Detta arbete beskrivs kloning av en Ustilago maydis trojansk häst stam för jordbaserad leverans av utsöndrade majs proteiner in i tre olika typer av majs vävnader.
Inspirerad av Homer´s Trojan Häst myt, vi konstruerat majs patogenen Ustilago maydis att leverera utsöndras proteinerna i den majs apoplast möjliggör invivo fenotypiska analys. Denna metod förlitar sig inte på majs omvandling men utnyttjar mikrobiell genetik och sekretoriska funktioner av patogener. Häri, tillåter den inspektion av invivo levereras utsöndrade proteiner med hög spatiotemporal upplösning på olika sorters infektionsställen och vävnader. Trojansk häst strategin kan utnyttjas för att komplettera normalnivå majs förlust-av-funktion fenotyper, för att karakterisera funktionellt protein domäner, att analysera off-target protein effekter, eller att studera onside protein överdosering, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för protein studier i systemet majs gröda. Detta arbete innehåller ett exakt protokoll på hur till generera en trojansk häst stam följt av standardiserade infektion protokoll att tillämpa denna metod på tre olika majs vävnadstyper.
Biotrophic patogenen Ustilago maydis är vilka smittämnen av majs smut sjukdom1. Det infekterar alla antenn delar av majs vilket resulterar i stora tumörer som innehåller melanized, svarta sporer. På global nivå bedöms U. maydis orsaka en årlig förlust på omkring 2% av majs avkastning, medan tumörer är uppskattade som en gastronomisk delikatess i Mexiko. Anläggningen infektion initieras av en appressorium som utsöndrar cellväggen lyseringslösning enzymer för att tränga igenom det första lagret av majs epidermala celler. Från en primär infektion webbplats, U. maydis växer intracellulärt och intercellularly, invaderar en till två cell lager varje dag1,2. Framgångsrik infektion resultat i växten hypertrofi som förvandlar till synliga tumörer vid fem dagar efter infektion1,3,4. Under alla faser för infektion invaginate svampinfektion hyfer växt cytoplasman membranet utan direkt kontakt till värd cytoplasman1,2. Snäva apoplasmic utrymmet mellan de infekterande hyfer och växt plasmamembranet anses vara värd/pathogen interaktiva webbplatsen, kallas zonen biotrophic interaktion. För att övervinna det medfödda immunsystemet växt, utsöndrar U. maydis en rad effektor proteiner in i biotrophic interaktion zon1. Vissa effektorer tas upp av växtceller, medan andra förblir i biotrophic interaktion zon5,6,7,8. En apoplastisk effektor är UmPit2, som interagerar med apoplastisk majs proteaser att förhindra utsläpp av signalering peptid ZmZIP1 från ZmPROZIP av apoplastisk proteas aktivitet9,10.
Under de senaste årtiondena, U. maydis blev inte bara en modell för svamp genetik i växt-patogen interaktion, men också ett värdefullt verktyg i bioteknik på grund av en väl förstått livscykel, enkla genetiska tillgänglighet och heterologa uttryck för utsöndras proteiner11,12,13. Signaler för både konventionella och okonventionella protein sekretion har bestämts så att kontroll av posttranslationell ändringar14. Nyligen, U. maydis var anställd som en trojansk häst-verktyg för att studera små, utsöndras majs proteiner i situ15. Metoden trojansk häst har framgångsrikt använts för att analysera funktionen hos små, utsöndrade proteinet ZmMAC1 som är involverad i anther utveckling. ZmMAC1 inducerar periclinal uppdelningen av pluripotenta celler och cell öde specificering av de nybildade celler15. Med samma metod avslöjades den biologiska funktionen av majs skador-associerade peptiden ZmZIP1. U. maydis utsöndrar majsen ZmZIP1 resulterade i försämrad tumör bildandet10. Således, den trojanska häst tillvägagångssätt representerar en värdefull alternativ rutt till protein i situ studier spatiotemporal med hög upplösning som gör varken kräver generation av stabil majs omvandling linjer eller vävnad infiltration med heterologously uttryckt och renade proteiner. I synnerhet kan trojansk häst strategin utsöndringen av något heterologa protein in i majs apoplast och direkt jämförelse av infekterade kontra icke-infekterade växtceller inom samma vävnaden.
Detta protokoll illustrerar de stora steg för att generera en U. maydis trojansk häst stam för att studera ett protein av intresse. Vidare ingår exakt information om infektion förfaranden av tre olika majs vävnadstyper (vuxna blad, Tofsar och öron) med U. maydis, vilket är en förutsättning för att studera funktionen spatiotemporal infektion progression och protein i dessa vävnader. Inga ytterligare specifikationer är given på majs gen förstärkning och mikroskopiska avbildningstekniker, eftersom dessa steg är mål-specifika och instrument-beroende. Sålunda, detta protokoll riktar sig till erfarna användare av standarden molekylärbiologiska tekniker.
Moderna gröda forskning kräver protokoll för molekylär analys på genetiska och proteinnivåer. Genetiska tillgänglighet via omvandling är inte tillgänglig eller ineffektivt och tidskrävande för de flesta grödor arter såsom majs. Dessutom är pålitliga genetiska verktyg som arrangören reporter system knappa, vilket gör det svårt att studera jordbaserad proteinfunktion spatiotemporal med hög upplösning på distinkt vävnad platser. Apoplastisk proteiner kan studeras genom infiltration av heterolo…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella och Armin Hildebrand för att tillhandahålla lab utrymme och plant material. Det ursprungliga arbetet på metoden trojansk häst stöddes av en Leopoldina postdoc fellowship och NSF projektet IOS13-39229. Det arbete som presenteras i denna artikel stöddes av SFB924 (projekt A14 och B14) av DFGEN.
2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
Bacto Peptone | BD | 211677 | |
cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
Nco I | NEB | R0193 | |
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
Sharpie pen | use locally available equipment | ||
Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
Ssp I | NEB | R0132 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
Xba I | NEB | R0145 | |
Yeast extract | BD | 212750 |