Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Synthese von einem einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen (SWCNT)-konjugiert MALAT1 antisense Gapmer DNA-Oligonukleotid (SWCNT-Anti-MALAT1), welche die zuverlässige Zustellung der SWCNT und potente Wirkung des zeigt Anti-MALAT1 in vitro und in vivo. Methoden zur Synthese, Modifikation, Konjugation und Injektion von SWCNT-Anti-MALAT1 werden beschrieben.
Abstract
Die einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen (SWCNT) ist eine neue Art von Nanopartikel, die verwendet wurde, um mehrere Arten von Drogen in Zellen, wie Proteine, Oligonukleotide und synthetischen kleinen Molekül-Drogen zu liefern. Die SWCNT verfügt über anpassbare Dimensionen, oberflächliche großflächig und kann flexibel mit Drogen durch verschiedene Modifikationen an seiner Oberfläche binden; Daher ist es ein ideales System, Medikamente in die Zellen zu transportieren. Lange forensisches RNAs (LncRNAs) sind eine Gruppe von mehr als 200 nichtcodierender RNA nt, die nicht in Protein übersetzt werden, sondern spielen eine wichtige Rolle in biologischen und pathophysiologischen Prozessen. Metastasen-assoziierten Lunge Adenokarzinom Transkript 1 (MALAT1) ist eine hoch konservierte LncRNA. Es konnte gezeigt werden, dass höhere MALAT1 die schlechte Prognose der verschiedenen Krebsarten, einschließlich Multiples Myelom (MM) verbunden sind. Wir haben gezeigt, dass MALAT1 DNA-Reparatur und Zelle Tod im MM regelt; So können MALAT1 als ein therapeutisches Ziel für MM betrachtet werden. Die effiziente Bereitstellung von antisense Oligo zu hemmen/Zuschlag MALAT1 in-vivo ist jedoch nach wie vor ein Problem. In dieser Studie wir SWCNT mit PEG-2000 zu ändern und eine Anti-MALAT1-Oligo zu konjugieren, testen die Lieferung dieses mittels in-vitro-injizieren es intravenös in einem verbreiteten MM-Maus-Modell und beobachten eine deutliche Hemmung der MM-Progression, was darauf hindeutet Diese SWCNT ist eine ideale Lieferung-Shuttle für Anti-MALAT1 Gapmer DNA.
Introduction
Die SWCNT ist eine neuartige Nanomaterialien, die verschiedenen Arten von Drogen, wie Proteine, kleine Moleküle und Nukleinsäuren, stabil und effizient mit ideale Verträglichkeit und minimale Toxizität in Vitro1 und in-vivo2liefern kann. Funktionalisierten SWCNT kann hat große Biokompatibilität und Wasser Löslichkeit, kann als ein Shuttle für kleinere Moleküle verwendet werden, und sie dringen in die Zellmembran3,4,5.
LncRNAs sind eine Gruppe von RNA (> 200 nt), die aus dem Genom zu mRNA transkribiert werden, aber nicht in Proteine übersetzt werden. Erhöhung der Beweis hat gezeigt, dass LncRNAs in der Regulation der Gene Expression6 beteiligen und engagieren sich in der Initiierung und Progression der meisten Arten von Krebs, einschließlich MM7,8,9. MALAT1 ist ein nuklearer bereichert forensisches Transkript 2 (NEAT2) und einer hoch konservierten LncRNA10. MALAT1 wird zunächst im metastasierten nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) Krebs11erkannt, aber hat in zahlreichen Tumoren5,12,13überexprimiert wurden; Es ist eines der höchst exprimierten LncRNAs und korreliert mit einer schlechten Prognose in MM8,14. Die Expression des MALAT1 ist signifikant höher bei tödlichen Kurs extramedulläre MM Patienten im Vergleich zu denen nur als MM15diagnostiziert.
In einer früheren Studie haben wir bestätigt, dass Anti-MALAT1 Oligos robust zu DNA-Schäden und Apoptose in MM16 führen mithilfe von Gapmer DNA antisense Oligonucleotides targeting MALAT1 (Anti-MALAT1) in MM-Küvetten. Die Gapmer DNA besteht aus antisense-DNA und verbunden durch 2'-OMe-RNAs, die MALAT1 Spaltung durch RNase H-Aktivität nach der Bindung17veranlassen könnte. Die in-vivo Transporteffizienz antisense Oligos begrenzt noch seiner klinischen Verwendung.
Um die Lieferung zu testen SWCNT-Effekt für Anti-MALAT1 Gapmer Oligos, die Anti-MALAT1-Gapmer, die DNA zu DSPE-PEG2000-Amin konjugiert wird funktionalisiert SWCNT. SWCNT-Anti-MALAT1 wird in einem MM disseminierter Mausmodell dann intravenös injiziert; eine markante Hemmung wird nach vier Behandlungen beobachtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente mit Tieren wurden vorab von der Cleveland Clinic IACUC (institutionelle Animal Care und Use Committee) genehmigt.
1. Synthese funktionalisierter SWCNTs
- Mischen Sie 1 mg SWCNTs, 5 mg DSPE-PEG2000-Amin und 5 mL sterilisiert Nuklease-freies Wasser in ein Glas funkeln Fläschchen (20 mL). Schütteln Sie es gut auf alle Reagenzien vollständig auflösen.
- Beschallen Sie das Fläschchen in einem Wasser-Bad-Sonikator einer Sendeleistung von 40 Watt für 1 h bei Raumtemperatur (RT, 20 min x 3, wechseln Sie das Wasser alle 20 min um eine Überhitzung zu vermeiden). Dann, bei 24.000 X g für 6 h Zentrifugieren Sie und sammeln Sie die überstehende Lösung. Diese funktionale SWCNT Lösung kann für 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
- Hinzugeben Sie 1 mL SWCNT Lösung aus Schritt 1.2 auf einem 100 kDa MWCO zentrifugale Filter Gerät, gefolgt von 4 mL sterilisiert Nuklease-freies Wasser. Zentrifuge für 10 min bei 4.000 X g bei RT, zusätzliche DSPE-PEG2000-Amin zu entfernen. Wiederholen Sie den Zusatz von 4 mL Wasser und der Zentrifugierung 5 X. Mehr als 0,5 mL der übrig gebliebenen SWCNT Lösung verbleibt im Filter nach jedem Zentrifugation.
- Messen der Konzentration der SWCNT Lösung übrig gebliebenen im Filter ein UV/VIS-Spektrometer mit 808 nm nach dem letzten waschen. Die letztendliche Konzentration ist in der Regel ca. 50 mg/L (berechnet nach der Methode von Kam Et Al.18entwickelt).
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass DSPE-PEG-funktionalisiert SWCNTs wasserlöslich nach Schritt 1.4 sind und sind in verschiedenen biologischen Lösungen ohne sichtbare Aggregation nach ein paar Wochen stabil.
2. Konjugation von Anti-MALAT1 Gapmer DNA flankiert von 2'-O modifizierte RNAs an funktionalisierten SWCNT
- Fügen Sie 0,5 mg Sulfo-LC-SPDP in 450 µL DSPE-PEG2000-Amin SWCNT funktionalisiert. Fügen Sie 50 µL 10 X PBS und dann 2 h bei RT inkubieren
- Um zusätzliche Sulfo-LC-SPDP zu entfernen, fügen Sie die Reaktion der Schritt 2.1 auf einem 100 kDa MWCO zentrifugale Filter Gerät, gefolgt von 4 mL Nuklease-freies Wasser. Zentrifugieren Sie 5 X für 10 min bei 4.000 X g bei RT Repeat Zugabe von 4 mL Wasser und der Zentrifugierung.
- Fügen Sie 200 nM Thiol-modifizierten Anti-MALAT1-Cy3 Gapmer DNA in 1,5 mL der kommerziellen DVB-t-Lösung und inkubieren Sie 90 min bei RT Purify das Produkt mit einer NAP-5 Spalte, nach der Hersteller-Protokolls. Eluieren Anti-MALAT1-Cy3 mit 500 µL sterilisierte Nuklease-frei 1 x PBS.
Hinweis: Die funktionalisierten SWCNT speicherbar mit zusätzlichen DVB-t, das Disulfid Anleihen bei der Lagerung von Thiolated Anti-MALAT1 Gapmer DNA gebildet Spalten könnte. Die zusätzlichen DVB-t kann durch aNAP-5 Spalte vor Konjugation mit SWCNT entfernt werden. - Die Sulfo-LC-SPDP-behandelten DSPE-PEG2000-Amin SWCNT Lösung bleibt im Filter sammeln und mit 500 µL Anti-MALAT1-Cy3 Lösung verdünnen. Inkubieren Sie es dann bei 4 ° C für 24 h. 3 Wochen kann die konjugierte SWCNT-Anti-MALAT1 bei 4 ° C aufbewahrt werden. Nach dem gleichen Verfahren kann die konjugierte SWCNT mit Scramble antisense Oligo synthetisiert und als SWCNT-Kontrolle verwendet werden.
(3) Tail Vene Injektion von SWCNT-Anti-MALAT1
-
Ein MM disseminierter Mausmodell zu generieren.
- Um die besten Ergebnisse des Vergleichs zu erreichen, ordnen Sie nach dem Zufallsprinzip 14 NOD. CB17-Prkdcscid/J Mäusen (8 Wochen alt) in Test- oder Kontrolle Gruppen (sieben in jeder Gruppe) mit dem gleichen Verhältnis Männer/Frauen.
- Reinigen Sie die Betrieb-Bank und sterilisieren sie mit 70 % Alkohol.
- Verwenden Sie eine Wärmelampe, die Maus, um das Heck Vene erscheinen helfen warm. Die Maus richtig mit einer Rute Injektion Restrainer zurückhalten.
- 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry Zellen in 50 µL PBS durch die Rute Vene ohne Betäubung zu injizieren. Drücken Sie die Einstichstelle mit einem Alkoholtupfer für 30 S. Mark der injizierten Maus und schicken Sie es an einem sauberen Käfig.
-
Beginnen Sie die Behandlung am 7. Tag nach der Injektion MM.1S Zelle.
- 50 µL PBS mit SWCNT-Anti-MALAT1 in die Rute Vene der Maus zu injizieren. Verwenden Sie PBS, SWCNT-Steuerelement als Steuerelement enthält.
- Drücken Sie die Einstichstelle mit einem Alkoholtupfer für 30 s.
- Beachten Sie die lokale Blutung auf das Heck und das allgemeine Verhalten der Maus für 1 min, und dann zu einem sauberen Käfig zurückkehren. Beobachten Sie alle eingespritzten Mäuse wieder vor der Rückkehr des Käfigs in das Rack, um sicherzustellen, dass die Injektionen gut vertragen werden.
-
Wiederholen Sie die Injektion alle 7 Tage bis zur Beendigung des Experiments.
- Das Experiment zu beenden, wenn die allgemeine Gesundheit der Maus verschlechtert: als nicht essen oder trinken, das Erscheinungsbild der blasse Pfoten, eine subkutane Blutung, Kurzatmigkeit, verringerte Aktivität, eine Lähmung der unteren Gliedmaßen und/oder eine berührbare Masse in die Bauch wird beobachtet.
4. Bewertung der Fortschreiten der Erkrankung
- Bewerten Sie den allgemeinen Status der Mäuse jeden Tag nach der Injektion MM.1S-Luc-mCherry Zelle. Achten Sie besonders wenn die Mäuse entwickeln lähmt der unteren Extremitäten.
-
Bewerten Sie das Tumorwachstum mit einer in-vivo imaging-System 1 x in der Woche vor der Injektion SWCNT-Anti-MALAT1.
- Bereiten Sie frische 15 mg/mL D-Luciferin mit 1 X PBS.
- Die Mäuse mit einer Isofluran-Verdampfer (3 – 5 % für die Induktion und 1 – 3 % für die Wartung, abhängig vom Status der Mäuse) zu betäuben.
- 150 mg/kg D-Luciferin in jeder Maus intraperitoneale Injektion, 5 min vor Bildgebung; dann Bild die Mäuse in Bauchlage mit einem Spektrum imaging-System.
- Sammeln Sie aufeinander folgenden Bildern der Mäuse alle 2 min bis Lumineszenz Sättigung erreicht ist. Stellen Sie die Intervallzeit entsprechend dem D-Luciferin Aufnahme/Signal.
- Verwenden Sie CO2 , die Mäuse zu opfern, die Beendigung des Experiments angelangt ist.
-
Da es ein MM verbreiteten Modell handelt, verarbeiten Sie die Mäuse wie folgt.
- Wiegen Sie die Maus vor der Präparation.
- Peripheren Blut aus dem Herzen für ein komplettes Blutbild (CBC)-Assay durchgeführt durch eine Blutzelle Zähler Maschine zu sammeln. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen und rote Blutkörperchen sowie das Verhältnis von Lymphozyten, sind die primären Indizes.
- Isolieren Sie die Milz zu und wiegen Sie es. Berechnen Sie das Verhältnis der Milz/Körpergewicht; Ansicht > 0,5 % als Erweiterung der Milz.
- Das Gewebe von Knochenmark, Lymphknoten, Milz, Nieren und das Gewebe mit sichtbaren Metastasen zu sammeln.
- Sammeln Sie die Wirbelsäule, wenn die Maus eine Lähmung der unteren Gliedmaßen entwickelt.
- RNA und Proteine aus dem Knochenmarkproben zu extrahieren.
- Beheben Sie alle restlichen Gewebe in Formalin.
- Tauchen Sie für Entkalkung die Knochenproben in 0,25 M EDTA-Lösung (pH 8,0) für 5 Tage nach 24 Stunden nach der Fixierung.
- Tauchen Sie alle Proben in 75 % Alkohol für langfristige Lagerung.
- Vergleichen Sie die Signalstärke der Luciferase zu den gleichen Zeitpunkten in zwei Gruppen. Zeichnen Sie aus beiden Gruppen die Opfer-Termine für jede Maus und berechnen Sie Survival-Kurven der beiden Gruppen mit Software zu.
Hinweis: Alle Verfahren sind in Abbildung 1zusammengefasst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Wirkung der Hemmung der Anti-MALAT1 Gapmer DNA in MM zu demonstrieren, wir die Expression von MALAT1 abgerissen und in H929 und MM.1S Zellen verwendet. Achtundvierzig Stunden später wurden Zellen für die Analyse der Knock-down Effizienz und der Status der Apoptose in Zellen mit Anti-MALAT1 Gapmer oder Kontrolle DNA transfiziert. qRT-PCR-Ergebnisse zeigten, dass der MALAT1 Ausdruck in H929 und MM.1S Zellen effizient Anti-MALAT1 Gapmer DNA abgerissen (Abb. 2A). Der Status der Apoptose durch Durchflusszytometrie, die nach unten reguliert MALAT1 induzierte Apoptose deutlich offenbart bestimmt war (Abbildung 2B).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Anti-MALAT1 Oligos MM effektiv in vitro hemmen. Allerdings benötigt ein effiziente Lieferung Methode/Shuttle für in-vivo Anti-MALAT1 Oligos entwickelt werden, was auch das Hindernis der antisense Oligos in der klinischen Anwendung; Daher unser Interesse an SWCNT. SWCNT ist eine neuartige Nanomaterialien für Drug-Delivery, die Hydrophilie und Auflösbarkeit nach entsprechenden Modifikationen entwickeln kann; Daher kann es in verschiedenen Formen, wie z. B. Oligonukleotid Medikamente Ladungen liefern. Um die Transporteffizienz SWCNT in vivo zu validieren, funktionalisiert wir zuerst die SWCNT mit DSPE-PEG2000-Amine, dotierten Hydrophilie und verbindliche Spezifität auf die SWCNT19. Dann wurde dieser funktionalen SWCNT mit Sulfo-LC-SPDP, kostenlose Sulfhydryl-Gruppen erstellen, die verwendet wird, um eine Verbindung mit dem Oligo behandelt. Um die Anti-MALAT1-Oligo und Sulfo-LC-SPDP-behandelten SWCNT konjugieren, die 5'-Enden der Anti-MALAT1-Oligo modifiziert mit Thiol-Gruppen (S-S); um die Lieferung sichtbar zu verfolgen, wurde mit Cyanin 3 (Cy3) 3' Ende der Anti-MALAT1-Oligo verändert. Nach all den Synthese-Schritten SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 wurde (Abbildung 1)12erhalten. Dann wurde es dem Kulturmedium H929-GFP und MM.1S-GFP Zellen, die Transporteffizienz zu validieren hinzugefügt.
Wie in Abbildung 2C, SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 effizient in den Zellkern der MM-Küvetten geliefert wurde und deutlich unterdrückt die endogene MALAT1 Ebene in H929 und MM.1S Zellen (Abbildung 2D). Um die Toxizität und Sicherheit der SWCNT in normalen Zellen zu untersuchen, wurde SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 im Medium der BMEC-1-Zellen in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt; Lipofectamine war die Therapiekontrolle; Plain Medium diente als wesentliche Kontrolle (Abb. 2E). Dann wurde Zellviabilität gefunden mit einer Zelle Lebensfähigkeit Assay Kit an Tag 1, Tag 2 und Tag 3. Keinen signifikanten Unterschied in Zelle Lebensfähigkeit Hemmung fand zwischen SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 und die Therapiekontrolle bei verschiedenen Dosierungen und Zeitpunkten. Es gab keinen Unterschied im Vergleich zu einfachen Medium (NC), die angibt, dass die Toxizität von SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 ist ähnlich wie bei der Therapiekontrolle hat eine begrenzte und akzeptable Toxizität zu normalen Zellen bei hoher Dosierung.
Als nächstes war ein Mensch-MM disseminierter Mausmodell etabliert, Bewertung die Auswirkungen der Behandlung von SWCNT-Anti-MALAT1 in-vivo. Erstens jede SCID-Beige-Maus (von 8 Wochen alt) wurde mit 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry Zellen intravenös injiziert (Abbildung 3). Insgesamt 14 Mäuse wurden mit MM.1S Zellen injiziert; unter ihnen sieben Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in einer Behandlungsgruppe SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 angeordnet, und weitere sieben waren in der Kontrollgruppe. SWCNT-Anti-MALAT1 und SWCNT-Kontrolle Oligos wurden in 0,5 mL 1 X PBS aufgelöst und durch den Schweif Venen 7 Tage nach der Injektion Tumor Zelle injiziert. Die SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 Behandlung wiederholte sich alle 7 Tage bis zur Beendigung des Experiments. Um die Tumorlast zu bewerten, wurde das Luciferin-Signal durch eine in-vivo imaging-System (IVIS) 30 min nach der Injektion von Luciferin 1 x in der Woche vor der SWCNT-Oligo-Injektion beobachtet. Wir fanden, dass das Luciferin Signale der Mäuse in der Behandlungsgruppe SWCNT-Anti-MALAT1 nach 21 Tagen der Behandlung (ab 28. Tag) bemerkenswert niedriger mit derjenigen der SWCNT Behandlung-Kontrollgruppe verglichen wurden. Ihre Gesundheit und das Überleben Status wurde überprüft und täglich aufgezeichnet und zusammengefasst in einer Kaplan-Meier-Kurve. Aus diesen Ergebnissen schlossen wir, dass die SWCNT-Anti-MALAT1 Behandlung durch intravenöse Injektion des Anti-MALAT1-Oligos Tumorzellen effektiv liefern kann. Wir, dann, begrenzt die Tumorlast und verlängert die Mäuse Lebensdauer (p = 0,04) wie erwartet, das ist ähnlich wie in-vitro-Ergebnisse. Wir fand keine signifikanten Nebenwirkungen der Behandlung in den Mäusen zur Zeit das ganze Experiment nicht die ergab, dass die SWCNT-Anti-MALAT1-Injektion eine sichere Behandlung für Mäuse ist; SWCNT ist daher eine sichere und zuverlässige in-vivo Liefersystem für Anti-MALAT1.
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Synthese, Absorption, und in-vivo Dissoziation ein SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 Gapmer Oligo. (A) SWCNT funktionalisiert mit DSPE PEG2000 Amine und anschließend konjugiert mit Anti-MALAT1-Cy3 über Disulfid Bindung von Sulfo-LC-SPDP vermittelt wurde. (B) SWCNT-konjugierten Anti-MALAT1 wurde in eine Maus mit MM.1S-Luc-mCherry Zellen durch die Rute Vene injiziert. (C) SWCNT-konjugierten Anti-MALAT1 dringt die Phospholipid Bilayer Membran durch Einfügung oder Endozytose. (D) SWCNT-Anti-MALAT1 wurde im frühen Endosomen nach Absorption durch Zellen verpackt; dann die frühen Endosom gereift zu einem späten Endosom und fusionierte mit Lysosomen, eine Endolysosome zu bilden. Die Endolysosome hilft Anti-MALAT1 von der SWCNT lösen, indem die Disulfid Bindung zu brechen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : SWCNT-Anti-MALAT1 mit minimaler Toxizität effizient geliefert wurde, und induziert Apoptose in Zelllinien MM. SWCNT-Anti-MALAT1 Gapmer Oligo oder SWCNT-Kontrolle Oligo wurden von Lipofectamine in H929 und MM.1S Zellen, bzw. transfiziert. Achtundvierzig Stunden später sammelten wir Zellen für (A) die Analyse der MALAT1 Ausdruck von qRT-PCR und (B) Apoptose Analyse von Durchflusszytometrie. (C) H929-GFP und MM.1S-GFP Zellen waren für 48 Stunden mit SWCNT-Anti-MALAT1-Cy3 Co kultiviert; die Transporteffizienz wurde durch Fluoreszenzmikroskop bestimmt (die Maßstabsleisten = 100 µm). (D) der Ausdruck Ebene ofMALAT1 wurde vom qRT-PCR, die zeigten, dass es erfolgreich in H929 und MM.1S Zellen abgerissen wurde erkannt (** p < 0,01 *** p < 0,001). (E) SWCNT und die Therapiekontrolle wurden in einem Nährmedium BMEC-1-Zellen in verschiedenen Dosierungen. Die Verbreitung wurde gemessen mit einer Zelle Lebensfähigkeit Assay Kit. Diese Zahl wurde von Hu Et Al.16geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : SWCNT-Anti-MALAT1 unterdrückt Myelom wächst in MM.1S-konstruierten MM disseminierter Mausmodell. (A) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry Zellen wurden intravenös injiziert, an der Rute Venen von bestrahlten Mäusen in SCID-Beige (sieben in jeder Gruppe); 50 μL einer SWCNT-Anti-MALAT1 oder SWCNT-Control-Lösung wurden alle 7 Tage über die Rute Vene ab dem 7. Tag nach der Injektion MM.1S Zelle injiziert. IVIS diente, das Tumorwachstum zu überwachen. (B) hinteren Extremität Lähmung und Tumor Belastung dienten als Endpunkte und die Überlebensdaten wurden durch eine Kaplan-Meier-Analyse analysiert. Diese Zahl verändert wurde, vom Hu Et Al.16. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beweis hat gezeigt, dass bei der Regulierung der zahlreiche physiologische und pathophysiologische Prozesse im Krebs, einschließlich MM7,8,9LncRNAs teilnehmen; Sie haben das Potenzial für die Krebsbehandlung, ausgerichtet werden, die von antisense Oligonukleotide20,21,22realisiert werden können. Die US Food and Drug Administration (FDA) genehmigte mehrere antisense-Oligonukleotid-Drogen, einschließlich Fomivirsen für Cytomegalovirus Retinitis23, Mipomersen für homozygote familiäre Hypercholesterinämie24, Nusinersen für Spinale Muskelatrophie25und Eteplirsen für Duchenne-Muskeldystrophie-26. In dieser Studie haben wir modifiziert die Anti-MALAT1 Gapmer DNA mit 2'-OMe-RNA und mit funktionalen SWCNT konjugierten. Die SWCNT trägt und liefert Anti-MALAT1 Oligos als Shuttle, die nicht nur die Affinität des Oligo-Ziels aufgrund seiner Flexibilität und mehrere laden verbessert aber auch die Oligos stabilisiert und half Nuklease Verschlechterung während der Entbindung27 .
Eine geeignete Modifikation auf der Oberfläche des SWCNTs kann mir helfen zuverlässig Dispergierbarkeit in physiologisch relevanten, wässrigen Umgebungen zu erhalten und zu fördern ihre Bioverteilung28,29. Wir nutzten DSPE-PEG2000-Amin SWCNT, ändern die Pfropfen auf SWCNT und verbessern die wässrige Löslichkeit von ihm nachgewiesen wurde, und es zeigte darüber hinaus hervorragenden Stabilität ohne Agglomeration in biologischen Medien30. Sulfo-LC-SPDP diente als Vernetzer im Experiment, das half funktionalisierten SWCNT binden die Anti-MALAT1 Gapmer DNA durch Disulfid-Verknüpfung, und danach in die Zellen zu liefern. Sobald die SWCNT in MM Zellen eingedrungen ist, wurden sie von frühen Endosomen (pH ~ 6.0) übernommen, die dann zum späten Endosomen (pH ~ 5.0) begleitet von einem reduzierten pH Wert31gereift. Der Vorteil der PEG-Link ist, dass die Bindung stabil bei pH > 6, aber bis zu 75 – 95 % der PEG-linked Droge wurde innerhalb von 2 Stunden, wenn der pH-Wert unter 5,532,33,34wurde veröffentlicht. Endosomen tragen SWCNT-Anti-MALAT1 fusionierte mit Lysosomen (pH ~ 4,5), eine Endolysosome zu bilden, und dann das Disulfid, die Anleihen von lysosomalen Thiol-Reduktase katalysiert wurden die optimal bei einem niedrigen pH-Wert35aktiviert wurde. Hierzu veröffentlicht anschließend kostenlose Anti-MALAT1 Gapmer DNA. Laut der Testergebnisse in vitro und in vivo die SWCNT SWCNT-Anti-MALAT1 effektiv geliefert und half es ähnlich in Funktion, Anti-MALAT1 in-vitro-handeln.
Die funktionalisierten SWCNTs Pass-through Phospholipid Bilayer über zwei Muster: Einfügung36,37 und Endozytose38,39. Diese Verfahren helfen, die Ladungen in Zellen zu liefern, ohne Unterbrechung der Stabilisierung von Zellmembranen, daher reduziert die Toxizität von der SWCNT SWCNT. Wir injiziert 50 µL SWCNT-Anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) in jeder Maus (~ 20 g); so war die endgültige Wirkstoffkonzentration 0,1 mg/kg, das ist viel niedriger als die Dosis, die wir in Toxizität Experimente (2 mg/L und 4 mg/L) verwendet. Wie frühere Ergebnisse zeigten, SWCNT hat eine ähnliche Wirkung wie die Therapiekontrolle (z. B. Lipofectamine) auf das Zellwachstum und Lebensfähigkeit bei Dosierungen abgestimmt. Die Therapiekontrolle ist eine gemeinsame Reagenz zur Transfektion von Zellen und wird geglaubt, um eine begrenzte und akzeptable Toxizität auf Zellen haben; so glauben wir, dass SWCNT hat nur eine minimale Toxizität für normale Zellen.
Als Shuttle für antisense-Oligonukleotide ist Stoffwechsel ein weiterer wichtiger Aspekt für die Sicherheit der SWCNT. Es wurde nachgewiesen, dass funktionalisierten SWCNT vor allem Nieren ohne glomeruläre und tubuläre Toxizität40ausgeschieden wird. Wir fanden nicht Nieren Dysfunktion-Symptomen, wie z. B. Harnbildung, Ödeme, Oligurie, Darstellungsänderungen der Niere, etc., bei Mäusen, die die SWCNT Injektion akzeptiert. So haben SWCNTs keine Toxizität Wirkungen durch eine abnormale Ansammlung in einer Maus mit einer normalen Nierenfunktion.
Wir sind die ersten Gegenstrang Oligonucleotides targeting LncRNA mit funktionalisierten SWCNT konjugieren und verwenden es für MM-Behandlung. SWCNT ist eine neuartige Nanomaterialien, die konsequente Chiralität, optional Durchmesser und Längenverteilung hat. Nach der Funktionalisierung Behandlung SWCNTs entwickeln Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität und eine ideale biologische Shuttle zahlreiche Fracht durch die Zellmembran, dadurch Erhöhung der Verteilung von Medikamenten und Behandlung Wirkung liefern. Darüber hinaus kann SWCNT Gegenstrang Oligonukleotid Moleküle von Nuklease Verdauung1stabilisieren. Wie die Ergebnisse zeigen, die funktionalisierten SWCNT-Anti-MALAT1 MALAT1 in MM Zellen effizient geliefert und MM Wachstum dramatisch in Zelllinien in-vitro- und in einem in-vivo disseminierter Mausmodell gehemmt. Bisher wir keine Giftigkeit aufgrund SWCNT Behandlung in diesen Experimenten beobachten. Diese Studie zeigt, dass SWCNT eine sichere und effektive Transportvehikel für antisense-Oligonukleotid Drogen ist und hat das Potenzial, als Träger für therapeutische Moleküle bei Patienten verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren der Lerner Forschungsinstitut Proteomik, genomische, und bildgebenden Kerne für ihre Hilfe und Unterstützung danken. Finanzierung: Diese Arbeit wurde von NIH/NCI Stipendium R00 CA172292 (J.J.Z.) und Startkapital (zu J.J.Z.) und die klinische und translationale Wissenschaft Collaborative (CTSC) der Case Western Reserve University Core Auslastung Pilot Grant (zu J.J.Z.) finanziell unterstützt. Dabei verwendet der Leica SP8 confocal Mikroskop, das gekauft wurde, mit finanzieller Unterstützung von nationale Institute der Gesundheit SIG Grant 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
