Här presenterar vi ett protokoll som beskriver allogen hematopoetisk stamcellstransplantation och tillåter repetitiva mini-endoskopisk utvärderingar av distala kolon på plats för närvaro, egenskaper och svårighetsgrad av kolon inflammation inom live möss som lider av intestinal graft – versus – host sjukdom.
Akut graft – versus – host sjukdom (GvHD) representerar den allvarligaste komplikationen att patienter som tidigare genomgår allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (allo-HCT) transplantation ansikte och associeras ofta med en dålig kliniskt resultat. Tag, exempelvis GvHD manifestationer av huden är vanligtvis lyhörda för etablerade immun-undertryckande terapier och, därför, tar inte en dödlig kurs, förekomsten och intensiteten av intestinal GvHD, särskilt av mitten av-till-nedre delar av tarmen, påverka starkt utfallet och totala överlevnaden hos patienter med akut GvHD. terapeutiska alternativ är i huvudsak begränsade till klassiska immun-undertryckande agenter ger endast måttlig sjukdom-förmildrande effekter. Därför detaljerad kunskap om vävnad boförälder immun kaskad, förändringar i den intestinala bakterieflora, och stromal svaret före, vid och efter intestinal GvHD uppkomsten är mycket angeläget att förstå händelser och mekanismerna bakom dess patogenes och utveckla innovativa terapeutiska alternativ. Murina modeller av GvHD är ofta anställda att identifiera och bedöma funktionellt molekyler och vägar förment körning intestinal GvHD. Dock saknas innebär att särskilt övervaka och utvärdera tarminflammation med tiden i huvudsak eftersom etablerade poängen att bedöma och klassificera akut GvHD rutinmässigt består av olika parametrar som snarare speglar systemisk GvHD manifestationerna. Detaljutvärderingen av intestinal GvHD har varit begränsad till studier med euthanized möss, därmed i huvudsak exklusive längsgående (dvs rörelseenergi) analyser av kolon utrymmet under ett givet experimentella villkor (t.ex. antikroppsmedierad blockad av en proinflammatoriska cytokiner) i levande möss (dvs. in vivo). Mini-endoskopisk jordbaserad bedömningen av distala kolon av allo-HCT-behandlade möss beskrivs här tillåter en) en utförlig makroskopisk bedömning av olika aspekter av tarminflammation och b) möjlighet att samla vävnadsprover för nedströms analyser på olika tidpunkter under loppet av observationsperioden. Sammantaget ger den mini-endoskopisk metoden ett stort framsteg i prekliniska icke-invasiv övervakning och bedömning av intestinal GvHD.
Hematopoetiska maligniteter som direkt följer av hematopoetiska stamceller facket och okontrollerad, finns snabbt framåt, och svåra immunmedierade sjukdomar ofta indikationer att utföra allo-HCT1,2. Även om redovisning för förekomsten av prognostisk gynnsamma graft-versus-tumör svar, är givare lymfocyter dock ofta inducera och främja en oönskad immunmedierade attack av frisk vävnad komponenter inom allo-HCT mottagaren , en process som kallas graft – versus – host sjukdom3. Manifestationer i tarmen, den så kallade intestinal GvHD, representerar den mest fruktade komplikationen av akut GvHD, svåra former som är rutinmässigt associerade med en hög dödlighet1,2,4.
Övergripande, murina modeller allo-HCT har dykt upp som ovärderligt verktyg för att identifiera och studera immunomedierade mekanismer bakom patogenesen av GvHD5. Kinetic bedömning av, exempelvis positiva effekterna av nya terapeutiska insatser över tid i levande möss rutinmässigt bygger dock på bestämning av kliniska GvHD noter6. Medan dessa noter är lämpliga att reflektera, exempelvis den totala sjukdomsbördan (dvs. den systemiska GvHD), kliniska noter brist på känslighet för att tillförlitligt spegel organ-specifika manifestationer (t.ex., i tarmen). Slutsatser, exempelvis med avseende på gut-skyddande effekter av en viss terapeutisk intervention, som baseras på dessa scoring system vanligtvis faller därför kort.
Trots stora framsteg genom uppfinningen av romanen hela kroppen imaging modaliteter i kombination med användning av antingen självlysande eller fluorescerande genetiska mus modeller7,8, metoder att direkt och specifikt bedöma den intestinala manifestation av GvHD i levande möss saknas. Logiken bakom protokollet endoskopiska bedömningen av intestinal GvHD fenotypen beskrivs i nästa avsnitt är därför att övervinna detta hinder. Dessutom motivation är också att minska mängden experimentella möss eftersom hittills, en detaljerad bedömning av cellulära, morfologiska och molekylära egenskaper (t.ex., av histopatologi eller molekylärbiologi) av intestinal GvHD manifestationen har slutligen krävs offrandet av experimentella musen.
Vår institution har tidigare rapporterat om metodiken för en mini-endoskopisk bedömning av kolon manifestationer i samband med syngena kolit modeller9. I protokollet presenteras här, har vi förfinat och anpassat den colonoscopic scoring matris för alloresponse-driven kolit i levande möss med intestinal GvHD vid transplantation av alloreactive HCT och givare lymfocyter i en MHC klass jag helt felaktigt inställning . Vi har identifierat fyra parametrar lämplig att återspegla intestinal GvHD-relaterade kolon lesioner. Dessutom har vi etablerat ett system som tillåter en finjusterad gradering av någon enskild faktor, vilket resulterar i en ny Poäng som lätt informerar läsaren om svårighetsgraden av intestinal GvHD finns i en viss mus vid en given tidpunkt. Histopatologiska analyser bekräftade att en endoskopisk poäng över ett visst tröskelvärde tillförlitligt förutspår måttlig till hög grad vävnadsinflammation. Därav, mini-endoskopisk utvärdering tycks representera en fungerande ersättning för det guldmyntfot histopatologi som rutinmässigt kräver offrandet av de experimentella möss. Allt detta protokoll kan tillämpas praktiskt taget alla given tidpunkt och kan användas flera gånger under loppet av sjukdom10,11. Dessutom i motsats till användningen av Mareld-beroende metoder, inga labor-intensiv och tidskrävande åtgärder som intercrossing genetiskt modified möss krävs och, därmed metoden kan tillämpas på valfri mus rad intresse.
Sammantaget ges skadlig klinisk synvinkel allo-HCT patienter med svår intestinal GvHD, är snabba vetenskapliga framsteg och mer insikt i de molekylära mekanismerna bakom immun patogenesen brådskande. Viktigt, etiska överväganden kräver likaså att förstärkningen av kunskap bör uppnås med användningen av det minimala antalet experimentella möss. Därför erkända både fordringar på forskarvärlden att utforska intestinal GvHD kan förskotteras av genomförandet seriella mini-endoskopisk utvärderingar av tjocktarmen i experimentellt arbete kedjan att övervaka och grad intestinal GvHD i levande experimentella mus modeller, som beskrivs och validerade i protokollet presenteras här.
Protokollet beskrivs metodiken för induktion och mini-endoskopisk bedömning av kolon fenotypen observerats i samband med intestinal GvHD. Det tjänar bredare syftet gör det möjligt för forskare att studera intestinal GvHD längdriktningen och noninvasivt över hela sjukdomsförloppet (dvs från uppkomsten av kolon manifestation och progression tills maximal sjukdomens aktivitet).
Det finns dock några kritiska steg och viktiga begränsningar inneboende presenteras metoder experimenter beh…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projekt B03) (att K.H.) och CRC 1181 (CRC-DFG, projektet B05) (att K.H.), båda finansierade av den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG, tyska Research Foundation).
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |