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Bioengineering

एक उल्टे अभिविंयास में एक दबाव थैली के अंदर पूरे मानव दिल की Decellularization

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Regenerative Medicine Research, Texas Heart Institute, 2Lifegift Organ Donation Center, 3Biomedical Engineering, Texas A&M University

Summary

इस विधि में सक्षम बनाता है एक जटिल ठोस अंग का उपयोग कर एक सरल आसमाटिक सदमे के आधार पर प्रोटोकॉल और ईओण डिटर्जेंट के छिड़काव ंयूनतम अंग मैट्रिक्स व्यवधान के साथ । यह प्रवाह गतिशीलता और सेलुलर मलबे बहिर्वाह की वास्तविक समय की निगरानी के साथ एक दबाव थैली के अंदर मानव दिलों के लिए एक उपंयास decellularization तकनीक शामिल हैं ।

Abstract

अंतिम चरण के दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए परम समाधान अंग प्रत्यारोपण है । लेकिन दाता दिल सीमित हैं, प्रतिरक्षादमन की आवश्यकता है, और अंततः अस्वीकृति हो सकता है । एक कार्यात्मक, ऑटोलॉगस जैव कृत्रिम दिल बनाने इन चुनौतियों का समाधान हो सकता है । पाड़ और कोशिकाओं के शामिल एक दिल का एक विकल्प है । ऊतक के साथ एक प्राकृतिक पाड़ विशिष्ट संरचना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सूक्ष्म और स्थूल वास्तुकला मनुष्यों या सूअरों जैसे बड़े जानवरों से decellularizing दिल से प्राप्त किया जा सकता है । Decellularization 3 डी extracellular मैट्रिक्स और vasculature के संरक्षण और एक बाद में timepoint पर "cellularization" की अनुमति, जबकि सेलुलर मलबे धोने शामिल है । हमारे उपंयास को खोजने कि जटिल अंगों के छिड़काव decellularization संभव है पर कैपिटल, हम एक अधिक "शारीरिक" विधि विकसित करने के लिए उंहें एक दबाव थैली के अंदर रखकर गैर प्रत्यारोपण मानव दिल decellularize, एक औंधा में अभिविन्यास, नियंत्रित दबाव के तहत. एक दबाव थैली का उपयोग करने के प्रयोजन के लिए यह बंद रखने और रोधगलन छिड़काव में सुधार करने के लिए महाधमनी वाल्व के पार दाब ढाल बनाने के लिए है । decellularization के दौरान प्रवाह गतिशीलता और सेलुलर मलबे हटाने के एक साथ आकलन हमें दोनों द्रव बहिर्वाह और मलबे बहिर्वाह पर नजर रखने के लिए अनुमति दी है, जिससे एक पाड़ है कि या तो सरल हृदय की मरंमत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पैदा (जैसे एक पैच या वाल्व पाड़) या एक पूरे अंग पाड़ के रूप में ।

Introduction

दिल की विफलता रोगियों में उच्च मृत्यु की ओर जाता है । अंतिम चरण के दिल की विफलता के लिए परम उपचार विकल्प एलो-ट्रांसप्लांटेशन है । हालांकि, दाता अंगों की कमी के कारण प्रत्यारोपण के लिए एक लंबी प्रतीक्षा सूची है, और रोगियों के बाद प्रत्यारोपण बाधाओं का सामना करना है कि जीवन से लेकर लंबे समय तक प्रतिरक्षादमन जीर्ण अंग अस्वीकृति1,2। एक रोगी की खुद की कोशिकाओं के साथ मानव-आकार के दिलों को बसाने के द्वारा इंजीनियरिंग कार्यात्मक दिल इन बाधाओं3दरकिनार सकता है ।

"इंजीनियरिंग" एक दिल में एक प्रमुख कदम उचित नाड़ी और parenchymal संरचना, रचना और समारोह के साथ एक पाड़ के निर्माण के लिए संरेखण और वितरित कोशिकाओं के संगठन का मार्गदर्शन है । उचित ढांचे की उपस्थिति में, मचान पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को पर्यावरण की पहचान और उस अंग के भाग के रूप में अपेक्षित समारोह प्रदर्शन करना चाहिए । हमारी राय में, सेलुलर अंग extracellular मैट्रिक्स (dECM) आदर्श पाड़ की आवश्यक विशेषताओं शामिल हैं ।

आंतरिक vasculature का उपयोग करके, जटिल पूरे अंग decellularization नाजुक 3 डी extracellular मैट्रिक्स और vasculature2के संरक्षण, जबकि सेलुलर घटकों को दूर करने के लिए antegrade या प्रतिगामी छिड़काव4 के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, 5,6,7. एक कार्यात्मक vasculature इंजीनियरिंग पूरे अंगों में महत्वपूर्ण है बस के रूप में यह vivo मेंहै, पोषक तत्व वितरण और अपशिष्ट हटाने8के लिए । कोरोनरी छिड़काव decellularization चूहों4, या सूअरों से सेलुलर दिल बनाने में प्रभावी साबित किया गया है4,7,9,10,11 ,12,13, और मनुष्यों5,7,14,15,16। फिर भी, वाल्व, atria और अंय "पतली" क्षेत्रों की अखंडता पीड़ित कर सकते हैं ।

मानव आकार के हृदय पाड़ों दबाव नियंत्रण का उपयोग कर सूअरों से प्राप्त किया जासकता 7,9,10,11,12 या अर्की प्रवाह दर नियंत्रण13, 17 और मानव दाताओं से दबाव नियंत्रण5,7,14,15का उपयोग कर । मानव दाता दिलों की Decellularization दबाव में 80-100 mmHg पर नियंत्रण के तहत 4-8 दिनों में ईमानदार अभिविन्यास5,15,16 या दबाव के तहत 16 दिनों में ६० mmHg14 पर नियंत्रित होता है . antegrade, दबाव नियंत्रित decellularization के तहत, महाधमनी वाल्व क्षमता महाधमनी रूट पर कोरोनरी छिड़काव दक्षता और स्थिर दबाव को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमारे पिछले काम से पता चला है कि दिल के उंमुखीकरण decellularization प्रक्रिया के दौरान अपनी कोरोनरी छिड़काव दक्षता और इसलिए9अंत में पाड़ अखंडता को प्रभावित करता है ।

हमारे पिछले9काम के एक निरंतरता के रूप में, हम एक उपंयास अवधारणा जिसमें एक पेरीकार्डियम-पाउच की तरह पूरे दिल decellularization में सुधार जोड़ा है परिचय । हम दबाव पाउच के अंदर रखा मानव दिल के decellularization का वर्णन, व्युत्क्रम उंमुख, और महाधमनी रूट पर १२० mmHg पर नियंत्रण के तहत दवाब । इस प्रोटोकॉल decellularization प्रक्रिया भर में प्रवाह प्रोफ़ाइल और बहिर्वाह मीडिया के संग्रह की निगरानी के लिए कोरोनरी छिड़काव दक्षता और कोशिका मलबे हटाने का मूल्यांकन भी शामिल है । जैव रासायनिक परख तो विधि की प्रभावशीलता का परीक्षण किया जाता है ।

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Protocol

सभी प्रयोगों का पालन टेक्सास हार्ट इंस्टीट्यूट से एथिक्स कमेटी के दिशानिर्देशों पर किया गया ।

1. अंग तैयारी

नोट: LifeGift के सहयोग से, टेक्सास में एक nonprofit अंग खरीद संगठन (http://www.lifegift.org), दान के लिए उपयुक्त नहीं मानव दिल प्रत्यारोपण के लिए अनुमोदित सहमति के साथ अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया गया ।

  1. दिल की खरीद करने के लिए, नसों में ३०,००० यू हेपरिन दिलों को भ्रमित । सुरक्षित रूप से महाधमनी में cardioplegia प्रवेशनी टांका और एक clamped छिड़काव लाइन संलग्न । छिद्रित अवर वेना कावा (IVC) को सही हृदय से उतारें. या तो छोड़ दिया बेहतर फुफ्फुसीय नस या छोड़ दिया अलिंद संलग्न करने के लिए दिल के बाएं चैंबर वेंट ।
  2. cardioplegia या heparinized खारा के 1 L को डिफ्यूज करे । काटना महाधमनी आर्क शाखाओं, सुपीरियर वेना कावा (SVC) और अन्य फुफ्फुसीय नसों को किसी भी नाड़ी या आसपास के ऊतक लगाव से दिल को रिहा करने के लिए । ठंडी खारा समाधान में अच्छी तरह से heparinized दिल जलमग्न ।
  3. दान मानव हृदय (दोनों पूर्वकाल और पीछे, चित्रा 1) का निरीक्षण करें । एक विदारक ट्रे पर दिल रखें और किसी भी संरचनात्मक क्षति या संरचनात्मक विकृतियों के लिए निरीक्षण किया । यदि यकृत और/या फेफड़ों प्रत्यारोपण के लिए खरीद रहे थे, दिल एक छोटी अवर वेना कावा के साथ उपस्थित हो सकता है और/
  4. संभावित दोषों के लिए आंतरिक निरीक्षण करें-अलिंद septal दोष (एएसडी), वेंट्रिकुलर septal दोष (VSD), या वाल्व (महाधमनी, पल्मोनरी, mitral, त्रिकपर्दी) कुरूपता.
  5. यदि एक septal दोष मौजूद है, यह उचित टांके (चित्रा 2a, बी) के साथ सही । septal दोषों के सुधार के लिए फुफ्फुसीय धमनी (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) बहिर्वाह turbidity माप के माध्यम से decellularization प्रगति पर नजर रखने की जरूरत है । septal दोष के सुधार सही अलग धकेलना करने के लिए छोड़ दिया, इसलिए, फिलीस्तीनी अथॉरिटी से बहिर्वाह कोरोनरी साइनस के माध्यम से कोरोनरी परिसंचरण से बहिर्वाह का प्रतिनिधित्व करता है ।
  6. Ligate सुपीरियर और अवर वेना कावा विथ 2-0 सिल्क सीवन (फिगर 2c).
  7. काटना महाधमनी (ए ओ) के बाद cannulation के लिए मुख्य पीए (चित्रा 2d) से दूर ।
  8. कनेक्टर्स डालें, पोत के व्यास के आधार पर, (चित्रा 3) ए ओ और फिलीस्तीनी अथॉरिटी में और उंहें 2-0 रेशम टांके (4a आंकड़ा) के साथ सुरक्षित ।
  9. बाईं atrium के माध्यम से एक टयूबिंग लाइन डालें (चित्रा 4B) और बाईं निलय (एल. वी.) (चित्रा 3) की ओर, फुफ्फुसीय शिरा छिद्रों में से एक का उपयोग कर.
  10. फिलीस्तीनी अथॉरिटी में एक के लिए ए ओ और बहिर्वाह लाइन में रखा संबंधक के लिए एक अर्क लाइन कनेक्ट (चित्रा 3) ।
  11. एक पॉलिएस्टर थैली में औंधा अभिविंयास (उल्टा) में तैयार दिल प्लेस ।
  12. पाउच को दिल से छिड़काव कंटेनर में रखें और ढक्कन (फिगर 4c) को बंद कर दीजिये ।
  13. रबड़ डाट में संबंधित बंदरगाहों के लिए लाइनों के प्रत्येक कनेक्ट (कंटेनर के व्यास के आधार पर) और छिड़काव कंटेनर के ढक्कन करने के लिए डालने के लिए पॉलिएस्टर थैली सील (चित्रा 4c और चित्रा 5B).
  14. Perfuse 1x फास्फेट (पंजाब) (१३६ mM NaCl) खारा बफर २.७ मिमी KCl, 10 मिमी ना2HPO4 और १.८ मिमी KH2PO आसुत पानी में4 , पीएच ७.४) रबर डाट के अर्क बंदरगाह के माध्यम से फिलीस्तीनी अथॉरिटी से बहिर्वाह और लाइन से सत्यापित करने के लिए LV में डाला.
  15. vasculature में रक्त के किसी भी अवशिष्ट निशान के अंग को साफ करने के लिए इस प्रवाह का उपयोग करें । प्रवाह मनाया नहीं है, तो वे ढीला हो सकता है के रूप में कनेक्शन लाइनें कस ।

2. सिस्टम सेटअप और अंग Decellularization प्रक्रिया

  1. एक ईमानदार अभिविंयास (चित्रा 5) में एक प्रतिक्रिया और जगह इकट्ठा । छिड़काव प्रणाली में एक पर्सनल कंप्यूटर (पीसी), आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (PID) नियंत्रक, ए ओ इन्फ्यूश़न के लिए एक सिकुड़नेवाला पम्प, एक छिड़काव, वी. एल. perfusate प्रतिधारण के लिए एक दबाव सिर कंटेनर (नीचे के साथ 2L aspirator बोतल शामिल है sidearm), और एक सिकुड़नेवाला पंप दबाव सिर कंटेनर से अतिरिक्त तरल पदार्थ नाली और फिलीस्तीनी अथॉरिटी से बहिर्वाह इकट्ठा करने के लिए ।
  2. रबर पट में, अर्क रेखा, दबाव सिर लाइन, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-बहिर्वाह लाइन और छिड़काव के शीर्ष पर रखा रबर टोपी सतह बंदरगाहों के लिए प्रतिक्रिया की रेखा draining लाइन कनेक्ट (चित्रा 5 ए) है ।
  3. १२० mmHg के लगातार दबाव के तहत Decellularize दिलों महाधमनी जड़ पर मापा । LV का मतलब दबाव पूरे decellularization प्रक्रिया के दौरान 14-18 mmHg के भीतर होना चाहिए ।
  4. Decellularize दिलों के रूप में इस प्रकार है: hypertonic समाधान के 4 एच (५०० mm NaCl), hypotonic समाधान के 2 ज (20 मिमी NaCl), सोडियम dodecyl सल्फेट (1% एसडीएस) के १२० एच समाधान, और 1x पंजाबियों के १२० एल के साथ एक अंतिम धोने (चित्रा 6A) ।
  5. लगातार दबाव नियंत्रण (१२० mmHg) के तहत दिलों को Decellularize । ए ओ में अर्का प्रवाह दर दिल पर निर्भर है और है, औसत पर, 98.06 ± 16.22 मिलीलीटर/hypertonic समाधान के लिए, 76.14 ± 7.90 एमएल/hypotonic समाधान के लिए मिनट, 151.50 ± 5.76 एमएल/एसडीएस के लिए मिनट, और 185.24 ± 7.10 मिलीलीटर/ प्रत्येक रिएजेंट फलां की कुल भस्म मात्रा 23.36 ± 5.70 l के लिए hypertonic समाधान और 9.13 ± 1.26 l के लिए hypotonic समाधान ।
  6. एसडीएस छिड़काव के अंत तक 1% एसडीएस (दिल के वजन के प्रति ग्राम 1 एल) के अंतिम ६० एल परिचालित । चित्रा 6A decellularization प्रक्रिया के लिए एक समय रेखा से पता चलता है, डेटा संग्रह के लिए अंतिमबिंदु: प्रवाह दर निगरानी (ए ओ और फिलीस्तीनी अथॉरिटी) और बहिर्वाह संग्रह (फिलीस्तीनी अथॉरिटी और गैर पीए) दबाव सिर से decellularization के दौरान ।
  7. चूँकि SVC और IVC ligated हैं, इसलिए यह मान लेना उचित है कि पीए से एकत्रित सभी द्रव वास्तविक कोरोनरी छिड़काव (फिगर 5B) का परिणाम है. कोरोनरी छिड़काव दक्षता का निर्धारण सीधे perfusate के प्रवाह की दर से बाहर फिलीस्तीनी अथॉरिटी में संचार के प्रवाह की दर से विभाजन द्वारा ए ओ में:
    कोरोनरी छिड़काव दक्षता Equation = (%).
  8. पीए और एल. वी. से प्राप्त perfusate के तुलनात्मक विश्लेषण प्रदर्शन और २०० μL प्रति अच्छी तरह से एक स्पष्ट नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट और २८० एनएम में पढ़ने के अवशोषण को लोड करके डुप्लिकेट में संचार समाधान । भिंन मानों को आज़माने के बाद, चयनित empirically को, श्रेष्ठ सामान्यीकृत मान देने के लिए, अवशोषक मान ।
  9. नियंत्रण के रूप में स्वच्छ संचारी एजेंट के turbidity का उपयोग करें । बहिर्वाह perfusate के turbidity सेल मलबे के वॉशआउट का प्रतिनिधित्व करता है और प्रक्रिया के एक ट्रैकिंग उपकरण के रूप में decellularization के दौरान तुरन्त quantified जा सकता है ।
  10. 1x पंजाब के 10 एल के साथ अंतिम धोने के दौरान, बाँझ की ५०० मिलीलीटर बेअसर २.१% peracetic एसिड समाधान, 10N NaOH के साथ बेअसर, एक ०.१% peracetic एसिड समाधान के लिए अग्रणी (वी/ इस समाधान का उपयोग पाड़ को निष्फल करने के लिए करें ।

3. सेलुलर दिल का मूल्यांकन

नोट: decellularization के बाद, प्रतिनिधि दिल कोरोनरी एंजियोग्राम इमेजिंग और जैव रासायनिक परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

  1. कोरोनरी vasculature की अक्षुण्णता की जांच करने के लिए प्रतिनिधि सेलुलर मानव दिल की कोरोनरी एंजियोग्राफी प्रदर्शन. संक्षेप में, मुख्य दाएं और बाएं कोरोनरी धमनियों में कोरोनरी ostial प्रवेशनी के माध्यम से विपरीत एजेंट के इंजेक्शन के बाद एक fluoroscope, छवि सेलुलर मानव दिल का उपयोग कर ।
  2. काटना से नमूने प्राप्त करने के लिए 19 क्षेत्रों से नमूनों को शेष deoxyribonucleic एसिड (डीएनए), glycosaminoglycan (ढकोसला) और एसडीएस के ऊतकों में स्तर का मूल्यांकन करने के लिए । निलय से दिल का आधार निकालें और निलय को 4 बराबर वर्गों (figure 6C) में काटना. पूर्वकाल और पीछे सही निलय (आर. पी.), पूर्वकाल और पीछे LV, और interventricular पट (IVS) में प्रत्येक अनुभाग विभाजित । शीर्ष से युक्त ऊतक की सैंपलिंग के लिए LV और आर. वी. में विच्छेदित है ।
  3. कट डीएनए, चुप और एसडीएस परख के लिए ऊतक के नमूनों (~ गीला वजन के 15 मिलीग्राम) ।
  4. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए 1 मीटर NaOH में नमूनों को पचाने और 10x Tris-EDTA (ते) बफर और 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) का उपयोग कर 7 को पीएच समायोजित करके डबल-फंसे डीएनए (dsDNA) निकालें ।
  5. यों dsDNA एक बछड़ा थाइमस मानक के साथ एक dsDNA परख किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग कर डुप्लिकेट में नमूने पढ़ें (४८० एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन ५२० एनएम पर) । cadaveric (% cadaveric) में उस करने के लिए प्रत्येक ऊतक में dsDNA एकाग्रता की तुलना करके सेलुलर दिल में अवशिष्ट dsDNA के प्रतिशत की गणना ।
  6. 3 घंटे के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक papain निष्कर्षण समाधान (EDTA disodium नमक, cysteine एचसीएल, सोडियम एसीटेट, और papain के साथ ०.२ मीटर सोडियम फास्फेट बफर) में ऊतक के नमूनों को पचाने के द्वारा समाधान में किया गया सल्फेट प्राप्त करें । उपाय ढकोसला सामग्री (डुप्लिकेट में) एक Glycosaminoglycan परख किट का उपयोग करके ।
  7. एक गर्म निर्वात में एसडीएस परख के लिए Lyophilize नमूने और सूखी वजन उपाय । प्रत्येक सूखे नमूने के लिए ultrapure पानी की २०० µ एल जोड़ें और समाधान में अवशिष्ट एसडीएस निकालने के लिए homogenize । इस एसडीएस सॉल्यूशन को क्लोरोफॉर्म और एक methylene ब्लू सॉल्यूशन (०.०१ एम एचसीएल के 1 एल में methylene ब्लू के 12 मिलीग्राम) मिलाएं । एसडीएस methylene नीले रंग के लिए बाध्यकारी द्वारा कार्बनिक परत में अलग होगा ।
  8. एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग करना, अवशोषित (६५५ एनएम) मानकों और नमूनों की डुप्लिकेट में अवशिष्ट एसडीएस की गणना करने के लिए पढ़ें । इस एसडीएस मान को सामान्य करने के लिए ऊतक शुष्क वजन.
  9. decellularization के बाद सेलुलर हटाने की पुष्टि करने के लिए रैखिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (NLOM) के साथ मानव दिल के मोटे क्षेत्रों (यानी, एल. वी. , RV और पट) से छवि नमूने । NLOM सेटअप हमारे पिछले प्रकाशनों में विस्तृत है18,19,20। NLOM अपने दो फोटॉन प्रतिदीप्ति के माध्यम से छवि सेल, elastin, कोलेजन और मायोसिन फाइबर के लिए सक्षम बनाता है (TPF) और दूसरा सुरीले पीढ़ी (स्वसहायता समूहों) किसी भी exogenous दाग या21डाई का उपयोग कर के बिना चैनल.

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Representative Results

१२० mmHg के लगातार दबाव के तहत antegrade महाधमनी छिड़काव के साथ 7 दिन की decellularization के बाद मानव हृदय ने पारदर्शी (फिगर घमण्ड) कर दिया । दिल निहायत जैव रासायनिक (डीएनए, झूठ और एसडीएस) विश्लेषण (चित्रा 6C) के लिए 19 वर्गों में विच्छेदित किया गया अंतिम सेलुलर उत्पाद का मूल्यांकन ।

decellularization प्रक्रिया के दौरान, विभिंन समाधानों के अर्क प्रवाह की दर के रूप में विभिंन दबाव लगातार रखा गया था । ओ. ए. (चित्रा 7A) में प्रवाह की दर धीरे से कम 96.68 ± 23.54 से 80.59 ± 12.41 एमएल/मिनट (१६.६४%) छिड़काव समाधान hypertonic से hypotonic के रूप में बदल गया । इसके विपरीत, प्रवाह दर 71.68 ± 10.63 से 110.61 ± 14.40 एमएल के लिए वृद्धि हुई/(५४.३१%) जब छिड़काव हल hypotonic से एसडीएस बदल गया । एसडीएस छिड़काव के दौरान, अर्क प्रवाह दर 110 ± 14.40 और 176.31 ± 44.03 एमएल के बीच उतारा/ फिलीस्तीनी अथॉरिटी (चित्रा 7B) से बहिर्वाह दर शुरू में एक ऐसी ही प्रवृत्ति (चित्रा 7A) दिखाया । हालांकि, 1% एसडीएस छिड़काव के दौरान बहिर्वाह दर 35.77 ± 9.07 से 27.08 ± 4.09 मिलीलीटर के लिए कम/कोरोनरी छिड़काव दक्षता का इस्तेमाल महाधमनी वाल्व प्रत्यक्षता और इसी तरह की प्रवृत्तियों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । vasculature (फिगर 7C) के माध्यम से विभिन्न रिएजेंट perfused के रूप में समय के साथ दक्षता घटी । 1x पंजाबियों धोने के पहले घंटे के दौरान, छिड़काव दक्षता मूल पूर्व hypotonic समाधान मूल्य (1 पर 28.39 ± 2%-एच पंजाब बनाम 31.02 ± 7.16% पर 1-एच hypotonic) में बहाल किया गया था । कोरोनरी छिड़काव क्षमता मतलब 46.08 ± 9.89% थे, 28.08 ± 7.12%, 25.70 ± 5.30%, और 28.39 ± hypertonic समाधान, hypotonic समाधान, 1% एसडीएस के साथ, और 1x पंजाबियों, क्रमशः (आंकड़ा 7d) ।

चूंकि फिलीस्तीनी अथॉरिटी और LV से बहिर्वाह perfusate एक साथ एकत्र किए गए थे, उनके मलबे सामग्री की तुलना में किया जा सकता है (चित्रा 8A) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा २८० एनएम (चित्रा 8B) पर मापा अवशोषित । PA और LV से प्रवाह की turbidity प्रत्येक समाधान के छिड़काव के दौरान समय के साथ घटी; हालांकि, पीए से turbidity एक अधिक अचानक रंग परिवर्तन के रूप में है कि LV से मनाया प्रारंभिक छिड़काव अवधि के दौरान की तुलना में दिखाया । एक hypertonic से एक hypotonic समाधान करने के लिए स्विचन के बाद, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के turbidity से बदल 1.15 ± 0.03 से 1.40 ± 0.07 (२१.७३% वृद्धि) और एल. वी. से बदल 1.13 ± 0.05 से 1.24 ± 0.07 (९.७३% वृद्धि) । 1% एसडीएस छिड़काव के पहले घंटे के दौरान, turbidity के लिए 1.17 ± 0.04 से 2.77 ± 0.15 (१३६.७५% वृद्धि) फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए और 1.11 ± 0.04 के लिए 1.75 ± 0.26 (५६.६५% वृद्धि) LV प्रवाह के लिए बदल दिया । बहिर्वाह turbidity और कोशिका मलबे वॉशआउट के बीच सहसंबंध bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था जब प्रोटीन एकाग्रता बहिर्वाह नमूनों में quantified था । 6 मानव दिलों की decellularization से प्राप्त परिणामों आर2 = ०.९५ (चित्रा 8C) के साथ प्रोटीन एकाग्रता और प्रवाह turbidity के बीच एक रैखिक सहसंबंध का पता चला ।

पूरे हार्ट decellularization के पूरा होने के बाद, कोरोनरी एंजियोग्राम ने बरकरार कोरोनरी vasculature (फिगर 9) के संरक्षण की पुष्टि की । मोटे क्षेत्रों से मायोकार्डियम परतों की रैखिक ऑप्टिकल इमेजिंग (यानी, वी. आर. , एल. वी., और पट) मानव हृदय में कोशिका हटाने की पुष्टि की, के रूप में कोई सेल उपस्थिति TPF चैनल में मनाया गया था (चित्रा 10) । उनके autofluorescence के साथ कोशिकाओं (यानी, cardiomyocytes या कार्डियक fibroblasts) को आसानी से TPF चैनल में उनके अंडाकार और लंबी आकृति morphologies द्वारा पहचाना जा सकता है. decellularization प्रक्रिया और सेलुलर मलबे हटाने की प्रभावशीलता को सुनिश्चित करने के लिए, सेलुलर मानव दिल आगे 19 क्षेत्रों में सकल थे (चित्रा 6C) डीएनए के स्तर, सल्फेट परिहास, और उन क्षेत्रों में शेष एसडीएस । सभी क्षेत्रों में डीएनए cadaveric दिल के 10% से भी कम था । सही atrium में डीएनए (8.39%-१०.३८% cadaveric के सापेक्ष) और बाएं atrium (5.11%-७.६०%) उच्चतम (चित्रा 11A) था ।

Figure 1
चित्रा 1: एक अंग खरीद एजेंसी से Cadaveric मानव दिल । पूर्वकाल और cadaveric मानव दिल के पीछे विचार । अवर वेना कावा और सही atrium के एक हिस्से को याद कर रहे हैं, के रूप में धराशायी क्षेत्र में मनाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: septal और/या वाल्व शारीरिक विसंगतियों के लिए निरीक्षण । (क) निरीक्षण यदि पेटेंट फोरमेन ओवल (PFO) मौजूद है (दाएँ और बाएँ atrium के बीच संचार). (ख) एक 5-0 के टांके PFO बंद करने के लिए एक सतत फैशन में लागू किया जाता है । (ग) सही atrium 5-0 के एक चल सीवन के साथ बंद है । (घ) मुख्य फुफ्फुसीय धमनी को कुंद विच्छेदन द्वारा आरोही महाधमनी से दूर किया जाता है । फो: फोरमेन शाली है; पीए: फेफड़े की धमनी; ए ओ: महाधमनी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अर्क के घटक है । decellularization प्रणाली (क) 4 बंदरगाहों के साथ रबर टोपी से बना है; (ख) फेफड़े की धमनी (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) से जुड़े होने के लिए बहिर्वाह लाइन; (ग, च) कनेक्टर्स के लिए luer ताला के साथ पीए और महाधमनी (ए ओ), (घ) प्रविष्टि लाइन के लिए वाम निलय (एल. वी.), (ई) अर्क रेखा से कनेक्ट करने के लिए महाधमनी, (छ) पॉलिएस्टर पाउच, और (एच) छिड़काव कंटेनर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मानव हृदय cannulation और अर्का प्रतिक्रियात्मक विधानसभा । (क) फेफड़े की धमनी (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) और महाधमनी (ए ओ) व्यक्तिगत रूप से cannulated दिखा दिल का पूर्वकाल देखें । (ख) फेफड़े की नस (पीवी) के माध्यम से वाम निलय (एल. वी.) के लिए निर्देशित प्रवेशनी दिखा दिल का पीछे देखने । (ग) विधानसभा के बाद अर्की प्रतिक्रियाकर्ता के अंदर मानव हृदय. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: दबाव सिर के साथ उल्टे उंमुख decellularization के सिस्टम सेटअप । (क) पूर्ण decellularization प्रणाली से बना है: एक कंप्यूटर, एक आनुपातिक-अभिंन-व्युत्पंन (PID) नियंत्रक, पंप, एक प्रतिक्रिया, और जलाशयों फुफ्फुसीय धमनी (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) और वाम निलय (एल. वी.) से प्रवाह इकट्ठा करने के लिए । ए ओ: महाधमनी । तीर प्रवाह दिशा इंगित करता है । (ख) छिड़काव के अंदर मानव दिल के सेटअप की योजनाबद्ध प्रतिक्रिया और decellularization के दौरान perfusate/प्रवाह के जुड़े प्रवाह रास्तों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: decellularization प्रक्रिया और एक मानव हृदय के बाद decellularization परीक्षा के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (A) आरेख की decellularization कार्यविधि । (ख) एक सेलुलर मानव दिल के पूर्वकाल और पीछे परीक्षा । (ग) जैव रासायनिक परख विश्लेषण के लिए चार पार वर्गों में एक मानव हृदय के सकल विच्छेदन (खंड घ करने के लिए एक) । मानव दिलों में रंग अवशिष्ट lipofucin जमाव के कारण होता है । रंग आम तौर पर भीतरी वेंट्रिकुलर सतह या epicardium और मायोकार्डियम के बीच सीमा में प्रस्तुत करता है । ला: वाम atrium; रा: सही atrium; LV: वाम निलय; RV: दायां निलय; चींटी: पूर्वकाल; पोस्ट: पीछे; हाइपर: hypertonic; Hypo: hypotonic; एसडीएस: सोडियम dodecyl सल्फेट; पंजाबियों: फास्फेट खारा बफर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: decellularization के दौरान समय चूक प्रवाह गतिशीलता । (क) महाधमनी में decellularization समाधान के अर्क प्रवाह दर प्रक्रिया के दौरान । (ख) decellularization के दौरान पीए से प्रवाह की प्रवाह दर. (ग) decellularization के दौरान कोरोनरी छिड़काव दक्षता. (घ) विभिन्न समाधानों के छिड़काव के दौरान कोरोनरी छिड़काव क्षमता का अर्थ/ N = 6. डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. PA: फुफ्फुसीय धमनी; हाइपर: hypertonic; Hypo: hypotonic; एसडीएस: सोडियम dodecyl सल्फेट; पंजाबियों: फास्फेट बफर खारा; SEM: मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: decellularization के दौरान समय चूक सेल मलबे वॉशआउट । (क) फिलीस्तीनी अथॉरिटी और गैर फिलीस्तीनी अथॉरिटी (वाम निलय) से मीडिया संग्रह । (ख) २८० एनएम पर turbidity माप का परिणाम । (ग) प्रोटीन एकाग्रता और turbidity के बीच रैखिक सहसंबंध मौजूद है । n = 6 मानव दिल । नियंत्रण स्वच्छ decellularization समाधान था । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. PA: फुफ्फुसीय धमनी; हाइपर: hypertonic; Hypo: hypotonic; एसडीएस: सोडियम dodecyl सल्फेट; SEM: मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: एंजियोग्राम मानव हृदय की कोरोनरी thevascular प्रत्यक्षता decellularization के बाद पुष्टि करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10: छवियां cadaveric और प्रतिरूपण मायोकार्डियम से रैखिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त की कोशिकाओं का कोई मतलब नहीं दिखा (यानी, cardiomyocytes या हृदय fibroblasts) अंडाकार या लंबी आकार में morphologies के साथ एल. वी., आर. एण्ड पट. LV: वाम निलय; RV: दायां निलय; TPF: दोन फोटॉन प्रतिदीप्ति; स्वसहायता समूहों: दूसरी सुरीले पीढ़ी । कुछ हृदय कोशिकाओं तीर से संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: जैव रासायनिक परख परिणाम । (क) बचे हुए डीएनए के सापेक्ष cadaveric हृदय में सेलुलर ऊतक. (ख) में cadaveric दिल के सापेक्ष शेष चुप सेलुलर ऊतक । (ग) सेलुलर ऊतकों में एसडीएस शेष । n = 6 मानव दिल । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. LA: वाम atrium; रा: सही atrium; LV: वाम निलय; RV: दायां निलय; चींटी: पूर्वकाल; पोस्ट: पीछे; एसडीएस: सोडियम dodecyl सल्फेट; SEM: मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

विधि प्रो कांग्रेस
परम्परागत लोगोंके Langendorff छिड़काव · decellularization के दौरान मरंमत के लिए दिल का उपयोग करने के लिए आसान · दिल के वजन के कारण महाधमनी पर अत्यधिक दबाव
· लगातार दबाव नियंत्रण के तहत एसडीएस छिड़काव के दौरान उच्च अर्की प्रवाह दर
· एसडीएस छिड़काव के दौरान कम कोरोनरी छिड़काव दक्षता
· प्रवेशनी बंधाव लाइन के ऊपर महाधमनी/फुफ्फुसीय धमनी का भाग निर्जलित और आसानी से दूषित हो सकता है
उल्टे एक दबाव थैली के अंदर Langendorff छिड़काव · दिल के वजन के कारण महाधमनी पर तनाव को कम करने के लिए दबाव · मुश्किल दिल का उपयोग करने के लिए अगर मरंमत की जरूरत है ।
· लगातार दबाव नियंत्रण के तहत एसडीएस छिड़काव के दौरान कम अर्की प्रवाह दर
· एसडीएस छिड़काव के दौरान बेहतर कोरोनरी छिड़काव दक्षता
· कोई ऊतकों को बाहर सूख जाएगा के बाद से पूरे दिल जलमग्न/

तालिका 1: पेशेवरों और पूरे दिल decellularization के विपक्ष का सार एक दबाव थैली के अंदर पारंपरिक ईमानदार छिड़काव बनाम उल्टे Langendorff छिड़काव का उपयोग कर ।

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Discussion

हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली अध्ययन के लिए समय के साथ एक दबाव थैली के भीतर मानव दिल के उल्टे decellularization रिपोर्ट प्रवाह की दर और सेल मलबे हटाने की निगरानी । पेरीकार्डियम थैली की तरह decellularization प्रक्रिया भर में स्थिर दिल के उंमुखीकरण रहता है । उपविलय और एक थैली के अंदर पूरे दिल औंधा निर्जलीकरण रोकता है और महाधमनी पर अत्यधिक तनाव को कम करता है (दिल वजन से) जब पारंपरिक ईमानदार Langendorff छिड़काव decellularization विधि9की तुलना में । यह, बारी में, महाधमनी वाल्व की क्षमता को बरकरार रखता है ।

अधिक से अधिक decellularization दक्षता प्राप्त करने के लिए, कोरोनरी संवहनी प्रतिरोध पूरे मायोकार्डियम के माध्यम से तरल पदार्थ के पर्याप्त और सुसंगत छिड़काव सुनिश्चित करने के लिए कम होना चाहिए । प्रतिगामी छिड़काव का उपयोग कर पूरे दिल decellularization मॉडल में, द्रव निलय में जम जाता है और संवहन दबाव, जो, बारी में, कोरोनरी संवहनी प्रतिरोध बढ़ जाती है और तरल पदार्थ के प्रवाह को सीमित करता है तरक्की । हालांकि महाधमनी वाल्व बरकरार है, वेंट्रिकुलर गुहा शारीरिक रिसाव के लिए माध्यमिक भरता है और बदले में वेंट्रिकुलर दीवार compresses ।

एक दबाव थैली के अंदर एक दिल decellularizing की हमारी तकनीक इस समस्या को कम करने और decellularization दक्षता बढ़ाने के उद्देश्य से है । महाधमनी रूट पर १२० mmHg का दबाव और थैली में 14 mmHg को decellularization प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा जाता है । ये दबाव मान बहुत शारीरिक सीमा के करीब है (महाधमनी में 80-120 mmHg और वाम वेंट्रिकुलर अंत के लिए 15 mmHg-डायस्टोलिक दबाव22) । मूर्ति एट अल के अनुसार । 23, रोधगलन रक्त प्रवाह दर पर्वतमाला ०.६१ से १.१० मिलीलीटर/मिनट/जी, और मानव हृदय वजन24,25 के बारे में २४५ है ३०८ g; इसलिए, शारीरिक कोरोनरी प्रवाह दर के बारे में है १४९.४५ के लिए ३३८.८० मिलीलीटर/, लेकिन दिल के वजन पर निर्भर करता है । पीए से हमारे बहिर्वाह दर 20 से ५० मिलीलीटर/, जो शारीरिक कोरोनरी प्रवाह की दर के मूल्य से कम है और 2 अलग स्थितियों से परिणाम हो सकता है: 1) दिल के समाधान के अर्क का उत्पादन शोफ और वहां भी है सामांय संरचनात्मक बाईं निलय गुहा के लिए कोरोनरी प्रणाली के जल निकासी; 2) decellularization होता है के रूप में, तरल भी अपनी पारगम्यता में एक प्राकृतिक वृद्धि के कारण सेलुलर दीवारों के माध्यम से खो दिया है. इस दबाव विभेदक जहाजों के पतन को रोकता है और उंहें पेटेंट रहने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस प्रणाली को रोधगलन, जो कोरोनरी संवहनी प्रतिरोध बढ़ाने के लिए और decellularization समाधान के intravascular संचलन ख़राब होगा बिना रिश्तेदार शारीरिक शर्तों में दिल रखता है । अर्क मानव दिल की प्रवाह दर प्रोफ़ाइल (चित्रा 7A) बहुत क्या हम सुअर का दिल9के हमारे औंधा decellularization में मनाया के समान है, सबसे कम अर्की प्रवाह hypotonic छिड़काव और एक मामूली वृद्धि के दौरान होने वाली दर के साथ 1% एसडीएस छिड़काव के दौरान होने वाली प्रवाह दर (110.61 ± 14.40 एमएल/मिनट 176.31 ± 44.03 एमएल/ हमारे अर्क प्रवाह दर (मूल्य = 151.50 ± 3.71 मिलीलीटर/1% एसडीएस छिड़काव के दौरान के लिए तुलनीय था, या यहां तक कि मानव दिल decellularization के लिए उस से भी कम Guyette एट अल द्वारा सूचना दी । 14 हालांकि, हमारे विधि १२० mmHg के दबाव नियंत्रण और उनके विधि ६० mmHg इस्तेमाल के साथ किया जाता है । छिड़काव दबाव में यह अंतर एक कम अर्क प्रवाह दर उच्च दबाव बनाए रखने सकता है के बाद से हमारी तकनीक में महाधमनी वाल्व बंद करने की एक बेहतर प्रभावशीलता का पता चलता है । एक और संभावना यह है कि बढ़ी हुई कोरोनरी प्रतिरोध थैली के अंदर लागू 14 mmHg दबाव के कारण था । इसके अतिरिक्त, हमारे मानव हृदय विधि कोरोनरी छिड़काव क्षमता (~ 30%, चित्रा 7C, 7d) हाइपर से hypotonic समाधान परिवर्तन जब हमारे औंधा सुअर का दिल decellularization की तुलना में (~ 10% में कम की एक ऐसी ही प्रवृत्ति दिखाई उल्टे अभिविंयास9बनाम ईमानदार अभिविंयास में 1-2%) । हालांकि, इस उपंयास विधि एसडीएस छिड़काव समाधान छिड़काव के लिए तुलनीय के दौरान कोरोनरी छिड़काव क्षमता की रक्षा सकता है और इस तरह नमूना उलटा के हमारे पूर्व विधि से बेहतर प्रतीत होता है । तालिका 1 पेशेवरों और एक दबाव थैली के अंदर उल्टे Langendorff छिड़काव बनाम पारंपरिक ईमानदार छिड़काव के विपक्ष को सूचीबद्ध करता है ।

प्रवाह दर के अलावा, बहिर्वाह turbidity निगरानी decellularization प्रगति और दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक और उपयोगी उपकरण हो सकता है । decellularization के दौरान, फिलीस्तीनी अथॉरिटी से प्रवाह के turbidity गैर से प्रवाह की है कि फिलीस्तीनी अथॉरिटी साइटों (चित्रा 8B) से अधिक था । यह पता चलता है कि perfused समाधान के अधिकांश "उचित" decellularization के लिए vasculature के माध्यम से जा रहा था । अभी तक इस के लिए मांय हो, निंनलिखित को संबोधित किया जाना चाहिए: अंतर कक्ष अलग धकेलना, या महाधमनी वाल्व के प्रत्यक्षता । सावधान और सावधानीपूर्वक निरीक्षण इसलिए संरचनात्मक गैर-अनुरूपता के कारण विधि की विफलता को रोकने के लिए की जरूरत है । turbidity प्रोफ़ाइल (चित्रा 8B) पूरे दिल decellularization प्रक्रिया के समान प्रवृत्तियों का प्रदर्शन के रूप में पहले से दिखाया गया है, विभिंन perfusates9के प्रारंभिक संक्रमण अवधि के दौरान अचानक turbidity परिवर्तन के साथ ।

विसेलुलर ऊतकों के लिए एक मुख्य लक्ष्य को कोशिकाओं के साथ उन्हें फिर से आबाद और उच्च कोशिका लगाव, प्रसार, परिपक्वता और कार्यक्षमता को प्राप्त करने में सक्षम होना करने के लिए है । हमारे सेलुलर ऊतकों को सफलतापूर्वक विभिंन अनुप्रयोगों के लिए किया गया है,26,27, जहां ऊतकों को सफलतापूर्वक सेलुलर और कम thrombogenicity हासिल किया गया । हमारे विश्लेषित मानव हृदय के जैव रासायनिक विश्लेषणों में, हमने विभिन्न ऊतकों की मोटाई वाले 19 क्षेत्रों का मूल्यांकन किया । डीएनए और एसडीएस में सबसे अधिक सही और बाएं atrium में प्राप्त मूल्य के साथ, विभिंन ऊतकों में । यह एक उल्टा विंयास में दिल के उंमुखीकरण की वजह से हो सकता है, जिसमें सेल मलबे थैली के नीचे या जहां बाहरी दबाव कम प्रवाह में फंस गया था । छिड़काव decellularization बरकरार coronaries और सहायक नदियों सहित, नुकसान दिल संरचनाओं पर निर्भर करता है । के रूप में इन अंगों बहु अंग दाताओं से खरीद रहे हैं, इन दिलों को आम तौर पर उनके atria के एक बड़े हिस्से को हटा दिया है । इन अंगों और अलिंद दीवार की मरंमत की तैयारी के दौरान, वहां इन क्षेत्रों की सिंचाई में व्यवधान था, decellularization समाधान के प्रवाह को ख़तरे में डालना । गैर छिड़काव हार्ट decellularization के लिए, अंय अनुसंधान समूहों चूहे28, सुअर का29,30 और मानव31 में 2-6% बचे डीएनए की सूचना दी है के रूप में संबंधित cadaveric दिल के साथ तुलना में । हालांकि, वे फ्रीज-गल28,29,30, एंजाइम29,30 और सीरम31 उनके decellularization प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, जो एक से अधिक डिग्री करने के लिए ECM नुकसान हो सकता है हमारे छिड़काव आधारित तकनीक है । विकासशील तरीकों को पर्याप्त रूप से इन सीमाओं को संबोधित महत्वपूर्ण होगा ।

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Disclosures

डॉ टेलर Miromatrix मेडिकल, इंक में संस्थापक और शेयरधारक है इस संबंध में मिनेसोटा विश्वविद्यालय और टेक्सास हार्ट इंस्टीट्यूट द्वारा ब्याज नीतियों के संघर्ष के अनुसार प्रबंधित किया जाता है; दूसरे लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

इस अनुसंधान ह्यूस्टन बंदोबस्ती अनुदान और टेक्सास उभरते प्रौद्योगिकी कोष द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक इस अध्ययन संभव बनाने के लिए अंग खरीद एजेंसी LifeGift, Inc और दाता परिवारों को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-0 silk suture Ethicon SA85H Suture used to ligate superior and inferior vena cava
1/4" x 3/8" connector with luer NovoSci 332023-000 Connect aorta and pulmonary artery
Masterflex platinum-cured silicone tubing Cole-Parmer HV-96410-16 Tubing to connect heart chambers/veins
infusion and outflow line Smiths Medical MX452FL For flowing solutions through the vasculature
Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) Fisher scientific 01-812-17 Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization
Snapware Square-Grip Canister Snapware 1022 1-liter Container used for perfusing heart
Black rubber stoppers VWR 59586-162 To seal the perfusion container
Peristaltic pump Harvard Apparatus 881003 To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids
2 L aspirator bottle with bottom sidearm VWR 89001-532 For holding solutions/perfusate
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit Life Technologies P7589 For quantifying dsDNA
Calf thymus standard Sigma D4522 DNA standard
Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit Biocolor Ltd Blyscan #B1000 GAG assay kit
Plate reader Tecan Infinite M200 Pro For analytical assays
GE fluoroscopy General Electric OEC 9900 Elite Angiogram
Visipaque GE 13233575 Contrast agent

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४१ दबाव सिर पेरीकार्डियम decellularization turbidity मानव हृदय प्रवाह गतिशीलता
एक उल्टे अभिविंयास में एक दबाव थैली के अंदर पूरे मानव दिल की Decellularization
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Taylor, D. A., Sampaio, L. C.,… More

Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Cabello, R., Elgalad, A., Parikh, R., Wood, R. P., Myer, K. A., Yeh, A. T., Lee, P. F. Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation. J. Vis. Exp. (141), e58123, doi:10.3791/58123 (2018).

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