Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Abstract

Full-Length bireysel Proviral sıralama (döndürür) tahlil ve tam uzunlukta (sağlam ve arızalı), HIV-1 proviruses tek sıra yükseltmek için tasarlanmış verimli ve yüksek işlem hacmi bir yöntemdir. DÖNDÜRÜR sağlar entegre HIV-1 bir hücre nüfus içinde genetik kompozisyon belirlenmesi. Büyük iç silme gibi ters Transkripsiyon sırasında ortaya çıkan HIV-1 proviral dizileri içinde kusurları tespit yoluyla zararlı stop kodon/Hipermutasyon, frameshift mutasyonlar ve mutasyonlar/silme öğeleri hareket CIS içinde gerekli virion olgunlaşma için FLIPS entegre proviruses çoğaltılması aciz tanımlayabilirsiniz. FLIPS tahlil bu kusurları eksikliği ve bu nedenle potansiyel olarak çoğaltma yetkili olan HIV-1 proviruses tanımlamak için yararlı olabilir. FLIPS Protokolü içerir: lizis HIV-1 enfekte hücre, PCR, tam uzunlukta HIV-1 proviruses iç içe (HIV-1 5'e hedef primerler kullanılarak ' 3'soldan sağa), DNA arıtma ve miktar, Kütüphane hazırlık için yeni nesil sekanslama (NGS), NGS, proviral contigs ve basit bir işlem çoğaltma yetkili proviruses tanımlamak için eleme de novo kurul. DÖNDÜRÜR sağlar sıra için tasarlanmış geleneksel yöntemleri üzerinde avantajları tek proviral sıralama gibi HIV-1 proviruses entegre. DÖNDÜRÜR güçlendirir ve kararlı olmak çoğaltma yetkinlik etkinleştirme tam uzunlukta proviruses dizileri ve aynı zamanda daha az sayıda amplifikasyon astar astar uyuşmazlıkları sonuçlarının önlenmesi, kullanır. FLIPS özellikle gizli rezervuar içinde entegre HIV-1 proviruses genetik peyzaj anlamak için yararlı bir araçtır, ancak, onun kullanımı herhangi bir uygulama için tümleşik HIV-1'in genetik kompozisyon gereklidir genişletebilirsiniz.

Introduction

Uzun vadeli antiretroviral tedavi (ART) bireylerde devam ederse, gizli HIV-1 depo, genetik karakterizasyonu entegre proviruses çoğunluğu1 arızalı ve çoğaltma-beceriksiz olduğunu anlamak için çok önemli olmuştur , 2. Ters transkripsiyon işlemi sırasında hatalar entegre proviral sıra tanıtılmaktadır. Arızalı proviral dizileri oluşturmak bazı mekanizmalar hataya dahil HIV-1 ters transkriptaz enzimi3,4ve/veya APOBEC kaynaklı Hipermutasyon5,6anahtarlama şablonu. İki son yıllarda yapılan çalışmalarda bulduk izole bireyler üzerinde uzun vadeli ART HIV-1 proviruses yaklaşık % 5'i genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili ve HIV-1 plazma düzeyleri sanat kesilmesi üzerine hızlı rebound için katkıda bulunabilir 1 , 2 , 7. önceki çalışmalar çoğaltma yetkili HIV-1 proviruses saf ve bellek CD4 dinlenme inat belirledik+ T hücre önemini gösteren alt kümeleri, (orta, geçiş ve efektör bellek T hücreleri de dahil olmak üzere) Bunlar hedefleme gelecekte giderme stratejileri2,8,9hücreleri.

Dağıtım, dinamikleri ve gizli HIV-1 rezervuar bakım erken anlayışlar genetik olarak HIV-1 genom10 alt genomik bölgeleri karakterize tek proviral sıralama (SPS) yöntemleri kullanımı elde edildi ,11,12,13. SPS bir tek HIV-1 provirus üzerinden tek bir virüslü hücrede bulunan sıra için çok yönlü bir araçtır. Ancak, SPS sadece astar bağlayıcı siteleri içinde büyük silme işlemlerini içeren alt genomik bölgeler ve özlüyor proviruses dizileri beri proviruses, çoğaltma yetkinlik belirleyemiyor. Bir önceki çalışma SPS tarafından çoğaltma yetkili rezervuar boyutunu overestimates göstermiştir 13 - için 17 - kat seçici sağlam alt genomik bölgeler2sıralama yoluyla.

SPS, Ho ve ark. sınırlamaları gidermek için 4 ve Bruner vd. 1 deneyleri sıra tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki geliştirdi. Bu genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma-yetkili, HIV-1 proviruses sıklığını tespit edilecek uzun vadeli sanat bireylerde izin verdi. Bu deneyleri ve güçlendirilmiş sıralı (Sanger üzerinden sıralama) sonra (olduğu gibi veya serisini arızalı) HIV-1 provirus elde etmek için toplandı alt genomik bölgeler. Bu yaklaşımın üç sınırlamalar şunlardır: 1) birden fazla sıralama astar kullanımı istemeden kusurları proviral dizisi tanıtımı riskini artırır, 2) astar uyuşmazlıkları amplifikasyon engelleyebilir belirli proviruses ve 3) genellikle Tüm proviral sıra bu yöntemler teknik nedeniyle çözümlenemiyor.

Varolan tam uzunlukta HIV-1 proviral sıralama deneyleri sınırlamalarını aşmak için Full -Lmesafe benkaynaklandığıdır Proviral Sequencing (döndürür) tahlil geliştirilmiştir. DÖNDÜRÜR bir nesil sıralama (NGS) olduğunu-hangi güçlendirir ve yüksek üretilen iş ve verimli bir şekilde tam uzunlukta (sağlam ya da bozuk) HIV-1 proviruses serileri temel alınarak tahlil. FLIPS kullanılan astar sayısını sınırlar gibi önceki deneyleri, avantajlar sağlar; Bu nedenle, proviruses nüfusu sınırlayabilir uyuşmazlıkları yakalanan ya da istemeden kusurları bir viral dizisi tanıştırmak astar olasılığını azaltır. DÖNDÜRÜR aynı zamanda daha az teknik olarak önceki deneyleri meydan okuyor ve 6 ana adımlardan oluşur: 1) lizis HIV-1 enfekte hücreleri, 2) tek HIV-1 proviruses yolu ile iç içe geçmiş PCR seyreltme için son derece korunmuş astar özel kullanarak sınırlama gerçekleştirilen amplifikasyon HIV-1 5' ve 3' U5 LTR bölge (Şekil 1A), 3) arıtma ve miktar güçlendirilmiş ürünler, 4) güçlendirilmiş proviruses Kütüphane hazırlanması için NGS, 5) NGS ve 6) contigs her elde etmek için sıralı proviruses Meclisi de novo tek tek provirus.

FLIPS tarafından oluşturulan dizileri o hangi genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili (Şekil 1 c)2tanımlamak için eleme sıkı bir süreç tabi olabilir. Genetik olarak olduğu gibi proviruses da bir çoğaltma-beceriksiz provirus üretimi neden tüm bilinen hataları eksikliği. Bu kusurlar dahil: inversiyon dizileri, büyük iç silme, Hipermutasyon/zararlı stop kodon, frameshifts veya mutasyonların 5 sinyal veya ana ambalaj ' splice donör (MSD) sitesi.

Figure 1
Şekil 1: tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) tahlil önemli adımlar. (A)HIV-1 DNA genom astar bağlayıcı siteleri tam uzunlukta (kusurlu ve sağlam) HIV-1 proviruses iç içe geçmiş PCR ile yakınındaki yükseltmek için FLIPS tarafından kullanılan 5' ve 3' U5 LTR bölgelerinde ile. (B) yerleşimini 80 örnek wells (20 kuyu her seyreltme için), 4 negatif kontrol kuyu ve 1 pozitif kontrolü de içeren bir 96-şey PCR tabak. (C) genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma-yetkili, HIV-1 proviruses tanımlamak için kullanılan eleme süreci. Bu rakam Hiener ve ark. değiştirildi 2 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada Kaliforniya Üniversitesi San Francisco ve Westmead Enstitüsü için tıbbi araştırma içerir Batı Sidney yerel sağlık bölgesi kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır.

1. HIV-1-enfekte hücre lizis

Not: Hücrelerin periferik kan, leukapheresis örnekleri, kemik iliği biyopsisi veya doku biyopsisi izole olabilir. Hücre popülasyonlarının floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak sıralanmış.

  1. 10 mM Tris-HCl, % 0.5 içeren bir lizis arabellek Nonidet P-40, % 0.5 hazırlamak ara-20 ve 0.3 mg/mL İndinavir K. Bir hücre Pelet başına 1 x 106 hücre lizis arabellek 100 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet karıştırmak için. 55 ° C'de 1 85 ° C için hücreleri parçalayıcı ve genomik DNA PCR güçlendirme için serbest bırakmak 15 dk ardından saat kuluçkaya.
    Not: Hücre lizis genomik DNA amplifikasyon için elde etmek yeterlidir. Hiçbir DNA izolasyon veya arıtma gereklidir. Protokol bu noktada durdu ve genomik DNA-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir.

2. tek HIV-1 DNA Proviruses iç içe geçmiş PCR ile amplifikasyon

  1. Tablo 1 ' de listelenen reaktifler ilk yuvarlak PCR (PCR1) mix ( Tablo malzemelerigörmek). 96-şey PCR plaka (takip 1B rakamdüzende) 85 wells (80 örnekleri, 4 negatif denetimleri, 1 pozitif kontrolü) 38 µL ana karışımı ekleyin. Bu plaka 'PCR1' belirleyin.
Reaktif Son konsantrasyonu PCR1 plaka (µL) için birim PCR2 plaka (µL) için birim
İleri astar 1 ΜM 32.3 23,8
Ters astar 1 ΜM 32.3 23,8
Arabellek (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95.2
dNTP (10 mM) 0.2 mM 64.6 47,6
DNA polimeraz (5 U/µL) 0.025 U/ΜL 16,2 11,9
Ultrasaf H2O 2632.5 1939.7

Tablo 1: Reaktifler ve birimleri PCR ana karışımları.

Not: PCR1 için kullanılan astar şunlardır:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 pozisyon 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 pozisyon 9662 9686)

  1. Ana karışımı hazırladıktan sonra PCR1 plaka genomik DNA eklenmesi için özel temiz bir alan taşıyın.
    1. Seri olarak seyreltik genomik DNA'sı 1:3 1:81 için Tris-HCl (5 mM, pH 8), 45 µL her seyreltme (20 kuyular her seyreltme için yetecek kadar) için hazırlanıyor. 2 µL seyreltilmiş genomik DNA'ın her örnek iyi ve 2 µL Tris-HCL (5 mM, pH 8) her olumsuz denetime iyi (takip düzeni Şekil1B) ekleyin. Tüm olumlu hariç PCR1 plaka, kuyu, kontrol ( Tablo malzemelerigörmek) açık yapışkanlı bir mühür kullanarak kapatın.
      Not: Yukarıda önerilen dilutions son nokta seyreltme belirlemek için yalnızca başlangıç yol gösterici. Dilutions entegre HIV-1 DNA örnekleri içinde yoğunluğuna göre değişir.
  2. Pozitif kontrol eklenmesi için özel bir alan taşıyın. Pozitif kontrol (pNL4-3 105 kopya/µL için seyreltilmiş) 2 µL de PCR1 plaka, pozitif denetimine ekleyin ve plaka mühür. Kısaca PCR1 plaka PCR plaka spinner veya santrifüj spin (400 x g 10 s oda sıcaklığında) kuyuları taraftan herhangi bir kalıntı içeriği çekmek için.
  3. Bir thermocycler PCR1 plakayı araştırmanı: 94 ° C için 2 dk; sonra 94 ° C 30 s, 64 ° C 30 s, 68 ° C 10 dakika için 3 kür; 94 ° C 30 s, 30 61 ° C s, 68 ° C 10 dakika için 3 kür; 94 ° C 30 s, 30 58 ° C s, 68 ° C 10 dakika için 3 kür; 94 ° C 30 s, 30 55 ° C s, 68 ° C 10 dk 21 döngüsü; sonra 10 dk (30 döngüleri toplam) 68 ° C. 4 ° C'de tutun
    Not: Protokol burada duraklatıldı ve PCR1 plaka 4 ° C'de 2 güne kadar devam etti.
  4. Tablo 1' de listelenen reaktifler PCR (PCR2) ikinci turu için karıştırın. 28 µL yeni 96-şey PCR plaka (takip 1B rakamdüzende) 85 wells (80 örnekleri, 4 negatif denetimleri, 1 pozitif kontrolü) ekleyin. Bu plaka 'PCR2' belirleyin.

Not: PCR2 için kullanılan astar şunlardır:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 pozisyon 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 pozisyon 9650-9676)

  1. Kısaca PCR1 plaka PCR plaka spinner veya santrifüj spin (400 x g 10 s oda sıcaklığında) kuyuları taraftan herhangi bir kalıntı içeriği çekmek için. Tris-HCL (5 mM, pH 8) 80 µL PCR1 plaka her şey için ekleyin.
    1. PCR1 plaka 2 µL bir çok kanallı pipet kullanarak PCR2 plaka aktarın. Örnekleri de (Yani, 2 plaka de PCR2 A1 plakasına transfer PCR1 iyi A1 üzerinden µL) iyi aktarılır olun. (Bkz. Tablo reçetesi) açık yapışkanlı bir mühür kullanarak PCR2 plaka mühür.
    2. Kısaca PCR2 plaka PCR plaka spinner veya santrifüj spin (400 x g 10 s oda sıcaklığında) kuyuları taraftan herhangi bir kalıntı içeriği çekmek için. Bir ısı-20 ° C'de uzun süreli depolama için film sızdırmazlık ile PCR1 plaka mühür ( Tablo malzemelerigörmek).
  2. Bir thermocycler PCR2 plakayı araştırmanı: 94 ° C için 2 dk; sonra 94 ° C 30 s, 64 ° C 30 s, 68 ° C 10 dakika için 3 kür; 94 ° C 30 s, 30 61 ° C s, 68 ° C 10 dakika için 3 kür; 94 ° C 30 s, 30 58 ° C s, 68 ° C 10 dakika için 3 kür; 94 ° C 30 s, 30 55 ° C s, 68 ° C 10 dk 31 döngüsü; sonra 10 dk (40 döngüleri toplam) 68 ° C. 4 ° C'de tutun
    Not: Protokol burada duraklatıldı ve PCR2 plaka 4 ° C'de 2 güne kadar devam etti.
  3. Kısaca PCR2 plaka PCR plaka spinner veya santrifüj kuyuları taraftan herhangi bir kalıntı içeriği çekmek için spin. Tris-HCL (5 mM, pH 8) 60 µL her şey bir çok kanallı pipet kullanarak ekleyin.
    1. Her şey 15 µL etidyum bromür içeren özel jelleri 2 x 48-iyi prekast %1 üzerinde çalıştırmak (0.1\u20120.3 µg/mL, Tablo malzemelerigörmek). Bir merdiven ile bir Aralık kullanma ilâ 10 kb ( Tablo malzemelerigörmek). Güçlendirilmiş ürün ve yaklaşık boyutlarını içeren wells tanımlamak için görselleştirmek. Jel resmi kaydedin.
      Not: olumlu denetim de güçlendirilmiş ürün içerir emin olun. Negatif kontrol wells güçlendirilmiş ürün içeriyorsa, kirlenme düşünün ve plaka göz ardı.
  4. Hangi Hayır daha--dan %30 Wells için güçlendirilmiş ürün olumludur seyreltme belirlemek.
    Not: Bu wells bir çoğunluğu (% 80) tek bir şablondan güçlendirilmiş ürün içeren son nokta seyreltme olduğunu. Bu seyreltme hazırlanan ve sonraki PCR proviral amplicons daha fazla almak için kullanılır. Kayıt güçlendirilmiş her ürün yaklaşık boyutu.

3. DNA arıtma ve miktar

  1. Kısaca PCR2 plaka PCR plaka spinner veya santrifüj kuyuları taraftan herhangi bir kalıntı içeriği çekmek için spin. Yeni bir 96-iyi MIDI plakasına güçlendirilmiş ürün (veya son nokta seyreltme altında) içeren kuyulardan 40 µL transfer (0.8 mL iyi hacmi ile Tablo malzemelerigörmek).
    Not: özgün ve yeni iyi konumunu güçlendirilmiş her ürün elektronik tabloda sıralı için güçlendirilmiş her ürün bir rekor olarak yazın.
  2. Güçlendirilmiş arındırmak DNA ürünleri bir manyetik boncuk dayalı PCR arıtma kullanarak kiti (tablo malzemeleri görmek) astar, nükleotit, enzim, yağlar ve tuzları kaldırmak için. Başlamadan, manyetik boncuklar oda sıcaklığına getirmek ve taze % 80 etanol hazırlamak. Yeni pipet ipuçlarını uygun olduğunda çapraz bulaşma DNA örneklerinin önlemek kullanın.
    1. Girdap manyetik boncuklar onlar iyice resuspended emin olmak için. Bir çok kanallı pipet kullanarak, boncuk 40 µL 0.8 mL 96-iyi MIDI plaka Güçlendirilmiş ürün 40 µL ekleyin. Yavaşça aşağı yukarı 10 kez karıştırmak için pipet. Alternatif olarak, çözüm üzerinde bir Mikroplaka shaker 1.800 rpm 2 dk. Incubate 5 min için oda sıcaklığında sallayarak plaka mühürleme tarafından karıştırın.
    2. Yer manyetik bir tabağa stand ( Tablo malzemelerigörmek) 2 dk. kaldırmak ve atmak için süpernatant.
    3. Boncuk her şey stand üzerinde plaka ile 200 µL % 80 etanol ekleyerek yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s. Kaldır için kuluçkaya ve süpernatant atın. Bir kez yinelenir. Bir çok kanallı pipet ile iyi ipuçlarını kullanarak, ikinci yıkama takip herhangi bir aşırı etanol kaldırın. İle plaka standında, boncuk hava kuru 15dk için izin verir.
    4. Plaka standından kaldırın. 30 µL elüsyon arabelleği ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her şey için. Yavaşça aşağı yukarı 10 kez karıştırmak için pipet. Alternatif olarak, çözüm üzerinde bir Mikroplaka shaker 1.800 rpm 2 min için oda sıcaklığında 2 dk. Incubate sallayarak plaka mühürleme tarafından karıştırın.
    5. Plaka bir çok kanallı pipet kullanarak 2 dakika süreyle manyetik bir stand üzerine yerleştirin, 25 µL (saf DNA) süpernatant ile yeni bir 96-şey PCR tabak transfer. Örnekleri de iyi aktarılır olun (Yani, 0.8 mL plaka iyi a1 süpernatant aktarılır yeni 96-şey plaka iyi A1 için).
      Not: hiçbir kalıntı arınma boncuk transferini sağlamak için eluted örnek 5 uL geride.
  3. Belirlemek ve arıtma bir spektrofotometre kullanarak takip güçlendirilmiş her DNA ürün yaklaşık konsantrasyonu kayıt (absorbans bir dalga boyu 260 nm).
    Not: güçlendirilmiş her ürün yaklaşık konsantrasyonu ölçme almıyoruz arıtma adımları sırasında kaybolur ve yaklaşık konsantrasyon kullanılan sonraki sahne (Standart eğri menzili içinde olduğunu emin olmak için bu aşamada gereklidir 0,001-1 ng/µL DNA 100 µL biriminin içinde). Protokol burada durdu ve temizlenmiş örnekleri-20 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  4. DNA dsDNA miktar kullanarak saflaştırılmış her ürün konsantrasyon ölçmek (tablo malzemeleri görmek) kit.
    Not: Bu örnek bir dsDNA konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri kullanarak içerir. Arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), bir lamda dsDNA standart ve floresan boya kiti içerir. Tüm reaktifler buz üzerinde tutun. Gün ışığına maruz önlemek için folyo ile boya içeren tüp kapsar. Nüsha güçlendirilmiş her üründe konsantrasyonu ölçmek.
    1. Steril DNaz boş H2O. eklemek 99 µL, arabellek boş Wells (3 katı güçlendirilmiş ürünleri ölçmek için bkz: Tablo 2 için bir örnek Düzen) uygun bir rakam için 1 x seyreltik arabellek bir düz dipli doku kültürü plaka. Arabellek 100 µL 3 boş wells için ekleyin.
    2. Ölçülecek güçlendirilmiş her ürün için 1 µL saf DNA (Kimden adım 3.2.5) nüsha her şey arabellek içeren için ekleyin (bir örnek düzen için bkz: Tablo 2 ).
    3. Standartlar hazırlamak için 10 kat lamda dsDNA seyreltik 2 ng/µL 0,002 için gelen ng / µL. 3 kuyu için her dsDNA Standart 100 µL ekleyin.
      Not: adım 3.4.4 standartları son konsantrasyonu 1'den 0,001 ng/µL aralığı olacaktır
    4. Arabellek ile floresan boya 1: 200 oranında seyreltin. Hızlı bir şekilde 100 µL her iyi örnek, boşluklar ve standartları içeren ekleyin. Yukarı ve aşağı bir pipet ile karıştırın. Işık ile temasını engellemek için folyo ile plaka kapak.
    5. Floresans emisyon Mikroplaka Okuyucu okumak (uyarma 480 nm, emisyon, 520 nm). Bir elektronik tablodaki kayıt sonuçları.
    6. Kaydedilen floresans ölçüler kullanarak her örnek içinde dsDNA konsantrasyonu belirlemek. Örnek ve standartları boş kuyulardan ölçülen floresans çıkarma. Her örnek ve triplicates standart için Ortalama floresans belirlemek. Standartları floresans ölçümleri dayalı standart eğri çizme. Standartlara göre örnekleri konsantrasyonu belirlemek.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Standart (1 ng/mL) Standart (0.1 ng/mL) Standart (0.01 ng/mL) Standart (0,001 ng/mL) Boş
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL arabellek
B Standart (1 ng/mL) Standart (0.1 ng/mL) Standart (0.01 ng/mL) Standart (0,001 ng/mL) Boş
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL arabellek
C Standart (1 ng/mL) Standart (0.1 ng/mL) Standart (0.01 ng/mL) Standart (0,001 ng/mL) Boş
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL arabellek
D Örnek 1: Örnek 2: Örnek 3: Örnek 4: Örnek 5: Örnek 6: Örnek 7: Örnek 8: Örnek 9: Örnek 10: Örnek 11: Örnek 12:
1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek
E Örnek 1: Örnek 2: Örnek 3: Örnek 4: Örnek 5: Örnek 6: Örnek 7: Örnek 8: Örnek 9: Örnek 10: Örnek 11: Örnek 12:
1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek
F Örnek 1: Örnek 2: Örnek 3: Örnek 4: Örnek 5: Örnek 6: Örnek 7: Örnek 8: Örnek 9: Örnek 10: Örnek 11: Örnek 12:
1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek 1 mL DNA + 99 mL arabellek
G
H

Tablo 2: Örnek düzeni 96-şey plaka dsDNA miktar için.

  1. (3.2.5. adımda elde) H2O 0.2 ng/µL için saflaştırılmış her ürünle sulandırmak.

4. sıralama kitaplığı hazırlık

  1. Güçlendirilmiş ve arıtılmış proviral DNA bir NGS DNA Kütüphane hazırlık kullanarak NGS için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kit. [Giriş DNA'dan (adım 3.5) dahil olmak üzere tepki birimlerinde Kütüphane hazırlık reaktifler kullanımı genişletmek için yarıya ki hariç] tagmentation, PCR güçlendirme ve temizlik adımlar için üreticinin yönergelerini izleyin.
  2. Kitaplıklar kullanarak el ile bir qPCR tabanlı NGS Kütüphane miktar normalleştirmek provirus bireysel konsantrasyonu belirlemek için (bkz. Tablo reçetesi) kit. Bireysel provirus kütüphaneler 4 son bir konsantrasyon ekimolar miktarda birleştirmek nM, veya sıralama hizmet sağlayıcısı tarafından belirtildiği gibi.
    Not: Burada protokol duraklatılmış ve havuza alınan Kütüphane-20 ° C'de depolanan
  3. 3.4. adımda kullanılan aynı dsDNA miktar seti kullanarak son havuza alınan kitaplığı ölçmek. Üreticinin yönergeleri izleyin. Uygun bir kullanarak bir otomatik Elektroforez sistemde 1 µL havuza alınan Kütüphanesi tarafından ortalama parça uzunlukları belirlemekle ( Tablo reçetesigörmek) kit. Konsantrasyon ve ortalama parça uzunlukları havuza alınan kütüphane derişim belirlemek için kullanın.
  4. Havuza alınan Kütüphane 5 µL 0.2 N NaOH Kütüphane denatüre için 5 µL ile birleştirin. 200 mm Tris-HCl nötralize etmek için 5 µL ekleyin. 12: 17 soğutulmuş hibridizasyon (DNA Kütüphane hazırlık seti ile kullanılabilir) arabelleği hemen önce sıralama ile son kitaplığına sulandırmak.
  5. 2 x 150 nükleotit (nt) eşleştirilmiş uç sıralama uygun bir NGS platformunda ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: 96 proviral kitaplıkları Çalıştır dizine eklendiğinde, bu yaklaşık 20 milyon eşleştirilmiş uç okuma başına ya da bireysel provirus Kütüphane başına 200.000 okuma de-çoğullama takip analiz için verir. Adımlar 4.4 ve 4.5 genellikle bir sıralama aracı tarafından gerçekleştirilir.

5. sıralı HIV-1 Proviruses Meclisi De Novo

Not: güçlendirilmiş her provirus genetik dizisini elde etmek için birleştirilmiş de novo eşleştirilmiş uç okuma dan contigs vardır. Birçok platformlar (Örneğin, CLC genomik Workbench14), de novo derleme için özel iş akışları tasarım sağlar. FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17ve FLASH18 gibi diğer açık kaynak yazılım da işleme okur, hem de Bowtie219 ve maça20 okuma eşleme ve gibi araçlar için yararlı olabilir de novo derleme. HIV-1 contigs belirli bir ticari platform ( Tablo reçetesigörmek) ana hatlarıyla (Şekil 2) kullanarak de novo derleme için adımlar. Özelleştirilmiş iş akışı dosyası istek üzerine mevcuttur.

  1. İthalat dizileri ve kalite kontrol: eşleştirilmiş sıra okur (fastq.gz biçiminde) sonra tek eşli okuma kümesi kombine edilebilir yazılım içine alma. Bir sıra QC rapor oluşturmak ve veri kalitesini inceleyin.
  2. Kalite kontrol
    1. QC rapora göre okuma düzeltme gerçekleştirin. Herhangi bir bağdaştırıcı dizileri ve belirsiz nükleotit kaldırın. On beş döşeme 5' ve iki 3' terminal nükleotit. At uzunluğu az 50 nukleotid okur. 0,001 30 bir QC phred puan için karşılık gelen bir kalite sınırı kullanın.
  3. Üst üste gelen çiftleri birleştirme
    1. İleri eşleştirilmiş birleştirerek tek genişletilmiş okuma formu ve okuma bölgeleri çakışan ters.
  4. De novo derleme
    1. Yerel CLC genomik de novo assembler 30 sözcük (veya k-mer) boyutu ile kullanmak nt ve maksimum kabarcık boyutu 65 nt rastgele bir subsample üst üste 10.000 eşleştirilmiş okur montajı. Monte de novo dokunma beklenen kapsamının ~ 200 x ~ 9 kb sırası için değildir.
      Not: Bu alt örnekleme Hesaplamalı yük öyle ki en standart masaüstü bilgisayarlar derleme ve analiz işleyebilir ve her provirus clonality verilen azaltabilir (bir kütüphanedir bir provirus), bu çeşitlilik sınırlamaz.
  5. Contigs için tüm okuma yeniden eşleme
    1. Her provirus son çoğunluk fikir birliği dizisini elde etmek için monte de novo dokunma ayarla tam okuma eşleştirin. Sadece contigs ile bir minimum ortalama örtmek-in 1000 x kabul ve son dokunma uzunluğu özgün özel jel (adım 2.8.1) bandında boyutunu uygun sağlamak. Son çoğunluk fikir birliği sıra bir .fasta dosyası olarak kaydedin.
      Not: Çoğu contigs yukarıdaki adımları kullanarak monte edilebilir. Ancak, bazı durumlarda, tek bir provirus için birden çok contigs benzer bir kapsama ile birleştirilir. Bu şartlar altında contigs bir çevre tam uzunlukta (~ 9 kb) uyumlu olan fikir birliği sıra aynı katılımcı ve el ile bir tek dokunma içine monte. Tüm okuma sonra el ile birleştirilmiş dokunma eşlenir ve son fikir birliği Eğer okuma kapsama derleme boyunca hatta ve Hayır tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) > %40 mevcut kabul edilmektedir.
  6. Daha fazla kalite kontrol
    1. Her dokunma tek bir provirus temsil eder ve tek bir kuyu içinde birden çok proviruses amplifikasyon nedeniyle değil emin olmak için kapsamı ve son dokunma varyant arama ekranını okuyun.
    2. Birden çok proviral şablonu PCR sırasında mevcut kez çok düzensiz okuma kapsamı (nedeniyle farklı boyutlarda proviruses Co amplifikasyon) ne zaman tanımlanır tam uzunlukta bir fikir birliği için eşleme aynı katılımcıdan veya SNPs ile varlığı ile bir sıklığı > % 40 (bkz: temsilcisi sonuçları, Şekil 4). Karışık nüfus sonraki analizlerde dikkate almayın.
  7. Hizalama
    1. Moleküler evrim genetik analiz (MEGA) 721gibi yazılımlar ile ilgilenen sıra proviral her serisinin son fikir birliği alın. HXB2 başvuru sırası her diziye el ile hizalayın. 5' trim ve 3' HXB2 astar dizileri kaldırmak için 666-9650 konumlara biter.
    2. Sıralı liste fasta biçiminde vermek ve MAFFT sürüm 722, son uyum elde etmek uygun olan yerlerde el ile düzenleme ile kullanarak hizalayın.
      Not: Eğer herhangi bir dizileri hizalama değil, ilk tamamlayıcı sırası ters. Sıra hala değil hizalamak Eğer HIV-1 sıra olduğundan emin olmak için bir patlama arama yapın. Bunlar bu aşamada tanımlanabilir ve sigara-HIV-1 şablonları yükseltmek mümkündür. Eğer dizileri HIV-1 ama değil hizalamak, silinme (bkz. Adım 6.1) varlığı göz önünde bulundurun.

6. olası çoğaltma yetkinlik HIV-1 Proviral sıralarının belirlenmesi

Not: genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili dizileri tanımlamak için (Şekil 1 c) HIV-1 proviruses eleme sıkı bir süreç takip. Silinme eksik proviral dizileri, büyük iç silme, zararlı kodon durdur / Hipermutasyon, frameshift mutasyonlar ve/veya kusurları MSD site veya ambalaj sinyal içinde genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili kabul edilir.

  1. Silinme
    1. Hizalama aşamasında silinme tanımlayın. Silinme bölge ters sürece çıkarılan nerede sırası referansı HXB2 hizalamıyor bölgeleridir.
      Not: verileri uygulamaya bağlı olarak, daha fazla çözümleme atlanacak silinme içeren dizileri gerekebilir.
  2. Büyük iç silme
    1. Contigs ile büyük iç silme tanımlamak (> 600 bp) uyum aşamasında. Silme işlemini nefiçinde oturur sürece sıra kusurlu olarak tanımlanabilir.
      Not: İç silme işlemi yapılan herhangi bir dizileri < 600 bp tespit Gene Cutter (adım 6.3.1) tarafından eksik gen dizileri sahip olarak.
  3. Zararlı stop kodon, frameshift mutasyonlar ve silme
    1. Tüm contigs uzunluğu kontrol > 8400 nükleotit zararlı stop kodon, frameshifts ve Los Alamos Ulusal Laboratuvarı HIV sıra veritabanı Gene kesici kullanarak eksik gen dizileri varlığı için aracı23.
      Not: Gene Cutter aracı genler gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ve nefproviral sıra ayırır ve onları amino asitler için çevirir. Gene Cutter sonra ekranları stop kodon ve frameshift mutasyonlar (nedeniyle eklemelerin veya silmelerin) varlığı için. Stop kodon veya frameshifts herhangi bir gen içeren Contigs NEF24, hariç kusurlu olarak sınıflandırılır. Gene Cutter aynı zamanda tanımlar eksik gen dizileri ve herhangi bir proviruses ile bir silme < 600 bp bir gen nef dışında büyük bir iç silme nedeniyle kusurlu olarak sınıflandırılmıştır.
  4. Hipermutasyon
    1. Los Alamos Ulusal Laboratuvarı HIV sıra veritabanı fikir birliği Maker Aracı (basit fikir birliği maker)25kullanarak kalan tam uzunlukta proviral dizileri bir fikir birliği oluşturmak. Sadece kalan tam uzunlukta proviral dizileri içeren bir hizalama için fikir birliği sıra ekleyin. APOBEC kaynaklı G-A Hipermutasyon kalan tam uzunlukta proviral serileri tanımlamak için bu hizalama ve26 Los Alamos Ulusal Laboratuvarı HIV sıra veritabanı Hypermut aracını kullanarak.
  5. MSD ve ambalaj sinyal
    1. Her biri proviral sıra kusurlu4render kusurları MSD ve ambalaj sinyal (HXB2 bölge 670-810) için kalan contigs bakarak kontrol edin. Bir nokta mutasyon MSD sitesindeki (sıra GT, HXB2 744-745) arayın veya herhangi bir silme dört kök ambalaj sinyal döngüler (SL1 (HXB2 691-734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779) ve SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

FLIPS tahlil güçlendirir ve tam uzunlukta HIV-1 proviruses tek dizileri. Protokol tam uzunlukta proviral dizileri elde etmek için 6 adımdan oluşur. Bu adımlar içerir: lysis ile enfekte hücreleri, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses, DNA arıtma ve miktar Kütüphane hazırlık, NGS, sıralama, iç içe geçmiş PCR ve de novo Meclisi sıralı proviruses. Her adım sonu içinde önce bir sonraki adım (güçlendirilmişÖrneğin DNA, saf DNA, sıralama kitaplığı veya sıra) ürünün kalitesini tespit edilebilir bir denetim noktası kabul edilebilir. Genel değerlendirme her adım sonunda gerçekleştirilen ve beklenen sonuçları aşağıda özetlenen.

İç içe geçmiş PCR güçlendirilmiş ürünler % 1'özel jel (Şekil 3) üzerinde çalışır. PCR ilk kalitesini negatif ve pozitif denetimleri denetim tarafından belirlenebilir. Güçlendirilmiş ürün içeren negatif kontrol wells kirlenme belirtmek ve güçlendirilmiş ürün yok olumlu denetim kuyu yetersiz amplifikasyon gösterir. Ardından, güçlendirilmiş ürün içeren wells için sıralama seçilir. Birden fazla güçlendirilmiş proviruses karışımları içeren wells önlemek için yalnızca son nokta seyreltme çalıştırmak güçlendirilmiş ürün içeren wells sıralama için kabul edilir. %30 Wells için güçlendirilmiş ürün pozitif olduğunda Poisson dağılımı göre son nokta seyreltme bulunur. Bu seyreltme bir %80 işte bu kuyu içeren tek bir güçlendirilmiş provirus şans. Ayrıca, birden çok grup üzerinde jel görüneceği şekilde farklı uzunlukta birden çok güçlendirilmiş proviruses içeren wells, bu aşamada görüntülenmeyecektir. Bu wells (Şekil 3) sıralama için seçilmemelidir.

Sıralama için seçili güçlendirilmiş proviruses arıtma miktar proviral DNA arıtma aşamasında kaybolur sağlar. Güçlendirilmiş bir provirus DNA konsantrasyonu ise < 0.2 ng/µL, plaka saf PCR2 kalan örnek. Benzer bir denetim noktası içinde bireysel her kitaplık sayısal Kütüphane hazırlık oluşur. Bu bireysel proviruses edilmiş uygun şekilde parçalanmış, öğesini ve sıralama öncesinde güçlendirilmiş sağlar. Bireysel proviral kitaplıkları 4 son Kütüphane konsantrasyon ekimolar miktarda havuza alınmış nM (veya sıralama sağlayıcısı tarafından belirtildiği gibi). Bir bireysel proviral Kütüphane konsantrasyonu çok düşükse, sıralama kitaplığı havuzundan çıkarıldı olabilir veya bireysel Kütüphane yine hazırlanmış. Havuza alınan kütüphane konsantrasyonu son bir kontrol ile birlikte ortalama parça uzunlukları teyit sıralama önce gerçekleştirilir.

Kalite kontrol adımları önce de novo derleme sahne son proviral dokunma birleştirmek için kullanılan okuma kalitesini sağlar. Bu adımlar içerir: 5' ve 3' nükleotit, bir kalite sınırı kırpma ve kısa okuma göz ardı ederek bağdaştırıcısı diziler, kaldırılması. CLC genomik Workbench önce düzeltme düşük kaliteli bölgeleri kaldırmak için yeterli olup olmadığını belirlemek için okuma ve rehber düzeltme ayarları ve sonra sonra ilk kalite değerlendirmek için kullanılabilir kalite kontrol raporları sağlar. Ayrıca, de novo derlemesi için birleştirilmiş contigs kalitesi için yeterli derinliği değerlendirilebilir (> 1000 X) ve düzgünlüğünü kapsama (Şekil 4A). Karışık nüfus da bu aşamada tespit edilebilir. Karışımları (büyük iç silme içeren) kısa ve tam uzunlukta proviruses düzensiz tarafından tespit edilebilir, ancak birden çok tam uzunlukta (~ 9 kb) proviruses karışımları % 40, daha büyük bir frekans ile birden fazla SNPs varlığı ile tanımlanır eşleme aynı katılımcı (4B rakam) tam uzunlukta bir referansı takip kapsama okumak.

Uygulamaya bağlı olarak, son hizalama ggtree kullanılabilir gibi araçlarla "R: A dil ve istatistiksel bilgi işlem ortamı"27' deki bir paket olarak görüntülenmeyecektir. Bir son çalışmada, FLIPS kullanılan sıra HIV-1 proviruses için saf, orta, geçiş ve efektör bellek CD4+ T hücreleri izole bireyler belirli hücre alt kümeleri daha yüksek gösterdi eğer belirlemek amacı ile uzun vadeli sanat genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili HIV-12oranlarda. Burada, bu çalışmada (katılımcı 2026) bir katılımcıdan izole sıralarının görsel temsili (Şekil 5) sunulmaktadır. Bu katılımcı, arızalı, dizileri çoğunluğu (% 97) efektör ve geçici bellek CD4 bulunan sağlam serileri ile+ T hücreleri. Bu görselleştirme aracı numara sıralarının büyük iç silme işlemi yapılan ve genom içindeki konumlarını göstermek için yararlıdır. Bu daha da zararlı stop kodon, frameshift mutasyonlar ve silme/MSD site ve/veya ambalaj sinyal mutasyonların sıralarıyla belirtmek için açıklamalı.

Bir uygulama döndürür testin genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili HIV-1 proviruses tanımlamasıdır. Bir son çalışmada, 531 dizileri CD4 izole+ T hücreleri uzun vadeli sanat, 6 katılımcılardan 26 (% 5) genetik olarak sağlam HIV-1 proviruses olduğunu tespit2. Kalan arızalı proviruses inversiyon dizileri (% 6), büyük iç silme (% 68), zararlı stop kodon/Hipermutasyon (%9), frameshift mutasyonlar (% 1) ve kusur ambalaj sinyal ve/veya mutasyonlar MSD sitesindeki (% 11) dahil .

Figure 2
Resim 2: HIV-1 proviruses Meclisi de novo için iş akışı genel bakış. İş akışında önemli adımlar şunlardır: 1) sıra okumak kalite kontrol, 2) üst üste gelen çift, 3 birleştirme) de novo derleme ve 4) yeniden eşleme ve fikir birliği Binası-si olmak be kırmızı, mavi, yeşil, turuncu, anılan sıraya göre. Bu rakam Hiener ve ark. değiştirildi 2 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: örnek özel jel PCR ile güçlendirilmiş HIV-1 proviruses. Kuyu 1, 2, 3, 6, 9 ve 10 güçlendirilmiş HIV-1 proviruses içerir. İyi 10 büyük iç silme ile bir provirus, iyi 2 Co iki HIV-1 proviruses farklı uzunlukta (karışım) amplifikasyon içerir, ve iyi 12 olumlu denetim içerir. Güçlendirilmiş ürün içeren wells yüzde %60, yüzde tek şablonları yalıtmak için gerekli olduğunu unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: okuma eşlemenin örnek çıktı. (A)tek bir tam uzunlukta HIV-1 provirus amplifikasyon nedeniyle bile kapsama gösteren örnek. De novo derleme tüm okuma bir fikir birliği sıra üretmek için birleştirilmiş dokunma eşleştirilir. Yazılım platformu için yeterli ve hatta kapsama kontrol eşlenen okuma sağlar. (B) iki HIV-1 proviruses farklı uzunlukta (karışım) Co amplifikasyon gösteren örnek. Karışımlar belirlemek için okuma bir tam uzunlukta (~ 9 kb) başvuru dizisine aynı katılımcıdan eşlenen ve eşleme kontrol okuyun. Düzensiz kapsama bir karışımı olduğunu gösteren. Bu rakam QIAGEN14izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Örnek görselleştirme HIV-1 proviral sıralarının CD4 izole+ T hücre alt kümeleri üzerinden uzun vadeli sanat tek kişi. Bireysel HIV-1 proviral serileri yatay çizgilerle gösterilir. Bu rakam Hiener ve ark. değiştirildi 2 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

FLIPS tahlil yükseltecek ve tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki sıralama tek için verimli ve yüksek işlem hacmi bir yöntemidir. Multipl faktörler ve protokol sayısı ve kalitesi elde sıralarının etkileyen kritik adımları tespit edilmiştir. İlk olarak, hücre sayısı ve hücre nüfus HIV-1 enfeksiyonu sıklığı güçlendirilmiş proviruses sayısını etkiler. Örneğin, bir önceki yayında yaklaşık yarısı kadar çok dizileri saf CD4 aynı numaradan+ T elde karşılaştırıldığında efektör bellek CD4 hücreleri+ T hücreleri. Saf hücreleri genellikle efektör bellek hücreleri2' den daha düşük bir enfeksiyon frekans sahip olmasıdır. İkinci olarak, hücre lizis sütunlara göre çıkarma yöntemleri olarak DNA ekstraksiyon sürecinde kaybetme riski yoktur genomik DNA elde etmek için tercih edilir. Son olarak, herhangi bir PCR tabanlı tahlil gibi ile bulaşma önlenmesi çok önemlidir. Ayrılmış temiz alanlarda ana karışımları, genomik DNA, pozitif denetimleri, DNA arıtma ve miktar ve Kütüphane hazırlık ekleme işleme hazırlamak için belirlenmiş olması. Bu tek kopya deneyleri burada sunulan biri gibi için özellikle önemlidir.

Uygulama döndürür testin ilk katılımcı örnekleri yerine pNL4-3 plazmid gibi olumlu bir denetimin çalıştırılması içermelidir. Kullanılabilir başvuru sıralarını bu Plasmid'ler için elde edilen dizileri karşılaştırıldığında bu herhangi bir sorun giderme önceden HIV-1 pozitif hücrelerinin, kullanımı için izin verir. HIV-1 pozitif hücrelerinin kullanırken, hiçbir proviruses için çok az güçlendirilmiş Eğer HIV-1 alt türü (astar döndürür alt B özgü için tasarlanmış) ve hücre nüfus enfeksiyonu sıklığı dikkate almak önemlidir. Astar dizileri modifiye/diğer alt türleri eşleştirmek için yeniden tasarlanmış olabilir. Ayrıca, bir de olumlu bir denetimi içeren gerçekleştirilen her PCR dahil edilmelidir.

FLIPS SPS dahil olmak üzere önceki sıralama deneyleri sınırlamaları aşmak. Yükseltecek ve sıralamanın tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki döndürür olası çoğaltma yetkinlik, HIV-1 proviruses belirleyebilirsiniz. Bu sadece alt genomik bölgeleri sıralı ve bu nedenle diziler ile bozulmamış astar bağlayıcı siteleri için seçilen SPS kullanarak mümkün değildi. Ayrıca, FLIPS birden çok amplifikasyon ve sıralama astar, önceki tam uzunlukta sıralama deneyleri1,4tarafından istihdam edildi gibi kullanan ile ilgili sınırlamalar üstesinden gelir. NGS ile kombine HIV-1 lt. bölgeleri hedefleyen PCR iki tur üzerinden FLIPS sayısını ve astar gerekli karmaşıklığını azaltır. DÖNDÜRÜR bu nedenle astar uyuşmazlıkları, yani arızalı proviruses hatalı tanımlaması ve bazı proviruses bir nüfus içinde yükseltmek için bir yetersizlik sonuçlarını üzere. FLIPS Protokolü Ayrıca daha etkilidir ve bir yüksek-den geçerek sıralama daha önceki yöntemler sağlar.

Belli ki, FLIPS HIV-1 proviruses genetik kompozisyonu belirlemek mevcut yöntemler üzerinde avantajları sağlar. Ancak, FLIPS sınırlamaları kabul etmek önemlidir. Analizler FLIPS yükselterek olup olmadığını her HIV-1 provirus bir hücre nüfus mevcut belirlemek için tamamlanmamış gibi öncelikle, FLIPS tahlil gizli HIV-1 depo, boyutunu ölçmek için bir araç olarak geliştirilmiş değil. DÖNDÜRÜR, bunun yerine farklı hücre nüfus2arasında baraj gölünün kompozisyon göreli karşılaştırmaları yapmak için kullanışlıdır. İkinci olarak, çoğaltma-yetkinlik sağlam HIV-1 proviruses, in vivo analizleri, örneğin Ho vd tarafından geçekleştirilen olmadan kesinlikle tespit edilemez 4. üçüncü olarak, FLIPS HIV-1 proviruses entegrasyon siteyi belirlemek üzere tasarlanmamıştır.

Küçük varyasyonları FLIPS protokolü için uygulama artırabilir. Örneğin, dizileri farklı izin verebilirsiniz astar ve sıralı ve güçlendirilmiş için birden fazla HIV-1 alt türlerini değiştirir. Plazma HIV-1 virions nın cDNA sentez iç içe PCR önce eklenmesi mümkündür. Gelecekteki tek molekül sıralama yöntemleri kullanımı de novo derleme gereksinimini ortadan kaldırır.

Entegre HIV-1 proviruses genetik sıralama anlayışımız gizli HIV-1 baraj gölünün artmıştır. DÖNDÜRÜR kompozisyon ve dağıtım gizli rezervuar elucidating gelecekteki çalışmaları için önemli bir araçtır. Bununla birlikte, FLIPS uygulanması havzanın genişletebilirsiniz. Gelecekteki çalışmalar CRISPR-Cas teknoloji için belirli hedefler belirlemek veya kodlama belirlenmesine yardımcı için FLIPS yararlanmak ve virüs ajanları geri gecikme süresi için daha duyarlı olun kodlamayan bölgeler. Viral rekombinasyon büyük iç silme kavşak sitelerinde bakarak daha iyi anlamış.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser desteklenmiştir (1U19AI096109 ve 1UM1AI126611-01); bir çare bulmak için Delaney AIDS araştırma Enterprise (meydan) bir amfAR araştırma konsorsiyumu üzerinde HIV ortadan kaldırılması (ARCHE) ortak araştırma bursu Vakfı AIDS Araştırma (amfAR 108074-50-RGRL); Avustralya merkezi HIV ve hepatit Viroloji araştırma (ACH2); UCSF-GIVI merkezi AIDS Araştırma (P30 AI027763); Avustralya Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (AAP1061681). Dr. Joey Lai, genomik tesis yöneticisi kitaplığı hazırlık ve onun tesisi kullanımı onun eğitimi için tıbbi araştırma Westmead Enstitüsü'nde ve Ramaciotti merkezi genomik (University of New South Wales, Sidney, Avustralya) için teşekkür etmek istiyorum sıralama yürütmek için. Bu çalışma için örnekleri hibe katılımcılar Şükran ile anıyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

Genetik sayı: 140 yeni nesil sekanslama HIV-1 HIV proviruses tek proviral sıralama HIV DNA gecikme süresi çoğaltma-yetkinlik antiretroviral tedavi HIV depo entegre HIV
Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter