Summary
Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.
Abstract
Le néocortex mammifère se compose de nombreux types de neurones excitateurs et inhibiteurs, chacune avec des propriétés électrophysiologiques et biochimiques spécifiques, les connexions synaptiques, et in vivo des fonctions, mais leur base anatomique et fonctionnelle Organisation de cellulaires à l’échelle du réseau est mal comprise. Nous décrivons ici une méthode pour l’imagerie en trois dimensions des neurones marqués fluorescent à travers de vastes zones du cerveau pour l’enquête de l’organisation cellulaire corticale. Certains types de neurones sont étiquetés par l’injection de traceurs fluorescents de neuronales rétrogrades ou l’expression de protéines fluorescentes chez les souris transgéniques. Bloc des échantillons de cerveau, par exemple, un hémisphère, préparés après fixation, rendues transparentes avec des méthodes de compensation des tissus et soumis d’immunomarquage fluorescent des types spécifiques de cellules. Grandes surfaces sont analysés à l’aide de microscopes confocaux ou deux photons équipés d’objectifs de distance de travail grand et platines motorisées. Cette méthode peut résoudre l’organisation périodique des modules fonctionnels spécifiques au type microcolonne cellulaire dans le néocortex de souris. La procédure peut être utile pour l’étude de l’architecture cellulaire tridimensionnelle dans les zones du cerveau différentes et d’autres tissus complexes.
Introduction
Le néocortex mammifère est composé d’un grand nombre de types de cellules, chacune avec les modèles d’expression de gènes spécifiques, les propriétés électrophysiologiques et biochimiques, les connexions synaptiques, et in vivo fonctionne1,2 ,3,4,5,6,7. Si ces types de cellules sont organisés en structures répétées a été peu clair. Les colonnes corticales, y compris les colonnes de l’orientation visuelle et somatosensoriels barils, ont répété les structures, mais leur organisation cellulaire reste peu clair8,9. Ceux-ci sont présents dans les zones corticales spécifiques et ne sont pas un système à l’échelle du cerveau.
Dans la couche néocorticale 5, la grande majorité des neurones est classée en quatre grandes catégories. Un type majeur des neurones excitateurs, neurones de projection Sub cérébrale, projette des axones vers des cibles sous-corticales incluant les pons, la moelle épinière et colliculus supérieur et, représente donc la sortie corticale importante voie10. Neurones de projection corticale, un autre principal type de neurones excitateurs, innervent le cortex10. Neurones inhibiteurs contiennent également deux grandes catégories : les cellules exprimant le parvalbumine et exprimant la somatostatine11.
Des analyses récentes indiquent que les types de quatre cellules sont organisés en structures répétées12,13,14. Neurones de projection cérébrale Sub12,13,14 tant de neurones de projection corticale14 organisent en type cellulaire spécifique microcolumns avec un diamètre de 1 à 2 cellules. Les cellules exprimant le parvalbumine et exprimant la somatostatine alignent plus précisément microcolumns de neurones de projection Sub cérébrale mais pas avec microcolumns de neurones de projection corticale14. Microcolumns s’aligner régulièrement pour former un hexagonal tableau14 en treillis et sont présents dans plusieurs aires corticales, y compris les villes de visuels, somesthésiques et moteurs dans le cerveau de souris12,14 et dans la langue zones du cerveau humain13. Neurones dans la microcolonne individuel montrent une activité synchronisée et ont des réponses sensorielles semblables14. Ces observations indiquent que les types de cellules couche 5 organisent en une structure en treillis microcolonne qui représente la première organisation à l’échelle du cerveau connue de répéter les modules fonctionnels.
Microcolumns ont un rayon d’environ 10 µm et ont une périodicité spatiale d’environ 40 µm. En outre, l’orientation des microcolumns est parallèle à leurs dendrites apicaux et change en fonction de leur position dans le cortex14. Le système de la microcolonne est donc difficile d’analyser à l’aide des tranches de cortex conventionnels avec une épaisseur typique de quelques dizaines de micromètres. En outre, exige que l’analyse de la périodicité des données tridimensionnelles d’un large éventail de régions du cerveau et, par conséquent, la zone d’imagerie typique de la microscopie confocale ou l’imagerie in vivo 2 photons est trop étroite.
Récemment, les techniques ont été développées pour effacer les tissus épais15,16. Nous décrivons ici l’application de ces méthodes pour obtenir des images à grande échelle, en trois dimensions des types de grandes cellules en couche néocorticales souris 5 qui composent le système de la microcolonne. Neurones de projection subcerebral sont marqués par l’étiquetage rétrograde ou par l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée dans Crym-egfp souris transgéniques12et projection corticale neurones sont étiquetés par le rétrograde marquage ou par l’expression de tdTomato en Tlx3-cre/Ai9 souris17. Les cellules exprimant le parvalbumine et exprimant la somatostatine sont étiquetés par immunohistochimie. La méthode (anticorps échelle S) AbScale18 est utilisé pour l’anticorps coloration expériences, tandis que la méthode (voir Deep Brain) SeeDB19 est utilisé pour d’autres expériences. Ces méthodes de surmonter les difficultés susmentionnées des méthodes d’imagerie conventionnelles et révèlent l’organisation cellulaire précise de couche 514.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par le Comité des expériences sur animaux RIKEN Wako et Comité de sécurité de Experiment RIKEN génétique recombiné et interprétés conformément aux directives institutionnelles des animaleries de la RIKEN Brain Science Institut.
1. préparation de l’imagerie Chambers
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L’imagerie chambre19
- À partir de feuilles de caoutchouc de silicone, préparer une chambre avec une épaisseur d’environ 5 mm et le plancher des plaques de différentes épaisseurs. Également, préparer des boîtes de Pétri avec et sans un fond de verre (Figure 1 a).
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Entretoise de tranche
- Préparer des entretoises pour contenir les échantillons, à l’aide de feuilles de caoutchouc de silicone d’une épaisseur de 0,5 mm (Figure 1).
2. Injection de traceur
Remarque : Faire des injections dans le colliculus supérieur (2.2) ou pons (2.1). Injection dans les neurones de projection cérébrale sous étiquette pons dans une région du cerveau large y compris les zones visuelles et motrices, tandis que de l’injection dans les neurones de projection cérébrale sous étiquettes colliculus supérieur dans l’aire visuelle. Pour des expériences de contrôle, injecter une solution saline au lieu de la sous-unité de toxine de choléra fluorescent marqué B. Pour le maintien de l’état stérile utilisent le matériel stérilisé et des gants en plastique, nettoyés avec de l’éthanol.
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Faire des injections dans la protubérance de souris adultes.
- Dessiner 1 µL de sous-unité de toxine de choléra fluorescent marqué B (25 µg/µL dans du PBS) dans une seringue de Hamilton G 26.
- Placer une pompe d’injecteur sur la seringue.
- Placer la seringue et pompe sur le porte-outil d’un manipulateur placé sur un instrument stéréotaxique. Inclinez le manipulateur 12° vers l’arrière de l’axe vertical.
- Anesthésier une souris adulte mâle ou femelle (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9) par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids corporel) ou par l’administration d’isoflurane (2 – 3 %). Attendez que la souris n’apporte aucune réponse quand sa queue est pincée avec une pince, ce qui indique que la souris est complètement anesthésiée.
- Placez votre souris sur l’instrument stéréotaxique.
- Retirer délicatement les cheveux à l’aide d’une lame de rasoir pour prévenir l’infection et couper 10 mm du cuir chevelu afin que le bregma lambda sont visibles. Administrer 0,1 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une pipette. Réglez l’angle de la tête en ajustant la position verticale de l’embout sur l’instrument stéréotaxique afin que le bregma et lambda ont le même niveau z.
- Ajustez la position du manipulateur en le glissant sur l’instrument stéréotaxique afin que l’embout de la seringue est proche du bregma et enregistrer la position du manipulateur. Retirer la seringue en déplaçant le porte-outil sur le manipulateur.
- Déplacez le manipulateur 5,4 mm vers l’arrière et 0,4 mm latéralement. La seringue à l’avance afin que la pointe se trouve à proximité du point d’entrée sur le crâne. Retirer la seringue et marquer le point d’entrée.
- À l’emplacement marqué, percer un trou d’un diamètre d’environ 1 mm.
- Insérer l’embout de la seringue dans le trou de sorte que la profondeur de la pointe est 6,9 mm de plus que celle mesurée à la bregma.
- Injecter 1 µL de traceurs à l’aide de la pompe à 0.2 µL/min.
- Retirer la seringue du cerveau.
- Si nécessaire, couvrir le cerveau exposé avec de petits fragments de pince hémostatique microfibrillaire et adhésif instantané.
- Rincez le cerveau exposé à l’aide de sérum physiologique livré avec une pipette pour prévenir l’infection et la suture du cuir chevelu.
- Retirer la souris de l’instrument stéréotaxique. Laissez la souris récupérer de l’anesthésie dans un incubateur à 30 ° c, généralement pendant 1 h. N’abandonnez pas la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Retourner la souris à la compagnie d’autres animaux après que elle a entièrement récupéré.
- Maintenir la souris pendant 3 à 7 jours.
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Faire des injections dans le colliculus supérieur de souris adultes.
- Préparer une pipette en verre avec un diamètre de 30 – 50 µm.
- Se connecter à la pipette de verre à une seringue de Hamilton à travers un tube en plastique (Figure 2 a).
- Remplir la pipette en verre, tube en plastique et Hamilton seringue avec le liquide de la paraffine.
- Placer une pompe d’injecteur sur la seringue.
- Placez la pipette de verre sur le manipulateur et inclinez le manipulateur 60° vers l’arrière de l’axe vertical (Figure 2 b).
- Exécuter 2.1.4–2.1.9. La position du manipulateur est postérieure, 1,4 mm 0,5 mm latéral à la lambda.
- Placer un film de paraffine en plastique petit sur le crâne, puis mettre environ 1 µL de la solution de traceur là-dessus. Rapidement progresser la pipette en verre et le remplir avec au moins 0,5 µL de la solution de traceur.
- Insérer la pipette de verre pour que la profondeur de la pointe est de 3,0 mm de la surface du cerveau.
- Injecter 0,5 µL de traceurs à l’aide de la pompe à 0.2 µL/min.
- Retirez la pipette de verre du cerveau.
- Exécuter 2.1.13–2.1.16.
3. fixation et coupe
- Injecter par voie intrapéritonéale pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids corporel) une souris (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9, avec ou sans l’injection de traceurs tel que décrit à l’étape 2. Attendez que la souris n’apporte aucune réponse quand sa queue est pincée avec une pince, ce qui indique que la souris est complètement anesthésiée.
- Euthanasier la souris sans cruauté en perfusant la souris transcardially20 avec la solution saline à 0,9 %.
- Corriger la souris20 en perfusant la paraformaldéhyde (PFA) de 4 % dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7.5).
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Couper le cuir chevelu à l’aide d’une paire de ciseaux pour exposer le crâne comme décrit20.
- Couper la ligne médiane du crâne exposé à l’aide d’une paire de ciseaux. Retirez le crâne avec une pincette.
- S’il est nécessaire de marquer la position du bregma et lambda, retirez d’abord un hémisphère du crâne. Insérer les aiguilles minces tungstène dans le cerveau aux positions du bregma et lambda sur le crâne restant sur le cerveau, puis retirez le crâne restant.
Remarque : Le cerveau peut être stocké dans du PBS à 4 ° c.
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Pour effectuer la souillure d’anticorps de neurones inhibiteurs, couper les échantillons de cerveau en tranches.
- Placer l’échantillon de cerveau sur un vibratome.
- Couper en tranches jusqu'à 500 µm d’épaisseur dans du PBS à température ambiante et passez à l’étape 5 (la méthode AbScale).
- Si l’anticorps n’est pas nécessaire, découper l’échantillon de cerveau à bloque (jusqu'à 3 mm d’épaisseur) à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 3) et passez à l’étape 4 (méthode SeeDB).
Remarque : Le cerveau peut être stocké dans du PBS à 4 ° C après la coupe ou la tondeuse. La méthode de SeeDB est préférable lorsque l’anticorps n’est pas nécessaire car elle nécessite moins de temps que la méthode de e AbScal.
4. compensation sans anticorps coloration (méthode SeeDB)
- Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 20 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 4 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 40 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 4 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 60 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 4 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 80 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 12 heures avec agitant doucement à température ambiante.
- Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 100 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 12 heures avec agitant doucement à température ambiante.
- Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de 0,5 % α-thioglycérol et de 80,2 % (p/p) fructose et il incuber pendant 24 h avec agitant doucement à température ambiante.
NOTE : Manipuler l’échantillon avec précaution pour garder les déformations aussi petit que possible. Pas Incuber les échantillons est retardee, comme échantillons peuvent rapidement devenir opaques. - Incorporer l’échantillon dans une chambre d’imagerie remplie de la solution de fructose de 80,2 % (Figure 1 b). Si nécessaire, fixez l’exemple en mettant des petits morceaux d’adhésif de caoutchouc autour. Si la chambre est trop profonde, mettre une plaque de sol dans la chambre avant de placer les échantillons.
- Placez la boîte de Pétri avec un couvercle en verre sur la chambre d’imagerie et mettre de l’eau dans le plat et l’image à l’aide de la microscopie confocale ou deux photons avec une immersion en eau long objectif de distance de travail. Longueurs d’onde excitation et filtres d’émission sont décrites dans le tableau 1. Si nécessaire, utilisez une platine motorisée.
5. compensation avec anticorps coloration (AbScale méthode)
- Préparer des réactifs comme décrit dans le tableau 2.
- Transférer les tranches à l’aide d’une spatule dans un tube en plastique de 5 mL contenant 4 mL de solution de Sca/eS0 et les incuber pendant 12 h avec agitation douce à 37 ° C (Figure 4 b).
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de solution de Sca/eA2 et incuber les tranches pendant 36 h avec agitant doucement à 37 ° C.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de solution de Sca/eB4 et incuber les tranches pendant 24 h avec agitant doucement à 37 ° C.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de solution de Sca/eA2 et incuber les tranches pendant 12 h avec agitation douce à 37 ° C.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de PBS et incuber les tranches pendant 6 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Retirer délicatement les tranches dans un tube en plastique de 2 mL à l’aide d’une spatule.
- Incuber les anticorps primaire (tableau 3) dans 1 mL de solution d’AbScale pendant 48 à 72 h à 37 ° C (Figure 4) avec agitant doucement.
- Retirer délicatement les tranches pour un tube de plastique de 5 mL à l’aide d’une spatule.
- Incuber dans 4 mL de solution d’AbScale 2 h 2 fois à température ambiante avec agitant doucement.
- Retirer délicatement les tranches dans un tube en plastique de 2 mL à l’aide d’une spatule.
- Incubez avec anticorps secondaires marqués fluorescent (Table des matières, 1/100) dans 1 mL de solution d’AbScale pendant 48 h à 37 ° C sous agitation douce.
- Retirez les tranches à l’aide d’une spatule pour un tube de plastique de 5 mL contenant 4 mL de la solution de elAbSca délicatement et incuber les tranches pendant 6 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de la solution de elAbSca et incuber les tranches pendant 2 h 2 fois avec agitant doucement à température ambiante.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette et ajouter 4 mL de 4 % PFA et incuber les tranches pendant 1 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de PBS et incuber les tranches pendant 1 h avec agitant doucement à température ambiante.
- Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de la solution de Sca/eS4 et incuber les tranches pendant 12 h avec agitation douce à 37 ° C.
- Placez la cale sur une lame de verre et placer les tranches dans l’entretoise et plonger les tranches avec Sca/eS4 solution. Sceller l’entretoise avec une lamelle couvre-objet (Figure 1).
- Mettre de l’eau sur la lamelle couvre-objet et l’image à l’aide de la microscopie confocale ou deux photons avec une immersion en eau long objectif de distance de travail. Si nécessaire, utilisez une platine motorisée.
Remarque : Vérifiez si les parties profondes de l’échantillon sont étiquetés de la même façon sur les parties superficielles à confirmer l’absence d’un biais important d’étiquetage.
Remarque : La pénétration des anticorps testés est décrit dans le tableau 3.
6. cellule détermination de Position
- Pour chaque poste dans les images scannées, calculer les valeurs de corrélation à l’aide d’une image en trois dimensions filtre14 (Figure 5 a-5D).
- Déterminer les positions des sommets de la valeur de corrélation (Figure 5).
- Examinez les images autour des sommets de localiser les cellules (Figure 5E).
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Representative Results
Nous marqué des neurones de projection corticale par l’expression de tdTomato dans Tlx3-cre/Ai9 souris transgéniques et visualisé des neurones de projection cérébrale secondaire par l’injection du traceur rétrograde CTB488 dans la protubérance. L’hémisphère gauche du cerveau était soumis à la méthode SeeDB et analysés à l’aide d’un microscope biphotonique avec une immersion en eau long objectif de distance de travail (25 X, N.A. 1,1, distance de travail 2 mm) et une platine motorisée. Une pile de 401 images (512 x 512 pixels, taille du pixel = 0.99 µm) à z-étape = 2,8 µm à chacune de 30 postes de numérisation a été obtenue. Les corps cellulaires des deux types cellulaires étaient visibles sur une large gamme de zones du cerveau (Figure 6) et des sections optiques a montré microcolumns périodique (Figure 7 a). En outre, le cerveau des souris Crym-egfp (maintenus comme hétérozygotes avec un fond de C57BL/6J) ont été effacé par la méthode SeeDB et imagé comme indiqué ci-dessus. Les corps cellulaires et les dendrites apicaux des neurones de projection Sub cérébrale exprimant EGFP étaient visibles dans les sections optiques (Figure 7 b).
Nous avons également effectué marquage rétrograde des neurones de projection Sub cérébrale chez les souris C57BL/6J en utilisant CTB488. Le cerveau fixe a été coupé en tranches coronales avec une épaisseur d’environ 500 µm et soumis à la méthode d’elAbSca d’étiqueter les cellules exprimant parvalbumine (Anti-parvalbumine, 1/1000 ; Anti-souris IgG-fluorescent étiquetée,). Images de la pile (512 x 512 pixels, taille du pixel = 1.24 µm ; z-étape = 2,17 µm, 268 images/pile) ont été obtenues à l’aide de la microscopie confocale avec une immersion en eau long objectif de distance de travail (20 X, N.A. 1.0, distance de travail 2 mm). Neurones de projection Sub cérébrale et les cellules exprimant parvalbumine étaient visibles dans les tranches (Figure 7).
Figure 1 : imagerie chambers et entretoises. Haut (A) : la main à fond de verre plat de Pétri (à droite) et une boîte de Pétri sans un fond de verre (à gauche). En bas : Une chambre (à droite) et les plaques de fond (à gauche) fait de feuilles de silicone. (B) un hémisphère de souris après que injection de CTB555 dans le colliculus supérieur est définie dans la chambre de l’objet à la méthode SeeDB. L’échantillon est fixé avec un morceau d’adhésif réutilisable. (C), une lame de verre (en haut) et une entretoise faite d’une feuille de silicone d’une épaisseur de 0,5 mm (en bas). (D) deux tranches coronales du cerveau de souris ont été mis dans l’entretoise et recouvert d’une lamelle couvre-objet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : injection de traceur. Pipette en verre (A) A relié à une seringue de Hamilton à travers un tube en plastique. (B) une souris est placée sur un instrument stéréotaxique. La pipette de verre est inclinée à environ 60° vers l’arrière de l’axe vertical pour l’injection dans le colliculus supérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : coupe des échantillons de cerveau. Échantillon de cerveau entier (A) après injection de CTB555 dans le colliculus supérieur et de la fixation. Le bregma et lambda ont été marqués avec des aiguilles de tungstène (pointes de flèche). (B) le même échantillon écrêté afin d’obtenir un hémisphère. Notez que les aiguilles de tungstène restent (pointes de flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Immersion des échantillons de cerveau dans les solutions pour les méthodes d’elSeeDB et AbSca. (A) un échantillon de l’hémisphère plongé dans 0,5 % α-thioglycérol et 20 % (p/v) de fructose pour la méthode SeeDB. (B) les tranches coronales immergés dans la solution Sca/eA2 pour la méthode de e AbScal. (C) tranches coronales immergés dans la solution de AbScale contenant des anticorps pour la méthode de e AbScal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : détermination de la position de la cellule. Neurones de projection Sub cérébrale ont été marquées par l’injection du traceur rétrograde CTB488 dans la protubérance à 5 semaines d’âge. L’hémisphère gauche a été soumis à la méthode SeeDB et analysé par microscopie biphotonique (512 x 512 pixels, taille du pixel = 0.99 µm ; z-étape = 2,8 µm, 601 images/pile). (A) A seule image. (B) cinq images d’une pile d’image unique. (C) l’image filtre utilisé pour détecter des neurones de projection Sub cérébrale marqués au CTB. (D) les valeurs de corrélation calculés pour les cinq images dans (B) en utilisant le filtre au point C. (E) exemples de neurones de projection Sub cérébrale détectée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : résultats représentatifs de l’imagerie à grande échelle. Neurones de projection corticale (verts) ont été marquées par l’expression tdTomato dans Tlx3-cre/Ai9 souris transgéniques, et neurones de projection Sub cérébrale (magenta) ont été visualisées en injectant le traceur rétrograde CTB488 dans la protubérance à 7 semaines de âge. L’hémisphère gauche a été soumis à la méthode SeeDB et la zone µm 1 250 à 2 690 µm latérale et-3,400 µm à 1 230 µm avant le bregma a été analysés à l’aide de la microscopie biphotonique. Vue de dessus (A). Les positions approximatives des aires corticales ont été montrées. (B–D) Vue oblique de la CTB 488 fluorescence montrant des neurones de projection cérébrale secondaire (B), fluorescence tdTomato montrant des neurones de projection corticale (C) et l’image fusionnée (D). A: antérieure ; P: postérieur ; M: médiale ; D: dorsale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : photographies de fort grossissement des résultats représentatifs. (A) une coupe optique de l’image dans la Figure 6. Image d’épaisseur = 20 µm. (B) neurones de projection cérébrale secondaire marqué EGFP dans Crym-egfp souris hétérozygote à 6 semaines d’âge. Épaisseur d’image = 30 µm. (C) Subcerebral projection neurones (magenta) ont été marquées par l’injection de CTB488 dans la protubérance de souris C57BL/6J à jour après la naissance des cellules 49 et exprimant le parvalbumine (verts) ont été visualisées par la méthode de e AbScal. Épaisseur d’image = 55 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Fluorophore | Ex. (nm) | Filtre (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1 000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tableau 1 : Excitation longueurs d’onde et filtres pour microscopie biphotonique.
Tableau 2 : réactifs pour la méthode de e AbScal. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
| Antigène | Animal vacciné | ID de produit | Concentration de | bloc de 3 mm | Tranche de 500 μm |
| NeuN | Souris | MAB377 | 1/500 | ND | + |
| NeuN | Lapin | ABN78 | 1/500 | ND | + |
| CTIP2 | Rat | ab18465 | 1/100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Souris | ab51502 | 1/100 | - | - |
| GAD67 | Souris | MAB5406 | 1 : 200 | ND | + |
| GABA | Lapin | A2052 | 1/100 | - | - |
| Parvalbumine | Souris | 235 | 1/1000 | ND | + |
| Parvalbumine | Chèvre | PV-Go-Af460 | 1/100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumine | Souris | P3088 | 1/1000 | ND | + |
| Parvalbumine | Lapin | ab11427 | 1/500 | ND | - |
| Somatostatine | Lapin | T-4103 | 1/1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Lapin | PC38 | 1/1000 | ND | + |
Tableau 3 : pénétration des anticorps testés. Résulats de 3 mm d’épaisseur blocs apparaît comme suit : L1-L6 : pénétration dans l’épaisseur corticale ensemble ; L1-L2/3 : pénétration jusqu'à couche 2/3 ; - : aucun étiquetage ; ND : non déterminé. Résulats de la 500 µm d’épaisseur tranches est indiqué comme suit : + : marquage uniforme ; - : aucune ou limité d’étiquetage.
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Discussion
Nous avons présenté les procédures pour obtenir des images en trois dimensions à grande échelle de l’organisation spécifique du type de cellule des types de grandes cellules en couche néocorticales souris 5. Par rapport à la coloration de la tranche conventionnelle, la méthode est plus utile dans la détermination de l’organisation en trois dimensions du néocortex. La méthode permet l’acquisition d’images de la plus large et les régions plus profondes du cerveau par rapport à la typique en vivo la microscopie 2 photons ou en microscopie confocale classique et, ainsi, peuvent permettre l’analyse détaillée de la néocorticale cellulaire Organisation.
Une étape essentielle de la méthode est la pénétration de l’anticorps. Un sous-ensemble des anticorps montre la faible pénétration des spécimens épais (tableau 3) et, par conséquent, ne peut servir pour la méthode de e AbScal. Pour obtenir un marquage uniforme avec les anticorps utilisés dans cette étude, il fallait couper le cerveau tranches de 500 µm. L’utilisation de plus petits fragments d’anticorps, par exemple, Fab ou F(ab') 2 fragments et/ou autres méthodes21,22,23,24,25,26, de compensation 27,28 peut améliorer les résultats.
Spécificité d’antigène anticorps se caractérise habituellement dans des tranches minces de tissu, mais peut être différent dans les tissus épais traité pour la compensation. Pour contrôler la spécificité de l’anticorps, nous avons étiqueté conjointement avec l’expression des gènes traceur injection et marqueur chez les animaux transgéniques, les tissus ainsi qu’à blocage expériences utilisant des antigènes de protéines et peptides14. Ces procédures et les expériences de contrôle à l’aide d’animaux mutants dépourvus les antigènes cibles devraient être utiles pour confirmer la spécificité des anticorps.
Une limitation de la méthode est qu’une déformation de l’échantillon est inévitable en raison de la manipulation des échantillons en vrac souple. Obtention en vivo images avant la fixation et l’utilisation de ces images comme références aidera à corriger ces déformations.
Les présentes procédures ont été conçus pour l’analyse de néocorticale couche 5. Des analyses récentes ont identifié de nombreux marqueurs moléculaires qui étiquette des types de cellules neuronales dans autres couches4,5,6,7, et l’application de ces fabricants à la méthode actuelle peut permettre identification de l’organisation cellulaire importante dans les autres couches. En outre, il devrait être possible d’effectuer des analyses similaires dans les autres régions cérébrales que le néocortex et dans les organes autres que le cerveau, pour déterminer si une organisation cellulaire précise semblable à microcolumns est présente.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Atsushi Miyawaki et Hiroshi Hama pour leurs conseils sur les expériences de elAbSca, Charles Yokoyama pour l’édition du manuscrit, Eriko Ohshima et Miyuki Kishino pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des fonds de recherche du RIKEN T.H. et subventions pour la recherche scientifique du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT) du Japon pour T.H. (domaines innovants « Mésoscopique neuronaux » ; 22115004) et S.S. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
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