более дальнеишая проверка качества
    1. Для обеспечения каждого contig представляет один Провирус и не из-за усиления нескольких proviruses в пределах одной скважины, экран читать освещение и вариант вызова окончательный contig.
    2. Несколько proviral шаблоны во время ПЦР часто идентифицируются по весьма неравномерным чтения освещение (из-за совместного усиления proviruses разных размеров) когда сопоставления полнометражного консенсус же участник, или наличием полиморфизмов с Частота > 40% (см. Представитель результаты, рис. 4). Игнорировать смешанное население в последующие анализы.
  7. Выравнивание
    1. Импорт окончательного консенсуса каждой proviral последовательности в последовательности просмотра программного обеспечения таких как молекулярный анализ эволюционной генетики (мега) 721. Выравнивание каждой последовательности вручную, чтобы ссылка последовательности HXB2. Трим 5' и 3' заканчивается позиции 666-9650 HXB2 для удаления последовательностей праймера.
    2. Экспортируйте список последовательности в формате fasta и затем выровнять с помощью MAFFT версии 722, с ручной правкой, где это уместно получить окончательное выравнивание.
      Примечание: Если любой последовательности не выровнять, первый обратный дополняют последовательности. Если последовательность по-прежнему не выровнять выполняют поиск взрыв чтобы убедиться, что последовательность является ВИЧ-1. Это позволяет усилить шаблоны ВИЧ-1, и они могут быть определены на данном этапе. Если последовательности являются ВИЧ-1, но не выровнять, считают наличие инверсий (см. шаг 6.1).

6. определение потенциальных компетентности репликации ВИЧ-1 Proviral последовательностей

Примечание: Для определения последовательности генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентных, proviruses ВИЧ-1, который является строгий процесс ликвидации за (рис. 1 c). Proviral последовательности не хватает инверсий, большой внутренней удалений, пагубные остановить кодонов / Гипермутационный, фреймшифт мутации, и/или дефектов MSD сайта или упаковки сигнала считаются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентным.

  1. Инверсии
    1. На этапе согласования определите инверсий. Инверсий являются регионами, где последовательность не выровнять к ссылке на HXB2 если региона обратить вспять дополняет.
      Примечание: В зависимости от данных, последовательностей, содержащих инверсий может потребоваться исключить из дальнейшего анализа.
  2. Большие внутренние удалений
    1. Определить Сахалинской с большой внутренней удаления (> 600 bp) в стадии согласования. Если исключить сидит в nef, последовательность может быть определена как неисправный.
      Примечание: Любые последовательности с внутренней удаления < 600 bp будет определяться гена резец (шаг 6.3.1) как с неполным геном последовательности.
  3. Пагубное стоп-кодонов, фреймшифт мутации и удаления
    1. Проверить все Сахалинской длины > 8400 нуклеотидов на наличие вредных стоп-кодонов, frameshifts и неполным геном последовательности, используя Лос-Аламосской национальной лаборатории ВИЧ последовательности базы данных ген резак инструмент23.
      Примечание: Ген режущий инструмент делится на гены, кляп, ГСМ, vif, vpr, ТАТ, rev, ВПУ, env и nefproviral последовательность и переводит их в аминокислоты. Джин резец затем экраны для присутствия стоп-кодонов и фреймшифт мутации (из-за вставки или удаления). Сахалинской, содержащие стоп-кодонов или frameshifts в любой ген, исключая nef24, классифицируются как неисправный. Джин резак также идентифицирует неполным геном последовательности и любой proviruses с удалением < 600 ВР в гене помимо nef может быть реклассифицирована как дефектной из-за большого внутреннего исключения.
  4. Гипермутационный
    1. Создание консенсуса оставшиеся полнометражные proviral последовательностей, используя Лос-Аламосской национальной лаборатории ВИЧ последовательности базы данных консенсуса чайник инструмент (простой консенсуса чайник)25. Добавьте последовательность консенсуса в верхней части выравнивания, содержащие только оставшиеся полнометражные proviral последовательности. Используя это выравнивание и Лос-Аламосской национальной лаборатории ВИЧ последовательности базы данных Hypermut инструмент26 для идентификации APOBEC-индуцированной Гипермутационный G-A в остальных полнометражные proviral последовательности.
  5. Дефекты в MSD и упаковки сигнала
    1. Осмотрите каждый из оставшихся Сахалинской для дефектов в MSD и упаковка сигнала (HXB2 область 670-810), делающие дефектных proviral последовательности4. Ищите Точечная мутация в узле MSD (последовательность GT, HXB2 744-745) или любое удаление в четырех выноса циклов упаковки сигнала (SL1 (HXB2 691-734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779) и SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

САЛЬТО усиливает и последовательности сингл, вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Протокол включает в себя 6 шагов, чтобы получить вблизи полнометражные proviral последовательности. Эти шаги включают в себя: lysis инфицированных клеток, вложенные ПЦР полнометражный (нетронутыми и дефектных) ВИЧ-1 proviruses, Очищение дна и количественной оценки, секвенирование библиотека подготовки, NGS, и de novo Ассамблеи виртуализированных proviruses. Конце каждого шага можно считать контрольно-пропускной пункт, в котором можно оценить качество продукта (например усиленные ДНК, очищенная ДНК, Библиотека последовательности или последовательности) до следующего шага. Обзор оценки выполняется в конце каждого этапа и ожидаемых результатов приводится ниже.

После вложенных PCR усиленные Продукты запускаются на геле агарозы 1% (рис. 3). Первоначальное качество PCR может определяться инспекции негативные и позитивные элементы. Отрицательный контроль скважины, содержащие усиливается продукт указывают на загрязнение и положительный контроль скважин отсутствует усиливается продукта указывают недостаточный амплификации. Далее Уэллс, содержащие усиливается продукта выбраны для последовательности. Чтобы избежать скважин, содержащие смеси несколько усиленный proviruses, только скважин, содержащие усиливается в конечной точке растворения считаются для виртуализации. Согласно распределения Пуассона концевой разрежения встречается при 30% скважин являются позитивными для усиленные продукта. На этом разрежения, есть 80% шанс эти скважины содержат один Провирус усиливается. Кроме того скважин, содержащий несколько усиленный proviruses разной длины могут быть визуализированы на данном этапе, как несколько полос будет выглядеть на геле. Эти скважины не следует выбирать для виртуализации (рис. 3).

После очистки усиливается proviruses, отобранных для виртуализации количественная оценка гарантирует, что не proviral ДНК теряется на этапе очистки. Если концентрация ДНК усиливается Провирус < 0.2 нг/мкл, оставшиеся образца в PCR2, пластины могут быть очищены. Аналогичный КПП происходит после подготовки Библиотека, в которой каждой отдельной библиотеки количественно. Это гарантирует, что отдельные proviruses были надлежащим образом раздроблена, тегами и усиливается до последовательности. Отдельные proviral библиотеки объединяются в эквимолярных количествах к концентрации окончательный библиотека 4 Нм (или как указано поставщиком последовательности). При слишком низкой концентрации отдельных proviral библиотеки, он может быть исключен из последовательности библиотека бассейн, или отдельные библиотеки подготовленных снова. Окончательная проверка концентрации пуле библиотеки выполняется до последовательности наряду с подтверждающие средняя фрагмент длин.

Контроль качества шаги до стадии Ассамблеи de novo обеспечивает качество чтения, используемый для сборки окончательной proviral contig. Эти шаги включают в себя: Удаление адаптер последовательностей, обрезки 5' и 3' нуклеотидов, ограничение по качеству и игнорируя короткие читает. КГО геномики Workbench может обеспечить контроль качества докладов, которые могут использоваться для оценки первоначального качества читает и руководство обрезки параметры, а затем после определить если обрезки было достаточно для удаления областей низкого качества перед. Кроме того, для Ассамблеи de novo , можно оценить качество собранных Сахалинской на достаточную глубину (> 1000 X) и ровность покрытия (рис. 4A). Смешанным населением также могут быть определены на данном этапе. Смеси нескольких полнометражных (~ 9 kb) proviruses определяются через присутствие нескольких SNPs с частотой более чем на 40%, тогда как смеси коротких (содержащие большого внутреннего исключения) и полнометражные proviruses могут быть идентифицированы по неровной Читайте после сопоставления для полнометражных ссылку же участник (Рисунок 4B) освещение.

В зависимости от приложения окончательное выравнивание могут быть визуализированы с помощью таких инструментов, как ggtree доступны в пакете «R: A язык и среду для статистических вычислений»27. В недавнем исследовании, сальто использовался до последовательности ВИЧ-1 proviruses от наивного, Центральной, переходный и эффекторных памяти CD4+ T клетки изолированы от физических лиц на долгосрочной искусства, с тем чтобы определить если ячейке подмножеств показали выше пропорции генетически нетронутыми и потенциально компетентным репликации ВИЧ-12. Здесь визуальное представление последовательности, изолированный от одного из участников этого исследования (участник 2026) представлен (рис. 5). В этот участник, большинство (97%) последовательностей были дефектных, с нетронутым последовательностей в эффекторных и временной памяти CD4+ T клетки. Этот инструмент визуализации является полезным для показа число последовательностей с большой внутренней удалений и их положение в геноме. Он может Аннотированная далее указать последовательности с пагубным стоп-кодонов, фреймшифт мутации и удаления/мутации в MSD сайта и/или упаковки сигнала.

Одно приложение сальто assay является выявление генетически нетронутыми и потенциально компетентным репликации ВИЧ-1 proviruses. В недавнем исследовании 531 последовательностей, изолированных от CD4+ T клеток из 6 участников на долгосрочный искусства, 26 (5%) генетически нетронутыми proviruses ВИЧ-1 были определены2. Оставшиеся дефектных proviruses относятся с инверсии последовательности (6%), большой внутренней удаления (68%), пагубные стоп-кодонов/Гипермутационный (9%), фреймшифт мутации (1%) и дефекты в упаковке сигнала и/или мутации в узле MSD (11%) .

Figure 2
Рисунок 2: Обзор рабочего процесса для de novo Ассамблеи ВИЧ-1 proviruses. Основные шаги рабочего процесса включают: 1) последовательности читать контроля качества, 2) слияние совпадающих пар, 3) Ассамблея de novo и 4) преобразование и консенсуса были красного цвета, синий, зеленый и оранжевый, соответственно. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: пример геля агарозы ПЦР усиленный proviruses ВИЧ-1. Уэллс, 1, 2, 3, 6, 9 и 10 содержат усиливается proviruses ВИЧ-1. Хорошо 10 содержит Провирус с большой внутренней удаления, хорошо 2 содержит совместного усиления двух ВИЧ-1 proviruses разной длины (смесь), а также 12 содержит положительный контроль. Обратите внимание, что процент скважин, содержащих усиливается продукт – 60%, что выше процент требуется изолировать одно шаблоны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: пример вывода чтения карт. (A) пример, демонстрирующий даже освещение за счет усиления одного полнометражного Провирус ВИЧ-1. После Ассамблеи de novo все читает сопоставляются собрал contig для создания консенсуса в последовательности. Программная платформа позволяет сопоставленных читает инспекции достаточных и даже освещения. (B) пример, демонстрирующий совместное усиления двух ВИЧ-1 proviruses разной длины (смесь). Чтобы определить смеси, читает сопоставлены последовательность ссылок полнометражный (~ 9 kb) от же участник и читать сопоставления инспекции. Наличие неравномерный охват указывает смесь. Эта цифра воспроизводится с разрешения Qiagen14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Пример визуализации ВИЧ-1 proviral последовательностей, изолированных от CD4+ T клетки подмножеств от индивидуума на долгосрочный искусства. Proviral последовательности отдельных ВИЧ-1 представлены горизонтальными линиями. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Assay сальто является эффективным и высок объём метод для усиления и секвенирования сингл, вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Было выявлено несколько факторов и важные шаги в протоколе, которые влияют на количество и качество полученной последовательности. Во-первых количество клеток и частота ВИЧ-1 инфекции популяции клеток влияет на количество proviruses усиливается. Например, в предыдущей публикации, примерно половина столько последовательностей были получены от такое же количество наивно CD4+ T по сравнению с эффекторных памяти CD4 клеток+ T клетки. Это потому, что наивно клетки, как правило, имеют более низкой частоте инфекции, чем память эффекторные клетки2. Во-вторых лизис клеток является предпочтительным для методов на основе столбца извлечения для получения геномной ДНК, как нет никакого риска потерять ДНК в процессе извлечения. И наконец как и в случае с любой на основе ПЦР анализа, предотвращая загрязнение имеет решающее значение. Раздельный чистых районов должны быть назначены для подготовки мастер смеси, обработка геномной ДНК, добавив позитивные элементы, Очищение дна и количественная оценка и подготовка библиотеки. Это особенно важно для анализов одной копии таких представленных здесь.

Осуществление анализа сальто следует сначала включают запуск положительный контроль таких плазмид pNL4-3, вместо того, чтобы участник образцы. Это позволит для любых неполадок до их использования позитивных клеток ВИЧ-1, как полученные последовательности можно сравнить с последовательности доступны ссылки для этих плазмидов. При использовании положительных клеток ВИЧ-1, важно рассматривать ВИЧ 1 подтип (грунты, предназначенные для сальто являются специфическими для подтипа B) и частота инфицирования популяции клеток, если мало не proviruses усиливаются. Грунтовка последовательности может быть изменен/переработаны, чтобы соответствовать другие подтипы. Кроме того также содержащий положительный контроль должны быть включены в каждую ПЦР выполнена.

САЛЬТО преодолеть ограничения предыдущих анализов виртуализации, включая SPS. Путем усиления и последовательности вблизи полнометражного ВИЧ-1 proviruses сальто можно определить потенциальных профессиональных качеств репликации ВИЧ-1 proviruses. Это не было возможно с помощью SPS, который виртуализировать только суб геномных регионов и поэтому выбрали для последовательностей с сайтов связывания primer нетронутыми. Кроме того сальто преодолевает ограничения, связанные с использованием нескольких амплификации и секвенирования грунтовки, как был нанят полнометражных последовательности предыдущих анализов1,4. Через два раунда ПЦР, ориентация в регионах ВИЧ-1 л, в сочетании с NGS сальто уменьшает количество и сложность требует грунтовки. Таким образом, сальто менее подвержен последствия несоответствия грунт, а именно ошибочной идентификации дефектных proviruses и неспособность некоторых proviruses в пределах населения усиливаются. САЛЬТО протокол является также более эффективным и позволяет более высокую пропускную способность по виртуализации чем предыдущие методы.

Очевидно сальто обеспечивает преимущества по сравнению с существующими методами, которые определяют генетический состав ВИЧ-1 proviruses. Однако важно признать ограничения сальто. Во-первых пробирного сальто не разработан как инструмент для измерения размеров скрытых водохранилища ВИЧ-1, как анализы, чтобы определить, является ли сальто усиливает каждый Провирус ВИЧ-1 в популяции клеток еще не завершены. САЛЬТО вместо полезен для относительного сравнения состава водохранилища между различных клеточных популяций2. Во-вторых компетенцию репликации нетронутыми ВИЧ-1 proviruses не может быть определен с точностью без в vivo исследований, таких как выполняемых Хо et al. 4. в-третьих, сальто не предназначен для определения сайта интеграции ВИЧ-1 proviruses.

Незначительные изменения в протоколе сальто может увеличить его применения. Например изменения в грунт, что последовательности можно разрешить различные и несколько подтипов ВИЧ-1 усиливается и виртуализации. Секвенирование вирионов плазмы ВИЧ-1 возможна путем добавления синтеза cDNA до вложенных PCR. Будущего использования методов секвенирования одной молекулы позволит устранить потребность в de novo Ассамблеи.

Генетическое секвенирование комплексной ВИЧ-1 proviruses возросло наше понимание скрытых водохранилища ВИЧ-1. ОТРАЖЕНИЕ является важным инструментом для будущих исследований, изучение состава и распределения латентной водохранилища. Однако применение сальто может выходить за рамки водохранилище. Будущие исследования может использовать отражение для определения конкретных целей для технологии ТРИФОСФАТЫ-Cas, или помочь в идентификации кодирования и некодирующих регионов, которые делают вирус быстрее реагировать на задержку, вспять агентов. Вирусная Рекомбинация может пониматься лучше, глядя на стыке сайты крупных внутренних исключений.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Делани предприятие исследования СПИДа (DARE) чтобы найти лекарство (1U19AI096109 и 1UM1AI126611-01); amfAR исследовательский консорциум на искоренение ВИЧ (ARCHE) совместный исследовательский грант от фонда для исследований в области СПИДа (АМФАР 108074-50-RGRL); Австралийский центр по ВИЧ и гепатит вирусологии исследований (ACH2); UCSF-ГИВИ центр исследований СПИДа (P30 AI027763); и австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (AAP1061681). Мы хотели бы поблагодарить д-р Joey лай, менеджер фонда геномики в Westmead институте медицинских исследований для его подготовки в библиотеке подготовки и использования его объекта и Ramaciotti Центр геномики (Университет Нового Южного Уэльса, Сидней, Австралия) для проведения последовательности. Мы с благодарностью признаем участников, кто пожертвовал образцы для этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

Генетика выпуск 140 следующего поколения виртуализации ВИЧ-1 ВИЧ proviruses сингл proviral последовательность ДНК ВИЧ задержка репликации компетентности антиретровирусной терапии водохранилище ВИЧ комплексных ВИЧ
Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter