Summary
Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een model van de pleurale effusie bij ratten door intratracheale instillatietest van polyacrylaat/nanosilica.
Abstract
Pleurale effusie is een overwegend klinische vinden van vele longziekten. Na een nuttig dier pleurale effusie model is zeer belangrijk om te studeren deze longziekten. Voorgaande modellen van pleurale effusie meer aandacht besteed aan biologische factoren in plaats van nanodeeltjes in het milieu. Hier introduceren we een model voor het maken van pleurale effusie bij ratten door intratracheale instillatietest van polyacrylaat/nanosilica, en een methode van nanoparticle isolatie in de pleurale effusie. Door intratracheale instillatietest van polyacrylaat/nanosilica met concentraties van 3.125, 6,25 en 12,5 mg/kg∙mL, de pleurale effusie bij ratten op dag 3, 7-10 dagen in 6,25 en 12,5 mg/kg∙mL groepen, bedroeg gepresenteerd dan langzaam daalde en verdween op dag 14. Wanneer de concentratie van polyacrylaat/nanosilica toeneemt, is de pleurale effusie geproduceerde meer en sneller. Deze vergroeiingen vloeistof werd ontdekt door ultrageluid onderzoek of CT borst scannen en bevestigd door de dissectie van ratten. Silica nanodeeltjes werden waargenomen in de rats pleurale effusie door transmissie-elektronenmicroscoop. Deze resultaten toonden aan dat de blootstelling aan polyacrylaat/nanosilica leidt tot de inductie van pleurale effusie, die in overeenstemming met ons vorige verslag bij de mens was. Dit model is bovendien gunstig zijn voor de verdere studie van Nanotoxicologie en de pleurale effusie ziekten.
Introduction
Pleurale effusie is een veel voorkomende klinische manifestatie van longziekten met allerlei oorzaken. Na een nuttig dier pleurale effusie model is zeer belangrijk om te studeren deze longziekten, de rol van de twee pleura membraan lagen, de mechanismen van pleurale effusie en de behandeling ervan. Echter, sommige meldden pleurale effusie modellen zich vooral richten op het maligne, pleurale effusie of biologische factoren in plaats van de nanodeeltjes in het milieu1,2. Hier introduceren we een nieuw model van pleurale effusie die is eenvoudig, veilig en effectief.
Met de ontwikkeling van nanotechnologie en het uitgebreide gebruik van nanoproducten is er een bezorgdheid over de mogelijke gevaren van nanomaterialen voor het milieu en de gezondheid van de mens3,4. Nanomaterialen introduceren van risicofactoren en potentieel leiden tot nieuwe gevaren op de werkplek of via verontreiniging van het milieu. In vitro en in vivo studies tonen aan dat nanomaterialen in meerdere orgel schade aan de longen, het hart, de lever, de nieren, en het zenuwstelsel, evenals de reproductieve en immuunsysteems5,6 resulteren kan. Bovendien, sommige studies gerapporteerd dat de specifieke toxiciteit van nanomaterialen te wijten aan hun unieke fysisch-chemische eigenschappen3,4,7 was.
We hebben gemeld dat een groep van werknemers met beroepsmatige blootstelling aan nanomaterialen klinisch gepresenteerd met vergroeiingen en pericardvocht effusie, longfibrose en granuloma8,9. Silica nanodeeltjes werden in deze patiënten pleurale effusie9geïsoleerd. Om te reproduceren en controleer of de pleurale effusie geïnduceerd door de geïnhaleerde nanodeeltjes in mens, we het experiment uitgevoerd door de polyacrylaat/nanosilica (PA/NPSi) via de luchtwegen bij ratten, die geïmiteerd menselijke ademhaling in een echte milieu, en vond dat intratracheale instillatietest van PA/NPSi kan resulteren in pleurale effusie bij ratten. We introduceren hier, how to make pleurale effusie bij ratten door intratracheale instillatietest van PA/NPSi, en hoe u kunt isoleren van nanodeeltjes in de pleurale effusie. Dit model kan nuttig zijn voor de verdere studie van Nanotoxicologie en pleurale effusie ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie gevolgd richtsnoeren van kapitaal Medizinische Universität (Peking, P.R China) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures werden goedgekeurd door het dier ethisch comité van kapitaal medische universiteit in China.
1. experimental preparaten
Opmerking: Acclimatiseren de vrouwelijke specifieke pathogenen vrije Wistar ratten (gewicht: 200 ± 10 g) aan de experimentele omgevingen voor een week vóór Administratie (omgevingsomstandigheden: licht / donker: 12h / 12h, temperatuur 22 ± 2 ° C, luchtvochtigheid 50 ± 10%).
- Gebruik een vers 10 mL van PA/NPSi suspensies (nanosilica Ø:20 ± 5 nm door ter plaatse emulsie polymerisatie) verdund in normale zout bij concentraties van 3.125, 6,25 en 12,5 mg/mL, respectievelijk10. Vóór administratie, bewerk ultrasone trillingen ten de schorsingen voor 20-30 min en vortex gedurende 10 minuten om te voorkomen dat nanodeeltjes aggregatie.
- Even een totaal van 20 ratten te verdelen in vier groepen: één groep voor elke concentratie van PA/NPSi (0, 3.125 6.25 en 12,5 mg/mL).
- Om te anesthetize hen, plaatst u de ratten in een ongeopende verpakking met 1,5 mL ether (99,5%) of elke andere IACUC goedgekeurde protocollen. Na 60-90 s van anesthesie, Controleer voor het gebrek aan respons op het pedaal reflex. Zorg ervoor dat de ratten zijn ademhaling.
- Zet de narcose rat op het bord en ook haar voortanden bevestigen met een gesteriliseerde lijn van nylon op het bord.
- Haar mond open en bloot haar horizontalis van glottis met behulp van een chirurgische pincet en frontale lens.
- De ratten met 0,5 mL van PA/NPSi ophanging aan elke rat's Long voor een totaal van 1 mL met behulp van een fijn buisje met een gesteriliseerde botte naald in de bilaterale bronchiën inboezemen.
- Plaats de ratten op een kunststof bord in een liggende positie en laat die de ratten langzaam in 5-10 min herstellen.
2. echografie onderzoek voor pleurale effusie
- Een echografie-systeem gebruiken met een array van de lineaire transducer (frequentie: 8 MHz) te onderzoeken op ratten op dagen 1, 3, 7 en 1410.
- Anesthesie (0.35 mL/100 g, 10% chloraalhydraat, i.p.) geven de ratten en controleer voor het gebrek aan pedaal reflexen.
- Verwijder de haren uit ratten borst en bovenste buik met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Plaats vervolgens de rat op een montageplaat in een liggende positie.
- Dekking van de huid met de gecoate gel, en plaats dan de transducer op de intercostale ruimte en subcostal gebied te detecteren het pleurale vocht.
Opmerking: Om op te sporen de effusie nauwkeurig, links en rechts laterale standpunten werden geselecteerd om een echo-onderzoek uitvoeren. - Zet de rat op een kunststof bord in een liggende positie na echografie onderzoek en laat die de ratten langzaam in 10 min herstellen.
3. borst CT aftasten voor pleurale effusie
- Anesthetize op de post beheer van dagen 7 en 14, de ratten met 10% Chloraalhydraat (i.p). Vind het voldoende diepte van verdoving bij de rat niet reageert op het pedaal reflexen.
Opmerking: Dag 7 na toediening is de meest geschikte tijd om te observeren pleurale effusie door het scannen van CT. - Plaats de rat op een plastic vel in een horizontale positie en vervolgens scannen zijn borst om te onderzoeken van pleurale effusie met een 64-kanaals CT. Use de volgende instellingen: 64 x 0.625 mm detector configuratie, 120 kV (piek) en 350 mAs.
4. verzameling van pleurale effusie en isolatie van nanodeeltjes in de pleurale effusie
- Na borst CT scannen van ratten en onder verdoving van chloraalhydraat, controleren de pedaal reflex van de ratten, scheren van het haar van buik tot borst en vervolgens desinfecteren van de huid door jodium.
- De ratten brengen het chirurgische gebied.
- Onder verdoving, gesneden snel 1-1,5 cm van de huid en de buikspieren aan de xiphoid langs de middellijn met het intact middenrif.
- Zorgvuldig de borst open en inspecteren van bilaterale pleurale holten met behulp van een pincet, met name de bilaterale phrenic hoeken van ribben. 1-2 mL van de pleurale effusie van lichtgeel met een 2 mL steriele injectiespuit verzamelen.
- Zodra gedaan, offeren de ratten met IACUC goedgekeurde protocol.
- Centrifugeer de pleurale effusie in een tube 2 mL gedurende 15 minuten staan bij 300 x g om te isoleren van de nanodeeltjes.
- Gebruik een daling van de bovenste laag de heldere vloeistof is en onder een transmissie elektronen microscope(TEM,) bij een versnellende spanning van 60-80 kV observeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van een thoracale echografie, vonden we geen pleurale effusie op dag 1 in alle groepen. Echter, op dag 3, de pleurale effusie verscheen in de groepen van 6,25 en 12,5 mg/kg∙mL. De effusie was vooral in de rechts ribben phrenic hoek, terwijl de pericardvocht effusie alleen gepresenteerd in 12,5 mg/kg∙mL groep. Bovendien, op dag 7, pleurale effusie (Video 1) zowel pericardvocht effusie (Video 2) werden ontdekt in 6,25 mg/kg∙mL groep (Figuur 1). Pleurale effusie langzaam verhoogd tot zoveel op 7-10 dagen en vervolgens daalde geleidelijk. Op dag 14 bleek geen pleurale effusie meer, maar met het teken van hechting van borstvlies in alle groepen. 10
Er waren geen tekenen van de pleurale effusie in 3.125 en 6,25 mg/kg∙mL groepen10dagen 7 en 14. Echter in de 12,5 mg/kg∙mL-groep was de borst CT scanning abnormaal met de botte posterieure costophrenic-hoek, die gezinspeeld op een kleine hoeveelheid pleurale effusie (Figuur 2a, b). Geen tekenen van het vloeistofniveau werden waargenomen, die werd verklaard als gevolg van een onvoldoende hoeveelheid water.
Bij dissectie van ratten waargenomen we amber of kleurloos effusie in de 6,25 mg/kg∙mL en 12,5 mg/kg∙mL groepen op dagen 3 en 7. De volumes van pleurale effusie variëren van 1-1.8 mL in elke pleurale holte in de 6,25 mg/kg∙mL en 12,5 mg/kg∙mL groepen. In de groep van 3.125 mg/kg∙mL verscheen geen vocht in de pleurale Holten in de volledige experimentele proces.
Met de TEM vormde de NPSi nanodeeltjes afzonderlijk gepresenteerd en de clusters in de gedraineerde pleurale vloeistof. De gemiddelde diameter (Ø: 20 ± 5 nm) en de morfologie in de pleurale vloeistof waren consistent met de NPSi in de bereid schorsing. De nanodeeltjes waren meestal bolvormig en goed verspreide, en de gemiddelde grootte van een individuele nanoparticle werd ~ 20 ± 5 nm(figuur 3, ondera, b).
Figuur 1 : Representatief beelden van pleurale effusie door sonographic bevindingen op dag 7. (a, b) Sonographic beelden van een rat in de groep 3.125 mg/kg∙mL met geen vloeistof in de pleura en pericardvocht Holten. (c, d) Sonographic beelden van een rat in de 6,25 mg/kg∙mL-groep met duidelijk pleurale effusie en pericardvocht effusie. (e, f) Sonographic beelden van een rat in de groep van 12,5 mg/kg∙mL met veel meer vocht in de pleurale en pericardvocht Holten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Representatieve beelden van thoracale CT-beelden in ratten. CT van het beeld van een rat in de 3.125 mg/kg∙mL-groep met geen pleurale effusie (een) en CT beeld van een rat in de 12,5 mg/kg∙mL-groep met een negatieve bevinding van vrije vloeistof maar de botte posterieure costophrenic hoek in de pleurale ruimte (b). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Silica nanodeeltjes in polyacrylaat/nanosilica vering en de pleurale effusie van een rat. (een) Silica nanodeeltjes in polyacrylaat/kiezelzuur nanocomposietmaterialen. (b) Silica nanodeeltjes in de pleurale effusie van een rat met clusters of individuele vorm. Schaal bar: 200 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1. De pleurale effusie in een rat in de groep 6,25 mg/kg∙mL. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2. De pericardvocht effusie in de rat in de groep 6,25 mg/kg∙mL. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Echografie is het meest geschikte hulpmiddel voor het bepalen van longziekten, vanwege haar uitstekende gevoeligheid voor de gratis vloeistof in de spouw van Pleurale11. Dat komt omdat echografie kan onmiddellijk het contrast detecteren in akoestische impedantie van lucht en vocht in de longen12. Bovendien, de echografie is flexibeler in een klein dier model dan CT. Niettemin, de lucht in de longen het gevolg van de geluidsgolf en belemmerd van het waarnemen van de intrapulmonary wijzigingen na nanodeeltjes instillation. Dus we borst CT-scan en longkanker echografie te onderzoeken van de intrapulmonary wijzigingen en de pleurale vocht gecombineerd.
Na het verkennen van de beeldvorming gegevens, vonden we de imaging resultaten opmerkelijk. In de eerste plaats blijkt ons model dat de PA/NPSi, inderdaad de ongebruikelijke toxiciteit, die was manifesteerde als de pleura en de pericardvocht effusie in het vroege stadium van de rat-model geïnduceerde. Ten tweede, dit model gereproduceerd met succes het ontstaan en de ontwikkeling van menselijke polyserous effusie; Ondertussen, deze processen werden waargenomen bij onze patiënten, die gepresenteerd met vergroeiingen en pericardvocht effusie, longfibrose en granuloma8,9. Dus, deze feiten impliciet dat het membraan met zoals de pleurale membraan of de pericardvocht membraan was één van de doelwitten van de schade van PA/NPSi, die qua aard vergelijkbaar enerzijds veroorzaakt door asbest. Ook was de tijdlijn van polyserous effusie zinvolle zoals gesloten door onze bevindingen.
Wat betreft het ontwerp van ons model was de intratracheale instillatietest de kritische stap. Deze methode ervoor gezorgd dat de toxiciteit van nanoparticle het lichaam via de trachea, die van de vorige studie13 verschildeingevoerd. De nadelen van deze methode, waren echter als volgt: de PA/NPSi bilaterale bronchiën werd ingeprent door de fijne buis, die zeer experimentele vaardigheden om te voorkomen dat de mechanische schade aan de luchtpijp en de hoest veroorzaakt als gevolg van zijn irritatie vereist. Het kritieke punt was dus de juiste scherptediepte intratracheale instillatietest. Ondertussen, behoud van goede verdoving was cruciaal voor het uitvoeren van de bovengenoemde stappen.
Het gebruik van nanodeeltjes, de fijne deeltjes voor de onderzoeksdoeleinden zijn het oppakken van meer en meer aandacht. Hoe kleiner de diameter van de fijne deeltjes, hoe moeilijker het is om hen te beschermen. Aan de andere kant, vereist de nano-siliciumdioxide met een diameter van 20 ± 5 nm inderdaad een hightech voorbereiding methode ter voorbereiding van deze studie, veroorzaakt een verhoging in moeilijkheden met de afname van de diameter. Dus, een van de Pro's van onze techniek was de diameter van nano-silica, die kleiner is dan de vorige studie13,14. Een ander voordeel van deze studie was dat we de nanoparticle via tracheale in plaats van huid of omloop13,15,16opgewekt. Bijvoorbeeld, belemmerd de intraveneuze blootstelling ons bij het onderzoeken van de doel-orgel, dat moeilijk was te onderscheiden van de schade van het orgaan van de target getriggerd door de primaire of secundaire schade. Volgens ons is de intratracheale instillatietest dus de beste manier om de onderzoeken van de toxiciteit van de nanoparticle van de longen in de komende toekomst. Trouwens, de dosering van nanoparticle lager was dan de vorige studie13, die een hogere kosten-batenverhouding gepresenteerd.
Wat betreft de pleura en de pericardvocht effusie geïnduceerd door PA/NPSi, zou de ontsteking reactie en de productie van reactieve zuurstof systeem (ROS) de oorzaak daarvan. We legde het als volgt: ten eerste, de nanosilica verhoogd ROS concentraties, inflammatoire productie veroorzaakte, veroorzaakt mitochondriale depolarisatie en glutathion verlagingen zowel in vivo en in vitro5,6. Ten tweede, ontsteking en productie van ROS verhoogd de interstitiële vloeistof in de longen of de permeabiliteit van de pleura haarvaten, die de vorming van pleurale effusie eind bevorderd. Bovendien, de mogelijke bijzondere waardevermindering van de pleura lymfdrainage kan ook worden betrokken bij de ophoping van de pleurale vocht. Met meer ophoping van Pleurale vocht, de oncotic druk nam toe, die ten slotte geïnduceerde de afzetting van PA/NPSi in pleurale holtes. Dit resultaat strookte met onze vorige dierproeven en patiënt8,10gemeld.
Voor de pleurale effusie zelf was het overwegend in de kliniek. Echter, vele ademhalings of systemische ziekten kan pleurale effusie. Dus zou bouw een dierlijk model profiteren de etiologische studie van de pleurale effusie. De vorige studie gemeld de toxiciteit van de longkanker van nanosilica13,17. Echter de vorige modellen van de gerapporteerde pleurale effusie voornamelijk gericht op de biologische factoren in plaats van nanodeeltjes18,19. Daarom bleef de dosering van nanoparticle een open kwestie. Ons model aangetoond dat pleurale effusie vond plaats op dag 3 na een PA/NPSi concentratie van 6,25 mg/kg∙mL werd beheerd door intratracheale instillatietest en piekte op 7-10 dagen. Bovendien, met toenemende concentraties van PA/NPSi, de pleurale effusie geproduceerde meer en sneller. Bovendien was in vergelijking met biologische modellen18,19, ons model van pleurale effusie goed-controleerbaar en effectief. Kortom, zou ons model gunstig zijn voor de toekomstige studies van pleurale effusie ziekten, alsook wat betreft de verdere studie van de nanotoxicity in het bijzonder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De huidige studie en de productie naar dit artikel werden gefinancierd door het National Natural Science Foundation of China (Grant 81773373, 81172614 en Grant 81441089). Wij danken Dr. Jin Yan en Dr. Pan Yujie, departement van de noodtoestand, Beijing Chaoyang ziekenhuis, en Dr. Qu Peng van afdeling van echografie geneeskunde, Beijing Chaoyang ziekenhuis voor het helpen met de videoproductie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
- Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
- Maynard, A. D., et al.
- Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606 (2013).
- Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
- Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
- Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
- Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
- Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
- Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
- Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
- Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
- Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
- Hikaru, N., et al.
- Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
- Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).
