Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli co udtrykke en kimære RNA, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Det vigtigste produkt er en cirkulær molekyle, der letter rensning til ensartethed.

Abstract

Med stigende interesse i RNA biologi og brugen af RNA molekyler i avancerede bioteknologiske applikationer, er metoder til at producere store mængder af rekombinant RNA'er begrænset. Her, vi beskriver en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli baseret på fælles udtryk for en kimære molekyle, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Viroider er relativt små, ikke-kodende, stærkt base-parret cirkulære RNA'er, der er smittefarlige til højere planter. Værten plante tRNA ligase er et enzym, der er ansat af viroider, der tilhører familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd), for at mægle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd ikke replikerer i E. coli, en ELVd forløber effektivt er transskriberet af E. coli RNA polymerase og behandles af integrerede hammerhead ribozymer i bakterieceller, og de deraf følgende monomerer er circularized af den Co udtrykt tRNA ligase at nå frem til en bemærkelsesværdig koncentration. Indføjelsen af et RNA interesse i ELVd stillads muliggør fremstilling af snesevis af rekombinant RNA pr. liter bakteriekulturen regelmæssig laboratoriegodkendte mg. En vigtigste brøkdel af RNA produkt er cirkulær, en funktion, der letter rensning af af rekombinante RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokol, er en supplerende DNA (cDNA) svarende til RNA af interesse indsat i en bestemt stilling af ELVd cDNA i et udtryk plasmidet, som langs plasmid Co udtrykke aubergine tRNA ligase, bruges til at omdanne E. coli. Co udtryk for begge molekyler under kontrol af stærke konstitutiv projektledere fører til produktion af store mængder af af rekombinante RNA. Den rekombinante RNA kan udvindes fra de bakterieceller og adskilt fra hovedparten af bakteriel RNA'er udnytter sin cirkularitet.

Introduction

I modsætning til DNA og proteiner er protokoller for nem, effektiv og omkostningseffektiv produktion af store mængder af RNA ikke rigelige. Men forskning og industri efterspørgsel stigende mængder af disse biomolekyler at undersøge deres unikke biologiske egenskaber1, eller at være ansat i avancerede bioteknologiske applikationer, herunder deres brug som meget specifikke aptamers 2, terapeutiske agenter3eller selektiv pesticider4. In vitro transskription og kemisk syntese er almindeligt anvendt i forskning til at producere RNA. Men disse metoder indebærer vigtige begrænsninger når store mængder af produkterne, der er påkrævet. Den logiske alternativ er at bruge den endogene transskription maskiner af levende celler, efterfulgt af en rensningsproces at adskille RNA'er af interesse fra den cellulære ledsagere. Efter denne strategi metoder er blevet udviklet til at producere rekombinant RNA'er i bakterieceller, såsom lab-venlige Escherichia coli5 eller den marine lilla fototopiske alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de fleste metoder til at producere rekombinant RNA i bakterier stole på udtryk for en indfødt yderst stabil RNA stillads, såsom en tRNA eller en rRNA, hvor RNA af interesse er indsat7. Dette pålægger nødvendigheden af at frigive RNA af interesse fra de kimære molekyle, hvis tilstedeværelsen af ekstra RNA er et problem for downstream programmer8. Et andet koncept i rekombinant RNA bioteknologi er produktionen af rekombinante ribonucleoprotein komplekser, som kan være den ønskede vare i sig selv eller bruges som en beskyttende strategi til at øge stabiliteten i RNA interesse9, 10. På samme måde, er produktionen af cirkulære RNA'er også blevet foreslået som en strategi til at generere mere stabile produkter11.

Vi har for nylig udviklet en ny metode til at producere store mængder af rekombinant RNA i E. coli , der deltager i tre af de ovennævnte begreber: indsættelse af RNA af interesse i en yderst stabil cirkulært RNA stillads og co udtryk for den rekombinant RNA med en interagerende protein sandsynligvis producere en stabil ribonucleoprotein kompleks, der ophobes i bemærkelsesværdigt beløb i bakteriel celler12. I modsætning til tidligere udvikling brugte vi en RNA stillads helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroider er en meget bestemt type af smitsomme agenser af højere planter, der er udelukkende udgøres af en relativt lille (246-401 nt) meget base-parret cirkulært RNA13. Interessant, viroider ikke-kodende RNA'er, og ingen hjælp fra deres egne proteiner, de er i stand til at fuldføre komplekse smitsomme cykler i inficerede værter14. Disse cyklusser omfatter RNA til RNA replikering i kerner eller grønkorn, afhængigt af familien viroid —Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis — bevægelse gennem de inficerede anlæg og unddragelse af vært defensive svar. Viroider skal være rangeret blandt de mest stabile RNA'er i naturen, som følge af at være en nøgen cirkulært RNA og skulle overleve i den barske miljø af inficeret planteceller. Denne egenskab kan gøre viroider især velegnet som stilladser til at stabilisere rekombinant RNA i bioteknologiske metoder. Desuden er den nye metode baseret på fælles udtryk for viroid stillads med en interagerende vegetabilske proteiner. Viroider replikere gennem en rullende cirkel mekanisme i hvilken vært enzymer er rekrutteret til at katalysere de forskellige trin i processen. Især nogle viroider, mere konkret dem, der tilhører familien Avsunviroidae15, indeholder ribozymer, der er også involveret i replikation. Dyrearten viroid er transskription af viroid RNA'er medieret af værten RNA polymerase II eller for chloroplastic nukleare-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA forarbejdning synes at blive katalyseret af et host type III RNase, selvom i viroider med ribozymer oligomere RNA mellemprodukter selvstændige spaltes under replikering. Endelig, de resulterende viroid monomerer er circularized, afhængigt af familien viroid af vært DNA ligase 1 eller den chloroplastic isoform af tRNA ligase16,17. Denne sidste enzym er involveret i ligatur af de monomere former for viroider i familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd)18.

I løbet af et værk til at analysere sekvens og strukturelle krav til ELVd der bestemmer anerkendelse af aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi oprette en eksperimentel system baseret på fælles udtryk for begge molekyler i E. coli 19. vi bemærket at længere end enhed ELVd transkripter selv kløver effektivt i E. coli celler gennem integrerede hammerhead ribozymer og at de resulterende viroid monomerer med 5'-hydroxyl og 2', 3'-phosphodiester termini var effektivt circularized af co udtrykt aubergine tRNA ligase. Endnu mere nået den resulterende cirkulære viroid RNA en uventet høj koncentration i E. coli, overstiger de endogene rRNAs12. Fravær af replikering mellemprodukter angivet manglende ELVd RNA til RNA forstærkning i disse bakterieceller. Interessant, havde indsættelse af heterolog RNA'er i en bestemt stilling af viroid molekyle en moderat effekt på ophobning af den cirkulære viroid-afledte RNA'er12. Disse observationer gjort os forestiller en metode til at producere store mængder af rekombinant RNA'er i bakterier. I denne metode, cDNAs svarende til RNA'er af interesse er indsat i ELVd cDNA og den resulterende kimære RNA er udtrykt i E. coli gennem en stærk konstitutive promoter. For at systemet kan fungere, skal E. coli omdannes sammen med et plasmid at udtrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-afledte længere end enhed udskrift er behandlet af integrerede hammerhead ribozymer og de deraf følgende monomerer med de passende termini er anerkendt og circularized af de Co udtrykt tRNA ligase. På denne måde er RNA af interesse indsat i en meget stabil cirkulære stillads bestående af viroid cirkulære molekyle. Denne rekombinant kimære RNA er sandsynligvis yderligere stabiliseret inde i E. coli cellerne ved dannelsen af et komplekst samspil med tRNA ligase ribonucleoprotein. Ved hjælp af denne metode (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNA'er og andre strukturerede RNA'er er let produceres i mængder af snesevis af E. coli kultur i regelmæssig laboratorieforhold mg pr. liter og renset til homogenitet tager fordel af cirkularitet12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmid konstruktion

  1. Forstærke ved PCR (eller reverse transkription PCR hvis start fra en RNA skabelon) cDNA svarende til RNA af interesse ved hjælp af primere med 5' forlængelse tillade forsamling i udtryk plasmid. For at undgå uønskede mutationer, bruge en high-fidelity DNA polymerase.
    1. Hvis du vil indsætte cDNA i udtryk plasmid af Gibson forsamling20, tilføje de følgende 5' udvidelser til PCR-primere: fremad, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; omvendt, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X repræsenterer nukleotider homologe til terminal enderne af RNA af interesse.
    2. Inkuber i 30 s på 98 ° C, efterfulgt af 30 cyklusser af 10 s på 98 ° C, 30 s på 55 ° C og 30 s på mindst 72 ° C, og en sidste udvidelse af 10 min på 72 ° C.
  2. Digest 100 ng af plasmidet pLELVd-BZB med 10 U type-IIS begrænsning enzym Bpi jeg for 1 timer ved 37 ° C i 20 µL reaktion i en 0,5 mL tube i buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Bemærk: Alle plasmider er tilgængelig på anmodning til den tilhørende forfatter. BPI Jeg er svarende til Bbs jeg.
  3. Adskille PCR og fordøjelsen produkterne ved elektroforese i en 1%-agarosegel i TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre, 1 mM EDTA, pH 7,2). Pletten gel i 15 min. ved omrystning i 200 mL af 0,5 µg/mL ethidiumbromid. Visualisere DNA ved hjælp af en UV-transilluminator og skære de bands, svarende til den forstærkede cDNA og den Bpi jeg-fordøjet plasmid (2046 bp) ved hjælp af en skalpel klinge.
    Bemærk: BPI Jeg fordøjelsen af pLELVd-BZB også frigiver en 528 bp produkt svarer til LacZ blå-hvid reporter.
  4. Elueres DNAs fra gel fragmenter ved hjælp af silica gel kolonner (gel DNA opsving kit i Tabel af materialer) og kvantificere DNA koncentration af spektrofotometriske analyse.
  5. Oprette en Gibson forsamling reaktion ved hjælp af den forstærkede cDNA og fordøjet plasmid. Bruge en 3-fold kindtand overskud af Indsæt versus vektor20. Inkuber i 1 time ved 50 ° C og rense reaktionsprodukter ved hjælp af en silicagel kolonne (DNA ren & koncentrator kit i Tabel af materialer).
  6. Bruge de renset produkter af Gibson forsamling reaktion på electroporate kompetente E. coli DH5α celler. Med 1-mm elektroporation kuvetter, anvende følgende indstillinger: 1.500 V og 5 ms. Incubate i 1 timer ved 37 ° C i super optimeret bouillon med catabolite undertrykkelse (SOC; 20 g/L trypton, 5 g/L gær extract, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 20 mM glucose, pH 7,0) flydende medium og derefter spredes på Luria-Bertani (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L gær extract, 10 g/L NaCl) agar (1,5%) plader der indeholder 50 µg/mL ampicillin.
    1. For at screene for kolonier svarende til transformerede E. coli sprede kloner, der sandsynligvis indarbejdet Indsæt, 15 min før plating electroporated cellerne, 30 µL af 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) i dimethylformamid. Inkuber plader natten over ved 37 ° C.
  7. Pluk flere hvide kolonier og vokse natten over ved 37 ° C i flydende LB medier. Rense plasmider ved hjælp af en miniprep kit (Se Tabel af materialer) og analysere deres størrelser ved elektroforese i en 1%-agarosegel i TAE buffer.
  8. Vælg den mest sandsynlige rekombinant plasmid baseret på elektroforese migration i forhold til kontrolelementet pLELVd-BZB. Bekræft sekvensen af den valgte plasmid ved sekventering ved hjælp af primere 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' og 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' at flankere hele udtrykket kassette i pLELVd-BZB.
    Bemærk: Husk, at denne plasmid indeholder en 528 bp polylinker med den LacZ markør, der er erstattet af cDNA af interesse. Begrænsning kortlægning kan hjælpe til at vælge de højre rekombinant plasmider.

2. RNA udtryk

  1. Co-electroporate (Se vilkårene i 1,6) den valgte E. coli stamme (E. coli BL21 eller en BL21 derivat) med pLELVd-BZB-derivat, der indeholder det cDNA, der svarer til RNA af interesse og plasmidet p15LtRnlSm Co udtrykke den aubergine tRNA ligase. Bruge E. coli HT115(DE3), som mangler RNase III21, udtrykke RNA'er med lang dobbelt-strenget regioner.
    Bemærk: Både i RNA interesse og tRNA ligase mRNA er transskriberet af E. coli RNA polymerase. Ingen DE3 lysogen at udtrykke T7 RNA polymerase er nødvendige i E. coli -stamme, men tilstedeværelsen af denne lysogen ikke har nogen skadelige virkninger.
  2. Efter 1 h inkubation ved 37 ° C i SOC flydende medium, plade electroporated bakterier i LB solid medium indeholdende 50 µg/mL ampicillin og 34 µg/mL chloramphenicol. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
  3. Vælge en koloni og podes en 1 L forbløffet Erlenmeyerkolbe med 250 mL flydende fantastisk bouillon (TB) medium (12 g/L trypton, 24 g/L gær extract, 0,4% glycerol, 0,17 M KH2PO4og 0,72 M K2HPO4), der indeholder 50 µg/mL ampicillin og 34 µg/mL chloramphenicol. Der inkuberes ved 37 ° C under kraftig omrystning ved 180 omdrejninger pr. minut (rpm). Høste bakterier mellem 12 og 16 h efter kultur podning.

3. RNA ekstraktion og oprensning

  1. Til analyseformål, tage 2 mL alikvoter af kulturen på de ønskede tidspunkter og centrifugeres ved 14.000 x g i 2 min. Fjern supernatanten og resuspend celler i 50 µL af TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, og 1 mM EDTA) af vortexing.
    1. Tilføje en volumen (50 µL) i en 1:1 (v/v) blanding af phenol (mættet med vand og ekvilibreres ved pH 8,0 med Tris-HCl, pH 8,0) og chloroform. Bryde cellerne af kraftig vortexing og adskille de vandige og den organiske fase efter centrifugering i 5 minutter ved 14.000 x g.
    2. Omhyggeligt genoprette vandfase (øverst), der indeholder samlede bakterielle RNA.
      Bemærk: Præparater kan opbevares ved-20 ° C til efterfølgende analyse.
  2. Henblik på forberedende, hæld kultur i en 250 mL centrifugeres flaske og spin-ned celler ved 14.000 x g i 10 min. Fjern supernatanten. Cellerne vaskes ved resuspending i 30 mL vand. Overføres til et centrifugeglas og spin ned celler igen på de samme betingelser.
  3. Supernatanten og resuspend celler i 10 mL af kromatografi buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) af vortexing.
    Bemærk: På dette tidspunkt, kan celler fryses ved-20 ° C til at gå videre med rensning hvert andet øjeblik.
  4. Bruger en friske eller optøede bakteriel forberedelse, bryde celler ved at tilføje 1 volumen (10 mL) af phenol: chloroform (Se trin 3.2) og vortexing kraftigt.
  5. Der centrifugeres i 10 min på 12.000 x g, Genskab den vandige fase og pakker med 1 volumen (10 mL) af chloroform på samme betingelser.
    Bemærk: RNA forberedelse kan opbevares ved-20 ° C på dette punkt.
  6. Yderligere rense samlede bakterielle RNA ved anion-exchange kromatografi. Filtrer RNA forberedelse gennem en 45 µm sprøjte filter og belastning på en 1 mL diethylethanolamine (DEAE) kolonne.
    1. Til kromatografi rensning, skal du bruge en Væskekromatografisk system med en væskehastighed på 1 mL/min. Før prøven lastning, Blandingen henstår kolonnen med 10 mL af kromatografi buffer (Se trin 3.3 for sammensætning).
    2. Læg prøven og vask kolonnen med 10 mL af kromatografi buffer. Elueres RNA med 20 mL af eluering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) og indsamle 1 mL alikvoter.
      Bemærk: RNA eluerer hurtigt i de indledende fraktioner. Kolonnen kan genanvendes til yderligere purifications. For dette, vask kolonnen med 10 mL vand og opbevares ved 4 ° C i 20% ethanol.
  7. Da en stor del af rekombinant RNA ophobes i E. coli i en cirkulær form, kan denne ejendom profiterede for rensning at homogenitet12. Adskille cirkulære RNA'er fra de lineære modstykker af to-dimensionelle polyacrylamid gelelektroforese (2D side) kombination af ikke-denaturering og denatureringen (8 M urinstof) betingelser12,22.

4. RNA analyser

  1. Forbered en 5% polyacrylamid gel (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, forholdet mellem) i TBE buffer (89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA) indeholdende 8 M urinstof.
  2. Mix 20 µL af RNA præparater med 1 antal (20 µL) indlæsning buffer (98% formamid, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,0025% bromophenol blå og 0,0025% xylen cyanol), inkuberes i 1,5 min. ved 95 ° C i en varme blok, og fastgør cool på is.
  3. Indlæse prøver i Polyacrylamiden og køre elektroforese på passende betingelser, afhængigt af gel dimensioner (fxkøre 140 x 130 x 2 mm gel til 2,5 h på 200 V). Pletten gel for 15 min i 0,5 µg/mL ethidiumbromid, vask med vand og visualisere RNA under UV-lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at producere rekombinant RNA i E. coli ved hjælp af ELVd-afledte system12, er RNA af interesse podet ind en ELVd RNA stillads. Denne kimære RNA er co udtrykt langs den aubergine tRNA ligase i E. coli. Når forarbejdet, kløvet og circularized, danner de kimære cirkulært RNA, som stikker RNA af interesse, sandsynligvis en kompleks med co udtrykt aubergine enzymet, der når bemærkelsesværdige koncentration i bakterieceller ( ribonucleoprotein Figur 1). Derfor består det første skridt til at producere rekombinant RNA ved hjælp af dette system af indsætte cDNA svarende til RNA af interesse på en bestemt placering i ELVd cDNA, T245-T246 i ELVd sekvens variant AJ536613. Plasmidet pLELVd-BZB, som indeholder en polylinker på denne position med to Bpi anerkendelse websteder og en LacZ blå/hvid markørgen, letter denne indsættelse af den meget effektive Gibson forsamling metode20. Udvalg af transformerede E. coli kloner, der indeholder de ønskede rekombinante plasmider er lettet af den blå/hvid screening af LacZ markør. Plasmider, hvor den dobbelt Bpi jeg fordøjelsen var ufuldstændig og kunne ikke optage Indsæt sandsynligvis producere blå kolonier i overværelse af X-gal. Figur 2 viser en elektroforese analyse af flere rekombinant plasmider som forskellige cDNAs blev indsat. Disse plasmider vise forskellige vandringer i forhold til pLELVd-BZB. Bemærk at pLELVd-BZB indeholder LacZ markør (528 bp), erstattes af cDNA svarende til RNA af interesse. Så selvom dette afhænger af størrelsen af den indsatte cDNA, de rekombinante plasmider normalt overføre hurtigere end kontrol plasmid (figur 2).

PLELVd-BZB-derivater, der indeholder cDNAs svarende til RNA'er interesse bruges langs p15LtRnlSm til co-electroporate E. coli. Co transformerede bakterier er valgt på plader der indeholder ampicillin og chloramphenicol. Derefter valgte E. coli kloner er vokset ved 37 ° C med stærke agitation i den rige TB medium. Betingelser, denne kultur maksimeret produktion af rekombinant RNA er12. Tilstedeværelsen af af rekombinante RNA i bakterier kan nemt overvåges ved at bryde cellerne med en blanding af phenol og kloroform ved tilstedeværelse af en buffer og analysere RNA, hvilke partitioner i vandig bufferen ved denaturering side. Figur 3 viser ethidiumbromid farves polyacrylamidgeler i hvilke samlede RNA'er fra forskellige E. coli kloner var adskilt. Billederne viser stærk bands, der svarer til Tom ELVd og kimære ELVd former som forskellige RNA'er af interesse blev indsat. Interessant finder vi en større brøkdel af af rekombinante RNA som cirkulær form. Ved hjælp af en kombination af to sider denaturering betingelser på høj og lav ionisk styrke, kan cirkularitet af den vigtigste del af rekombinant RNA nemt observeres (figur 4).

Afhængigt af programmet downstream, den samlede E. coli RNA præparat, der indeholder de kimære ELVd-RNA interesse kan være mål for den aktuelle protokol. Men når det er nødvendigt, RNA forberedelse kan yderligere renses ved anion-exchange kromatografi. Kromatogrammet i figur 5 viser effektiv opbevaring af E. coli RNA på kolonne på lav ionisk styrke (150 mM NaCl) og efterfølgende eluering på Ioniske højstyrke (1 M NaCl). De fleste af RNA er indsamlet i brøkdele 2 og 3. For at rense den rekombinante RNA til homogenitet, kan drages fordel af cirkularitet. Cirkulær RNA'er er forsinket med hensyn til deres lineære modparter i denatureringen betingelser22. Disse RNA'er kan være elueres fra gel efter ethidium bromid farvning. Brug af en solubilizable polyacrylamid gel, som dem, tværbundet med N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, letter rensning af store mængder af rekombinant RNA'er (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Skematisk fremstilling af den viroid-baseret system til at producere rekombinant RNA i e. coli. CDNA svarende til RNA af interesse (den 98 nt-lange RNA aptamer spinat i ordningen) er indsat i plasmidet pLELVd-BZB. E. coli er co transformeret med den pLELVd-BZB-afledte og plasmidet p15LtRnlSm Co udtrykke aubergine tRNA ligase. I E. coli, kimære ELVd-spinat RNA afskriften er selvstændige kløvet (rød pilespidser) af viroid hammerhead ribozymer. Den resulterende monomer er anerkendt af de Co udtrykt tRNA ligase og circularized. Den rekombinante RNA består af en cirkulær viroid stillads som RNA af interesse (i grønt) stikker. Ophobning af af rekombinante RNA til store mængder i E. coli sandsynligvis skyldes stabilisering af ribonucleoprotein kompleks med tRNA ligase. Ud over split ELVd cDNA, plasmidet pLELVd-BZB indeholder en pUC replikering oprindelse (pUC ori), en ampicillin udvalg gen (AmpRasmussen), E. coli murine lipoprotein (lpp) promotor og rRNA (rrnC) terminator og LacZ markør. Plasmidet p15LtRnlSm indeholder en p15A replikering oprindelse (p15A ori), et chloramphenicol resistens gen (CmR), E. coli lpp promotor og en phage T7 transskription terminator, ud over aubergine tRNA ligase cDNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: elektroforese analyse af pLELVd-BZB-afledte udtryk plasmider, der indeholder forskellige cDNAs af interesse. Plasmider var adskilt af elektroforese i en 1%-agarosegel, der var farvet med ethidiumbromid. Lane 1, DNA markør med størrelser i kbp af nogle af komponenterne til venstre; Lane 2, pLELVd-BZB; Lane 3, pLELVd-BZB derivat at udtrykke en tom ELVd; baner 4 til 7, pLELVd-BZB derivater til at udtrykke RNA aptamer spinat (lane 4), streptavidin bindende aptamer (lane 5), en RNA hårnål med en sammenhængende 42 bp dobbelt-strenget region (lane 6), og den 3' cap-uafhængig oversættelse forstærker (CITE) af en plante virus (lane 7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Rekombinant RNA produceret i E. coli ved hjælp af viroid-baseret system. Samlede RNA'er fra forskellige E. coli kloner blev udvundet ved behandling med phenol: chloroform og delprøver adskilt af denatureringen side. Gels farves med ethidiumbromid er vist. Rekombinant RNA'er blev produceret i E. coli (A) BL21(DE3) og (B) HT115(DE3). (A og B) baner 1, RNA markør med størrelser i nt til venstre; baner 2, RNA'er fra E. coli kloner til at udtrykke en tom ELVd (333 nt). (A) baner 3 og 4, RNA'er fra E. coli kloner til at udtrykke en kimære ELVd form, der indeholder aptamer spinat (98 nt) og streptavidin bindende aptamer (42 nt), henholdsvis. (B) Lane 3, RNA'er fra en E. coli klon at udtrykke en kimære ELVd formular, der indeholder en 42 bp-lang dobbelt strandede RNA. Røde pile peger på de cirkulære rekombinant RNA'er. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Cirkularitet af af rekombinante RNA produceret i E. coli ved hjælp af viroid-baseret system. Samlede RNA'er fra en E. coli klon at udtrykke en kimære ELVd, der indeholder aptamer spinat var adskilt af 2D denatureringen side først under høj og derefter lav ionisk styrke. Geler blev plettet af ethidiumbromid. De blå pile angiver retninger af elektroforese migration. Den røde pil peger på den cirkulære ELVd-spinat, som er selektivt forsinket fra de lineære kolleger af samme størrelse under de to separationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Kromatografiske rensning af en rekombinant RNA produceret i E. coli ved hjælp af viroid-baseret system. Samlede RNA'er fra en E. coli -klon, der producerer en kimære ELVd-3' CITE (55 nt) blev indlæst på et DEAE kromatografi kolonne, der var skyllet i overværelse af 150 mM NaCl. RNA blev elueret i nærværelse af 1 M NaCl. Kromatogrammet viser absorbans ved 254 nm (blå linje) og ledningsevne i mS/cm (orange linie) versus volumen. De forskellige trin i den kromatografiske adskillelse (ækvilibrering, injektion, vask, eluering og kolonne regenerering) er angivet. Indsamlede fraktioner angives også. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Rensning til homogenitet af en rekombinant RNA produceret i E. coli ved hjælp af viroid-baseret system. Samlede RNA'er fra en E. coli -klon, der producerer en kimære ELVd-3' CITE blev først renset ved kromatografi ved hjælp af en DEAE-Sepharose kolonne og derefter adskilt af 2D side. Første gel blev kørt under denatureringen betingelser (8 M urinstof, buffer TBE). Efter farvning med ethidiumbromid, blev gel bandet, der indeholder den cirkulære form af af rekombinante RNA overført til toppen af en anden gel, der blev kørt under ikke-denatureringen tilstand (buffer TAE). Acrylamid i den anden gel var tværbundet med N, N'-bis (acryloyl) cystamine, som tillod oploesning af gel-fragment, der indeholdt den ren rekombinant RNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens forsker ELVd sekvens og struktur krav involveret i anerkendelse af den aubergine tRNA ligase, bemærket vi, at fælles udtryk for begge molekyler i den ikke-vært E. coli førte til en uventet stor ophobning af viroid cirkulære former i bakterieceller19. Vi forstod, at den store ophobning af viroid RNA i E. coli sandsynligvis var konsekvensen af co udtrykker en yderst stabil RNA-molekyle, som de relativt små (333 nt), stærkt baseret-parret, cirkulær viroid, og et protein som denne særlig viroid viser høj affinitet. ELVd RNA skal rekruttere vært tRNA ligase for at mægle sin circularization under replikering i inficerede anlægget17. Selvom vi ikke har eksperimentel bekræftelse, forventer vi, at begge molekyler udgør en kompleks i E. coli , der yderligere stabiliserer viroid RNA og giver mulighed for at nå den bemærkelsesværdige koncentration af 150 mg pr. liter af bakteriel ribonucleoprotein kultur, der stærkt overstiger de af endogene RNA'er, såsom rRNAs12. Da ELVd ikke replikerer i E. coli, begrundet vi at indsættelsen af en heterolog RNA ikke skulle dramatisk indflydelse ophobning af viroid-afledte RNA, og i virkeligheden, det var tilfældet. Denne observation er grundlaget for metoden til at producere store mængder af rekombinant RNA i E. coli , som vi beskriver her. Metoden bruger den cirkulært RNA-molekyle af ELVd som et stillads som RNA af interesse er præsenteret. For at producere en cirkulær ELVd stillads i E. coli, skal vi udtrykke en forløber RNA med viroid hammerhead ribozym duplikerede domæne. ELVd ribozymer selvstændige kløver meget effektivt i E. coli og de resulterende viroid monomerer er anerkendt og circularized af de Co udtrykt tRNA ligase. Co udtryk for tRNA ligase er et centralt element i systemet. ELVd RNA er næppe registreret i E. coli , medmindre dette bestemte enzym er co udtrykt12.

I vores protokol, plasmidet pLELVd-BZB giver mulighed for at indsætte det cDNA, der svarer til RNA af interesse ved enkle og effektive Gibson forsamling mellem holdninger, U245 og U246 af ELVd. Dette websted svarer til terminal loop af en lang hårnål i det mest sandsynlige ELVd kropsbygning24,25. Indsættelse i denne særlige situation skal fremme at RNA interesse stikker fra meget stabile skafottet dannet af ELVd og skal undgå intramolekylære interaktion mellem RNA af interesse og ELVd (figur 1). Vi har ikke undersøgt effekten af indsætte RNA interesse for alternative positioner i ELVd-molekylet. Plasmidet p15LtRnlSm tillader Co udtryk for den aubergine tRNA ligase. RNA'er er transskriberet i begge plasmider under kontrol af en konstitutiv stærk E. coli promotor, nemlig murein lipoprotein (lpp). Dette gør systemet konstitutiv uden behov for induktion. Vi bygger dog også en lignende plasmid (p15tRnlSm) for at udtrykke tRNA ligase under kontrol af phage T7 RNA polymerase i en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbar system. Brug denne plasmid, opstår ophobning af af rekombinante RNA kun efter induktion af tRNA ligase udtryk ved at tilføje IPTG12. I det nuværende system udtrykt RNA af interesse fra en høj kopi nummer plasmidet pUC replikering oprindelse, mens tRNA ligase udtrykkes fra en moderat kopi nummer plasmid med p15A replikering oprindelse. Om at ændre kopier række begge plasmider involveret i systemet forbedrer ophobning af rekombinant RNA ikke er blevet undersøgt indtil videre. Størrelsesområde for RNA interesse optaget af systemet er ikke blevet systematisk undersøgt enten, selv om små RNA'er forventes logisk at akkumulere højere koncentrationer end større virksomheder.

En af grundene til produktion af rekombinant RNA in vivo ikke er let er sandsynligvis på grund af den iboende lav halveringstid af RNA-molekyler. Vores system er ikke fremmed for dette problem. I virkeligheden, på et sent E. coli vokser fase, begynder ophobning af rekombinant RNA at falde for at forsvinde næsten12. Dette tvinger en til at finde det rigtige vindue til at høste cellerne. Vi observeret, at dette vindue er stor nok til at gøre systemet brugervenligt. Dog bemærkede vi også, at vinduet optimal afhænger af mange faktorer, herunder den særlige E. coli stamme, næringssubstrat, produktionsbetingelserne (agitation, volumen af kolben, udluftning m.m..) og den fysiologiske fase af bakterier bruges til at starte den flydende kultur. Vi anbefaler at starte rekombinant RNA produktion ved hjælp af friske E. coli kolonier fra en plade podes den foregående dag og dyrket ved 37 ° C. Lagring af plader i køleskabet gør vinduet høst mere uforudsigelig. Vi opnåede de mest konsistente resultater ved at starte flydende kulturer med bakterier plukket fra en plade med en tandstikker. Brug af en flydende før kultur, drev især hvis mættet, også til variation i produktion-protokollen.

Med hensyn til rensning, behandling af bakterieceller med phenol: chloroform er en meget effektiv måde at bryde cellerne og giver mulighed for kvantitative inddrivelse af samlede bakterielle RNA i den vandige fase. Afhængigt af programmet downstream af rekombinant RNA kan denne vandfasen eller den forberedelse, der skyldes fældningen RNA fra denne vandig fase med en alkohol være nok. Hvis yderligere rensning er nødvendig, anbefaler vi anion-exchange kromatografi ved hjælp af en DEAE anion Ionbytterkolonnen (figur 5). Denne rensning trin giver mulighed for effektiv fjernelse af DNA og bakteriel metabolitter, der også adskilt i den vandige fase. Hvis downstream anvendelsen af af rekombinante RNA kræver rensning til homogenitet, tilbyder de viroid-afledte system en klar fordel i forhold til andre metoder. Da en vigtigste brøkdel af af rekombinante RNA er produceret som en cirkulær form, drages fordel af denne egenskab kan at adskille den fra hovedparten af bakteriel RNA'er. Cirkulær RNA'er oplever en forsinkelse i elektroforese migration i denatureringen betingelser med hensyn til de lineære kolleger af samme størrelse22. Denne forsinkelse er mere udtalt når RNA er electrophoresed under lavere ionisk styrke. I praksis, cirkulær RNA'er kan også været adskilt af to-dimensionelle denaturering PAGE under høj og lav ionisk styrker (figur 4). Efter elektroforetisk separation, skal den rekombinante RNA elueres fra gel. Brug af en reversibel tværs linker af acrylamid, såsom N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, letter opsving, især når rensning af store mængder af RNA (figur 6). Endelig, hvis downstream anvendelse af den producerede RNA kræver adskillelse af RNA af interesse fra viroid stillads, vores protokol giver ikke nogen særlig fordel til tidligere metoder. RNA interesse skal være skåret ud fra de kimære molekyle ved hjælp af nogle af de tidligere beskrevne strategier, såsom brugen af ribozymer, DNAzymes, eller måske mest effektivt, brugen af RNase H styret af to DNA oligonukleotider7. Forsøger at undgå denne sidste besværlige rensning skridt, har vi arbejdet på at forsøge at reducere størrelsen af viroid stillads, selv med delvis succes. Vi var i stand til at producere bemærkelsesværdige mængder af rekombinant RNA bruger viroid slettet formularer (175, 215 og 246 nt) men stigende sletninger af viroid stillads korreleret med faldende akkumulation12.

I sum, er her en protokol beskrevet til at producere store mængder af rekombinant RNA i E. coli , at vores viden, forbedrer udbyttet af tidligere udgivne metoder. Protokollen er baseret på fælles udtryk i E. coli af RNA interesse indsat i en viroid (ELVd) stillads og aubergine tRNA ligase, det enzym, der circularizes denne viroid i inficerede planter. Et karakteristisk træk ved vores protokol er at rekombinant RNA er hovedsageligt fremstillet som en cirkulær form, en egenskab, der letter rensning til ensartethed for efterfølgende ansøgninger. Bruger denne protokol snesevis af rekombinant RNA kan fremstilles nemt per liter af E. coli kultur i regelmæssig laboratorieforhold mg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at den teknologi, der er beskrevet i denne protokol er blevet patenteret (os Patent nr. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud BIO2017-83184-R og BIO2017-91865-EXP fra den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (samfinansierede FEDER midler).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

Biokemi sag 141 rekombinant RNA cirkulært RNA viroid tRNA ligase RNA aptamer Escherichia coli
Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter