Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.
Abstract
All'interno del fegato, i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale e loro funzione descritta è per rimuovere il liquido interstiziale dal fegato ai linfonodi dove possono esaminarsi gli antigeni e detriti cellulari. Siamo molto interessati a capire come il sistema vascolare linfatico potrebbe essere coinvolti nell'infiammazione e nella funzione delle cellule immuni all'interno del fegato. Tuttavia, molto poco è stato pubblicato che stabilisce protocolli di digestione per l'isolamento di cellule endoteliali linfatiche (LECs) dal fegato o marcatori specifici che possono essere utilizzati per valutare il fegato LECs su base per cella. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per la digestione e la macchiatura del fegato al fine di valutare la popolazione di LEC nel fegato. Siamo sicuri che il metodo descritto qui sarà utile per l'identificazione e l'isolamento di LECs dal fegato e rafforzerà la nostra comprensione di come LECs rispondere il microambiente del fegato.
Introduction
Il ruolo dei vasi linfatici e LECs nel fegato non è ben compreso. Mentre i vasi linfatici si trovano all'interno della triade portale del fegato1 ed espandono durante la malattia2, molto poco è capito per quanto riguarda la funzione e il fenotipo di LECs all'interno del fegato. Con la scoperta degli indicatori che si trovano principalmente il LECs3, l'importanza di queste cellule all'interno di nicchie differenti del tessuto nell'omeostasi e nella malattia riempirà una notevole lacuna nella nostra comprensione. LECs hanno un ruolo importante nel mantenimento della tolleranza periferica nel linfonodo ed in tumori metastatici interagendo direttamente con T cellule4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs nel linfonodo può promuovere l'immunità protettiva attraverso le loro interazioni con le cellule dendritiche migratori14,15,16. Di conseguenza, non ci sono più ruoli per LECs che possono essere specifici per i tessuti e le interazioni in cui sono presenti. Tuttavia, molto poco è capito circa come LECs interagiscono con le cellule immunitarie nel tessuto o funzionamento di LECs in sistemi differenti dell'organo; quindi, valutando LECs su base per cella all'interno del fegato o altri organi può portare a progressi nel come LECs programma immunità tessuto-specifica. Mentre gran parte della letteratura che si concentra sulle LEC nel fegato utilizza la microscopia per visualizzare LECs utilizzando uno o due marcatori e morfologia17, molto poco è stato fatto per valutare specificamente LECs su base dalla cella mediante citometria a flusso, anche se uno studio ha fatto valutare le differenze tra le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSECs) e LECs18. Essendo in grado di analizzare popolazioni LEC nel fegato tramite flusso cytometry consente lo studio approfondito del fenotipo LEC durante la normale omeostasi o malattia.
Per valutare il LECs mediante citometria a flusso, sono necessari più marcatori di superficie. In genere, LECs sono visualizzati dall'espressione di prospero-correlati homeobox 1 (Prox-1), ricevitore 1 (LYVE1) di hyaluronan endoteliale del vaso linfatico o del ricevitore di fattore di crescita endoteliale vascolare 3 (VEGFR3) usando la microscopia. Tuttavia, nel fegato, l'espressione di questi indicatori non è limitato al LECs. Prox-1 è ampiamente espressa dagli epatociti durante lo sviluppo del fegato, rigenerazione e lesioni19, e LYVE1 e VEGFR3 sono espresse da cellule endoteliali sinusoidali epatiche18. Nel linfonodo, LECs sono identificati mediante citometria a flusso come cluster di differenziazione (CD) CD45-, CD31 + e podoplanin + (PDPN)16. Tuttavia, questo approccio è troppo minimal per isolare LECs nel fegato, poiché le cellule CD45 - CD31 + catturerà le cellule endoteliali, e la popolazione predominante delle cellule endoteliali vascolari nel fegato è LSECs. Così, altri indicatori sono necessari per distinguere la popolazione di LEC rara da abbondante popolazione di LSEC. CD16/32 (espresso da maturo LSECs18) sia CD146 (un cellula endoteliale vascolare marcatore comune che è prevalentemente espresso entro i sinusoids del fegato da cellule endoteliali sinusoidali epatiche20 con poca o nessuna espressione di linfatico cellule endoteliali21) erano marcatori candidati.
Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un metodo per isolare e visualizzazione LECs nel fegato utilizzando tali marcatori, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e linfatico per citometria a flusso. Descriviamo l'uso della collagenasi IV, DNasi 1 e separazione meccanica per la digestione del tessuto del fegato in una sospensione unicellulare. Inoltre descriviamo l'uso di gradienti di densità di iodixanol per l'isolamento di cellule non parenchimali (NPC) e per eliminare i detriti cellulari. Infine, utilizzando più marcatori, determinare la strategia di gating di citometria a flusso ottimale per identificare LECs dal fegato con PDPN come il marcatore predominante.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Colorado Anschutz Medical Campus.
1. preparazione dei materiali
- Fare una soluzione di 5 mg/mL di dnasi I in tampone fosfato salino (PBS).
- Fai una miscela di digestione aggiungendo 5.000 U/mL di collagenasi IV ai media EHAA di clic.
- Riscaldare la miscela di digestione a 37 ° C per 30 min prima dell'uso.
- Fai un buffer di isolamento aggiungendo 4,8% albumina di siero bovino (BSA) e acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed) a Hanks' soluzione salina (HBSS) equilibrata.
- Fare un tampone di lisi di globuli rossi (RBC) con l'aggiunta di cloruro di ammonio di 100 mM, 10 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA a distillata H2O.
2. preparazione di una sospensione di singola cellula da un fegato di topo
- Eutanasia il mouse con CO2 e dislocazione cervicale.
- Spray giù il mouse con etanolo al 70% per bagnare la sua pelliccia. Perno del mouse piedi a un tavolo di dissezione.
- Con dissezione le forbici per tagliare la pelle di circa 1 cm sopra l'ano, facendo attenzione a tagliare solo attraverso la pelle (circa 1 mm). Tirare la pelle dal corpo con il forcipe dentato e inserire le forbici tra la pelle e il peritoneo. Aprire le forbici per separare la pelle dal peritoneum e, quindi, tagliare la pelle dall'incisione al collo.
- Pin la pelle alla scheda di dissezione utilizzando un pin sotto ogni braccio e sopra ogni gamba. Tirare il sac peritoneale e tagliare verso l'alto verso il collo. Afferrare i lobi del fegato e tagliare appena sotto lo sterno.
Nota: Cura dovrebbe essere presa se qualsiasi del fegato verrà utilizzato per l'immunoistochimica (IHC). - Tagliare intorno al fegato e rimuovere il fegato dal mouse e posizionarlo in 4 mL di media EHAA di clic.
- Usando un bisturi, tagliare il fegato in ~ 1 mm diametro pezzi.
- Aggiungere 500 µ l di miscela la digestione e 500 µ l della dnasi I (2 mg/mL) per il fegato.
- Incubare il fegato per 30 min a 37 ° C. Dopo 15 min, miscelare il liquido utilizzando una pipetta da 5 mL.
- Dopo 30 minuti di incubazione, è necessario trasferire il campione digerito attraverso un colino di 100 µm a una provetta conica da 50 mL.
- Spingere delicatamente i pezzi rimanenti attraverso il filtro con lo stantuffo della siringa 1 mL.
- Lavare il filtro con 5 mL di buffer di isolamento e spingere delicatamente il tessuto con il colino con il dorso di uno stantuffo da una siringa da 1 mL. Ripetere questa operazione fino a quando il filtro viene lavato con 25 mL di buffer di isolamento.
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min. Aspirare accuratamente il sovranatante.
- Risospendere il pellet con 4 mL di tampone di lisi RBC. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min.
- Lavare le cellule con 10 mL di buffer di isolamento e centrifugare a 400 x g per 5 min.
- Contare le celle su un emocitometro per determinare il conteggio completo del fegato.
- Risospendere le cellule in 5 mL di 20% iodixanol e strato di loro con 1 mL di PBS.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 15 min senza freno.
- Rimuovere lo strato tra il PBS e il iodixanol e inserirli, attraverso un filtro a 100 µm, in una nuova provetta conica 50 mL.
- Lavare le cellule con 10 mL di buffer di isolamento e centrifugare a 400 x g per 5 min.
- Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS con 2% siero bovino fetale (FBS).
3. analisi citofluorimetrica delle cellule singole dal fegato
- Contare le celle con un emocitometro e microscopio, utilizzando l'esclusione del blu di trypan per misurare cellule vitali. Aggiungere 10 µ l di cellule a 10 µ l di blu di trypan e immediatamente li posto su un emocitometro e contare le cellule vive (non blu) sotto un microscopio. Quindi, calcolare il numero di cellule per microlitro.
- Circa 5 milioni di aliquota delle cellule restanti parenchimale in un unico pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min.
- Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 90 µ l di PBS con 2% FBS.
- Aggiungere anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) e PDPN (1: 200) diluito in 10 µ l di 10 x 2.4G2 o anti-CD16/32 (1: 200).
Nota: Nessun blocco Fc (2.4G2) è stato utilizzato quando è stato utilizzato l'anticorpo anti-CD16/32-labeled. - Per determinare dove devono essere impostati cancelli positivi e negativi, includere una fluorescenza meno una macchia (FMO) per ogni colore e un controllo di isotipo dell'anticorpo.
- Per determinare diretta contro le cellule morte, macchia con un indicatore di redditività (ad es., fantasma rosso 780). Incubare le cellule a 4 ° C per 30 min.
- Lavare le cellule con 100 µ l di PBS con 2% FBS.
- Utilizzare una piccola aliquota di cellule per regolare le impostazioni di compensazione e laser il citometro a flusso. Macchia le celle con un anticorpo per ogni fluoroforo individuo e uno senza alcun anticorpo.
Nota: A seconda il citometro a flusso utilizzato, si dovrebbe istituire una matrice di incremento retributivo per rimuovere la sovrapposizione spettrale. - Posizionare la provetta con il campione sulla sonda citometro e raccogliere e registrare tutti gli eventi.
4. analisi dei dati
- Guardando a dispersione laterale zona vs forward-scatter area, cancello sulle cellule "dal vivo" basato su dimensioni e granularità e attuabilità colorante indicatore.
- Successivamente, utilizzando CD45 brillante viola 510 e CD31 PerCp CY 5.5, cancello sulle cellule CD45 - CD31 + utilizzo dei controlli di isotipo e FMO per determinare popolazioni positivi e negativi.
- Infine, utilizzando CD146 v450 o CD16/32 FITC e PDPN APC, prendere il CD146 - PDPN + o CD16/32-PDPN + celle, nuovamente utilizzando controlli di isotipo e FMO, per determinare le popolazioni positivi e negativi. Queste cellule sono il LECs.
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Representative Results
Studi analisi dei vasi linfatici del fegato hanno utilizzato principalmente immunohistochemistry per quantificare la frequenza e il diametro dei vasi linfatici nel fegato. Tuttavia, questo metodo non consente per la valutazione di LECs su una base di cella o per l'espressione di più marcatori, citochine, chemochine o fattori di trascrizione. Pertanto, abbiamo chiesto se fegato LECs potrebbero essere isolate dal fegato e valutato mediante citometria a flusso. Lavoro precedente isolando LECs di linfonodo è stato effettuato usando Liberase DL (collagenasi i-II-e-dispase) e dnasi 1 combinato con la separazione meccanica del tessuto di linfonodo con aghi14,16. Di conseguenza, è stato utilizzato lo stesso protocollo di digestione il tessuto del fegato, o collagenasi IV e dnasi 1 venne utilizzato come descritto in precedenza, per l'isolamento delle cellule immuni dal fegato22 e seguita la digestione con un passo di gradiente separazione (iodixanol) di densità di rimuovere gli epatociti e aumentare la frequenza di altri tipi di cellule all'interno del fegato (Figura 1A). A seguito di digestione fegata e centrifugazione su gradiente di densità, le cellule erano macchiate con CD45, CD31, linfatico e CD16/32. CD16/32 è stata descritta per essere espresso da maturo LSEC popolazioni, ma non LEC popolazioni18. Così, LECs erano gated come CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + le celle, mentre LSECs erano gated come CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + e PDPN-(Figura 1A). Cancelli erano impostate su cellule vive (negativo fantasma rosso) e basati su controlli di isotipo e FMO macchiatura (Figura 1A). APC LYVE-1 sulla popolazione LEC è stato anche confermato (Figura 1B). Entrambi i metodi ha permessi la visualizzazione della popolazione LEC all'interno del fegato; Tuttavia, il profilo di colorazione delle cellule era visivamente migliore durante l'utilizzo di collagenasi IV e dnasi 1 piu collagenasi I-II-e-dispase (Figura 1). Di conseguenza, tutte le manipolazioni future sono state eseguite utilizzando collagenasi IV e dnasi 1, come descritto nel protocollo. In media, abbiamo ottenuto circa 1.300 LECs per grammo di tessuto epatico o 2.200 LECs al fegato ingenuo, utilizzando questo metodo di digestione.
Per ottimizzare la strategia di gating e la combinazione di fluorofori e per eliminare la contaminazione di LSECs, CD146 e CD16/32 sono stati usati. CD16/32 è recettori gamma Fc II e III e si esprime il LSECs maturo ma non il LECs18. CD16/32 potrebbe distinguere le PDPN + CD16/32-cellule da PDPN-CD16 / 32 + cellule, soprattutto quando usando PDPN coniugato di APC o PE e CD16/32 coniugato a FITC (Figura 1A), ma meno bene quando PDPN è stato coniugato al PE-Cy7 (Figura 1). L'espressione del CD16/32 non viene trovato il LECs ma si trova su LSECs. Blocco FC utilizza l'anticorpo CD16/32 per minimizzare il grippaggio del ricevitore di Fc e il grippaggio specifico nonantigen di immunoglobuline ai recettori Fc. Poiché CD16/32 è stato usato per visualizzare LSECs, il legame non specifico delle immunoglobuline era più alto e CD146 è stato ottimizzato come alternativa per misurare LSECs. Di conseguenza, abbiamo testato CD146 coniugati a V450, un marcatore delle cellule endoteliali vascolari espresso altamente LSECs e altre cellule endoteliali vascolari20 ma con bassa a nessuna espressione di LECs23. Abbiamo ottimizzato in primo luogo la macchiatura del CD146 utilizzando controlli FMO e isotype per CD146 e CD16/32 (Figura 2A). Se abbiamo valutato solo il CD16 / 32 + cellule o il CD16/32-cellule, il CD16 / 32 + cellule erano tutti CD146 + e linfatico - mentre le cellule CD16/32 erano principalmente CD146 - e PDPN - o PDPN + (Figura 2B). Per confermare questa colorazione, FMO è stato usato. Rimuovendone la macchia PDPN, la popolazione PDPN + scomparso (Figura 2). Interessante, non c'erano nessun CD146 + PDPN + cellule, confermanti che CD146 non è o molto umile espresso dal PDPN + LECs. Così, siamo sicuri che uno di questi indicatori può essere usato per cancello fuori le cellule endoteliali vascolari nel fegato.
Per convalidare ulteriormente che PDPN è un indicatore appropriato per LECs, sezioni del fegato dai topi erano macchiate con PDPN (verde) e F4/80 (marrone) (Figura 3A). Endotelio vascolare né macrofagi espresso PDPN nel fegato murino. Siamo stati anche in grado di distinguere i colangiociti, che possono macchiare positivo per PDPN, da vasi linfatici, sulla base delle distinte strutture nucleari dei dotti biliari e macchiando il cytokeratin 7 (Figura 3B; rosso: il cytokeratin 7, verde: PDPN). Poiché più marcatori vengono utilizzati per citometria a flusso, ad esempio CD31, che non è espresso da colangiociti24, siamo sicuri che noi stiamo rimuovendo queste cellule dall'analisi, quindi conferma che cellule dal fegato che sono CD45-, CD31 +, CD146 lo/neg, CD16/32-, e PDPN + sono LECs. Infine, per fornire la prova che le cellule marcate sono LECs, abbiamo ordinato questa popolazione di cellule e usato la reazione a catena della polimerasi in tempo reale qualitativi per valutare le espressioni Vegfr3 e prox-1 . Sia Vegfr3 e prox-1 sono stati valutati, come queste trascrizioni sono espressi da altre cellule nel fegato —prox1 di epatociti e Vegfr3 di LSECS (tra gli altri) — ma non altre cellule oltre LECs esprimono entrambi. L'espressione di entrambi questi marcatori era significativamente più alta nella popolazione ordinata rispetto nella linea cellulare del macrofago murino coltivate (RAW 264.7) che non esprime normalmente questi marcatori, ma è simile a espressione colta murino LECs (Figura 3 ).
Figura 1 : Analisi di citometria a flusso rappresentativo di collagenasi I-II-dispase e tessuto del fegato murino IV-digerito collagenosi. (A), questo pannello mostra la strategia di gating, fluorescenza meno una colorazione, e isotype controlla per la procedura. (B) questo pannello mostra la macchiatura LYVE-1 del CD16/32-PDPN + cellule. (C), questo pannello mostra il cancello di cytometry di flusso finale dopo digestione fegati del topo con entrambi collagenasi I-II-dispase (ad es., Liberase DL) o collagenasi IV e valutando CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 dove LECs sono CD16/32- e PDPN +. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Identificazione di CD146 e PDPN come indicatori appropriati per le cellule endoteliali linfatiche. (A), questa pannello mostra fluorescenza meno uno e isotype controlli per CD16/32 (a sinistra) e CD146 (a destra). (B) questo pannello mostra gated CD16/32 positive o negative cellule determinate da pannello A. Indicato è CD146XPDPN da entrambe le popolazioni. (C) questo pannello mostra fluorescenza meno uno per PDPN dimostrare che la colorazione è assente quando l'anticorpo non viene aggiunto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Identificazione del flusso linfatico + cellule cellule endoteliali linfatiche come. (A), questo pannello di spettacoli immunohistochemistry rappresentativo da un mouse fegato macchiato con PDPN (blu) e F4/80 (marrone). Il vaso linfatico (LV), il vaso sanguigno (BV) e dei macrofagi (MF) sono etichettati. Barra della scala = 100 µm. tessuto paraffina-incastonato formalina-fisso era deparaffinate per 20 min in xilene. Tessuti sono stati idratati per l'acqua attraverso una sfumatura di etanolo, e ricupero dell'antigene è stato effettuato usando il buffer di recupero dell'antigene pH 6 in una pentola a pressione per 15 min del tessuto era bloccato usando 0.1% BSA e macchiati usando anti-topo PDPN e anti-topo F4/80 per 1 h a camera temperatura. HRP IgG anti-criceto e anti-coniglio IgG HRP sono stati utilizzati come anticorpi secondari. 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) + e Vina verde sono stati utilizzati per rilevare la F4/80 e PDPN, rispettivamente. Il tessuto era controcolorato con ematossilina e ripreso il microscopio. (B) questo pannello mostra lo stesso esperimento eseguito come pannello A, tranne qui, linfatico è mostrata in verde, citocheratina 7 in rosso e 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in blu. Barra della scala = 100 µm. tessuto è stato bloccato utilizzando asino 5% e 5% di siero di capra e macchiati usando anti-topo PDPN (8.1.1) 1: 100 e anti-mouse citocheratina 7 1: 200 per 1 h a temperatura ambiente. Anti-criceto AF647 IgG e anti-rabbit IgG-PE sono stati utilizzati come anticorpi secondari. Il tessuto era controcolorato con DAPI e ripreso. Barra della scala = 100 µm. Il vaso linfatico (LV), il vaso sanguigno (BV) e dei dotti biliari (BD) sono etichettati. (C), questo pannello mostra una piega di registro modificare nell'espressione Vegfr3 e prox-1 da fegato ordinato LECs basato sulla colorazione nel protocollo (CD45-, CD31 +, CD146neg/nege PDPN +) rispetto a cellule RAW o linfonodo murino primario LECs. Ordinato le cellule sono state passate attraverso una colonna di biopolimero-triturazione, RNA è stato estratto utilizzando un kit di estrazione di RNA e cDNA è stato realizzato utilizzando un kit di trascrizione inversa. Abbondanza di trascrizione è stato normalizzato per il gene housekeeping, Gapdh, per ogni campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'importanza complessiva di LECs in omeostasi immunitaria e regolamento è venuta recentemente alla luce25. Gran parte della letteratura pubblicata linfatica si concentra sulla pelle e nei linfonodi; Tuttavia, vasi linfatici si trovano in tutto il corpo26 e, così, è necessaria la nostra comprensione della loro importanza in diversi organi. Qui vi mostriamo un metodo in cui LECs nel fegato può essere studiata su una base di cella per capire meglio la loro espressione simultanea di diversi marcatori di superficie, citochine, chemochine e proteine intracellulari come fattori di trascrizione. Questo metodo sarà utile per futuri studi per valutare il fenotipo e la funzione di LECs nel fegato durante salute e nella malattia.
Uno degli ostacoli per l'identificazione di LECs nel fegato è la loro frequenza relativamente bassa rispetto ad altri tipi di cellule. Epatociti costituiscono circa l'80% del fegato e la rimozione di queste cellule mediante gradiente di densità (iodixanol) prima esecuzione il fegato su un citometro a flusso richiede meno tempo e, quindi, fornisce la migliore redditività. Per distinguere la popolazione di LYVE1 + LECs nel fegato da LYVE1 + LSECs, abbiamo usato i marcatori CD16/32 e CD146 trovato su LSECs e con basso a nessuna espressione di LECs. Ciò, accoppiato con la mancanza o la bassa espressione di PDPN di qualunque altra cellula endoteliale nel fegato, ha permesso la convalida mediante citometria a flusso che la popolazione abbiamo identificato era LECs. Infatti, analisi trascrizionale a valle ha confermato che questa strategia di gating prodotta LECs (Figura 3).
L'isolamento di LECs dal linfonodo è meglio fatto utilizzando collagenasi I-II-e-dispase; Tuttavia, abbiamo trovato che, mentre questo metodo estrarre LECs dal fegato, un protocollo di digestione fegato utilizzando collagenasi IV fornisce una migliore analisi a valle mediante citometria a flusso. Utilizzando una rottura meccanica del fegato permette la collagenosi più superficie per meglio interagire con le cellule di associati di matrice extracellulare, come LECs, e utilizzando media EHAA di clic senza FBS permette la digestione del fegato per verificarsi in soli 30 min. Questa volta in diminuzione mantiene la vitalità LEC per saggi a valle come la citometria a flusso o flusso l'ordinamento. Infatti, siamo stati in grado di recuperare abbastanza cellule vitali per visualizzare LECs da citometria a flusso e flusso ordinamento per analisi trascrizionale a valle.
Combinato, la separazione degli epatociti da cellule non parenchimali, l'uso di collagenasi tipo IV e il chiarimento e la dimostrazione di marcatori specifici di LECs nel fegato e di specifici ad altre popolazioni di cellule endoteliali, quali CD16/32 e CD146, ha permesso l'identificazione corretta di LECs nel fegato. Questi metodi di colmano una lacuna significativa nella letteratura circa come LECs nel fegato può essere identificato tramite flusso cytometry, soprattutto perché il fegato contiene un numero di altre cellule che esprimono marcatori noti per essere unico a LECs nel linfonodo (prox1 e VEGFR3). Di conseguenza, questi metodi porterà agli studi a valle per quanto riguarda la funzione epatica di LEC. Inoltre, questo metodo può essere modificato per altri tessuti al fine di valutare meglio il tessuto-specifici marcatori LEC e sottoinsiemi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il GI e programmi Immune innata di fegato per sostegno monetario di questo progetto. B.A.J.T. è anche finanziato dalla AI121209 R01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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