Summary
Meting van in vitro cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument als een biomarker voor atherosclerose. In de huidige studie, optimaliseren wij en een fluorescerende NBD-cholesterol efflux methode standaardiseren en ontwikkelen van een hoge-doorvoer-analyse met behulp van 96-wells-platen.
Abstract
Arteriosclerose leidt tot hart-en vaatziekten (HVZ). Het is nog onduidelijk of de concentratie cholesterol-HDL (cHDL) een oorzakelijke rol speelt in de ontwikkeling van atherosclerose. Echter, een belangrijke factor in de vroege stadia van de atheroma plaque vorming is cholesterol efflux capaciteit aan HDL (de mogelijkheid van HDL-deeltjes te accepteren van cholesterol van macrofagen) om te voorkomen dat schuim celvorming. Dit is een belangrijke stap bij het vermijden van de ophoping van cholesterol in het endotheel en een deel van reverse cholesteroltransport (RCT) om te heffen van cholesterol door de lever. Cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument dat kan worden gebruikt als biomerker voor atherosclerose. Traditioneel, [3H]-cholesterol is gebruikt in cholesterol efflux testen. In deze studie streven wij naar het ontwikkelen van een strategie van het veiliger en sneller met behulp van fluorescerende geëtiketteerd-cholesterol (NBD-cholesterol) in een cellulaire assay voor het traceren van het cholesterol opname efflux proces en in macrofagen THP-1-afgeleide. Tot slot, wij optimaliseren en standaardiseren van de NBD-cholesterol efflux methode en ontwikkelen van een high-throughput-analyse met behulp van 96-wells-platen.
Introduction
Volgens de World Health Organization zijn de huidige belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd ischemische hartziekte en beroerte (accounting voor een totaal van 15,2 miljoen doden)1. Beide zijn cardiovasculaire aandoeningen (CVD) die kunnen worden voorafgegaan door atherosclerose en de breuk van atheroma plaques in de bloedvaten2,3.
Atherosclerose is een vaartuig muur ontstekingsziekte waarin macrofagen, T-cellen, mestcellen en dendritische cellen infiltreren het endotheel en uit het bloed, uiteindelijk de vorming van atherosclerotische plaques ophopen. Atherosclerotische plaques presenteren een lipide kern en cholesterol kristallen, blijkt uit de hoge resolutie B-modus Ultrasonografie metingen van de carotis intima media dikte4,5. In macrofagen, wordt cholesterol efflux naar lipide acceptor deeltjes uitgevoerd door middel van de ATP-binding cassette (ABC) receptoren ABCA1, ATP-binding cassette onderfamilie G lid 1 (ABCG1), en de scavenger receptor SR-BI. Het gebrek aan evenwicht van cholesterol toestroom en efflux in macrofagen wordt beschouwd als een belangrijke proces in atherosclerose Inleiding6. Cholesterol efflux wordt beschouwd als een belangrijke stap in de eliminatie van cholesterol uit perifere weefsel aan het plasma en de lever in een proces genaamd reverse cholesteroltransport (RCT). Cholesterol wordt overgebracht van macrofagen voornamelijk aan apolipoproteïne A1 (ApoA1) gevonden op het oppervlak van high-density lipoproteïne (HDL) deeltjes. HDLs vervoer dan cholesterol naar de lever voor uitscheiding en hergebruikt7,8,9.
Tritium (3H) radioactief gemerkte cholesterol is traditioneel gebruikt in cholesterol efflux10. Het signaal van de emissie van radio-isotopen is zeer gevoelige10; radioactief gemerkte cholesterol kampt echter voor de hand liggende handicaps zoals lange protocollen, risico van blootstelling aan ioniserende straling en de noodzaak van speciale radioactiviteit faciliteiten en apparatuur om ervoor te zorgen veilig omgaan met radioactieve emissies. Integendeel, is fluorescentie met succes overgenomen in diagnostische technieken vanwege zijn eenvoud in fluorescerende signaal detectie, de grote verscheidenheid van fluorophores beschikbaar en zijn veiligheid11. Verschillende TL-gelabelde Sterolen zijn gebruikt voor het bestuderen van cholesterol metabolisme met inbegrip van dehydroergosterol (met intrinsieke fluorescentie), dansyl cholesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - cholesterol, en 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-cholesterol). NBD-cholesterol presenteert in het bijzonder een efficiënte opname in menselijke cellen12. Twee verschillende NBD geëtiketteerd-cholesterol zijn momenteel beschikbaar: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) en 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figuur 1). Cholesterol geëtiketteerd met 22-NBD deel kan best past bij cholesterol efflux studies, terwijl 25-NBD-cholesterol voornamelijk in cellulaire membraan dynamics onderzoek13,14 gebruikt wordt.
Cellijnen meestal gebruikt in in vitro cholesterol efflux testen zijn monocyt-achtige cellen zoals THP-1 voor menselijke leukemie-afgeleide cellen, lymfkliertest Raw 264.7 cellen15of J774.1. Al deze cellen kunnen worden onderscheiden in macrofagen in vitro met behulp van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), maar THP-1-afgeleide macrofagen (dmTHP-1) beste weerspiegelen en de menselijke macrofagen16na te bootsen.
In de huidige studie, we optimaliseren en standaardiseren van een fluorescerende high-throughput methode om te bepalen de cholesterol efflux capaciteit van serummonsters op dmTHP-1, met behulp van 22-NBD-cholesterol als alternatief voor [3H]-cholesterol. Daarnaast vergelijken wij de geoptimaliseerde fluorescerende techniek met de standaard radioactieve analoge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor deze studie werd werden ethisch comité goedkeuring (Comitè Ètic d'Investigació Clínica; Hospital Clinic, Barcelona; goedkeuringsnummer HCB/2014/0756) en schriftelijke, geïnformeerde toestemming van alle onderwerpen verkregen.
1. NBD-cholesterol voorbereiding
- Los van de NBD-cholesterol (MW 494.63; Zie Tabel van materialen) in pure ethanol om te verkrijgen van de voorraad (2 mM). Voor een flacon van 10 mg, Los de inhoud van het hele flesje in een volume van 10,1 mL ethanol te verkrijgen van een voorraad van 2 mM.
- Verdun de NBD-cholesterol uit de voorraad in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale boviene serum en 5% penicilline/streptomycine (R10 medium) tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM (b.v., 10 mL van NBD-cholesterol bij 5 μM eindconcentratie verkrijgen) door verdunning 25 μL van NBD-cholesterol voorraad (2 mM) in R10 medium. Dit volume is voldoende voor een 96-wells-plaat.
2. cel cultuur en zaaien (dag-2)
- Cultuur THP-1 cellen in R10 medium bij 37 ° C, 5% CO2. Aanpassen naar 0.3 x 106 cellen/mL elke 3 dagen.
- Zaad de cellen in een witte 96-wells-plaat met een platte, heldere bodem op 0,2 x 106 cellen per putje in R10 medium (100 μl per putje).
- Behandelen van de cellen met 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; uit een voorraad van 10 μM) gedurende 48-72 uur, incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 om te differentiëren THP-1 cellen in dmTHP-1.
Opmerking: Het is aanbevolen om gebruik 5 μL van PMA voorraad (10 μM) in 500 μL van R10 medium. Voorafgaand aan deze, bereiden een 10 μM PMA voorraad door ontbinding van een flesje gelyofiliseerd 1 g in 10 mL dimethylsulfoxide (DMSO), hoeveelheid en voorraad bij-20 ° C. - U kunt ook (suggestie) combineren stappen 2.2 en 2.3 voor betere homogenisering. Bereiden van 10 mL THP-1 cellen in een tube van 15 mL, voeg 200 l PMA voorraad (10 μM), meng zachtjes en onmiddellijk zaad 100 μl per putje op het bord. Incubeer de cellen zoals beschreven in stap 2.3.
3. apolipoproteïne B uitgeput Serum (ABDS) voorbereiding (dag 2 of 3)
- Ter voorbereiding van een oplossing van polyethyleenglycol (PEG), Verdun glycine in 10% PBS (met steriele H2O) een concentratie van 200 mM met een pH van 7,4. Voeg 40 mL 200 mM glycine à 10 g van PEG 8000 verkrijgen van PEG 20% (m/v). Meng de oplossing krachtig te homogeniseren.
- Toepassing 4 delen van 20% per 10 delen van serum/plasma op elk serum/plasma monster in de buis van een 1,5 mL PEG en laat het mengsel op het ijs voor 25 min17 (bijvoorbeeld 100 μl van plasma of serum, voeg 40 μL van 20% PEG oplossing).
- Centrifugeer het PEG-apolipoproteïne B neerslag bij 13.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Gooi de neerslag. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.
Opmerking: Het is raadzaam om de voorbereiding van de ABDS op dag 3 (verse). Als het niet mogelijk is, bereiden de ABDS op dag 2 en houden het bij 4 ° C's nachts.
4. NBD-cholesterol cel laden (dag 2)
- Negeren van de voedingsbodem van de dmTHP-1 en wassen van de cellen tweemaal met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Laden van de cellen met 5 μM NBD-cholesterol (100 μl per putje) in R10 medium en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.
5. incubatie met Cholesterol acceptanten (dag 3)
- Negeren van het medium en wassen van de cellen tweemaal met PBS.
- Incubeer de cellen met 2-5% ABDS of de gewenste concentratie van gezuiverde lipide acceptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) verdund in kleurloze RPMI 1640 medium (100 μl per putje) gedurende 4-6 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Omvatten een negatieve controle (C-) bestaande uit kleurloze RPMI 1640 medium zonder Acceptanten en een positieve controle (C +) (bijvoorbeeld ABDS uit een pool van gezonde donoren) of gezuiverd HDLs. Opmerking dat de positieve controle geldt met name wanneer de patiënt monsters (ziekten) zijn geanalyseerd (aanvullende figuur 1). - Voorbereiden van een voorraad van 200 mL van de oplossing lysis van de cel 1 (50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, H2O). Meng de cellysis oplossing 1 op 1:1 (v: v) verhouding met pure ethanol te verkrijgen van de lysis oplossing 2.
6. fluorescent signaal vangen (dag 3)
-
Media NBD-cholesterol detectie
- Verwijder het medium van de cel aan de platen en verzamelen in een nieuwe witte 96-wells-plaat met een ondoorzichtige platte bodem.
- Voor een optimale fluorescentie signaal detectie in de media-monsters, voeg toe 100 μl van pure ethanol aan 100 μl van elk medium monster te verkrijgen van een 1:1 verhouding in de witte 96-wells-plaat.
- De plaat met de behandelde media houden voor verdere maatregel, wordt de intensiteit van de fluorescentie (FI) bij een golflengte van 463⁄536 nm (excitatie/emissie) in de luminometer.
-
Detectie van intracellulaire NBD-cholesterol
- Wassen van de cellen tweemaal met PBS.
- Voor het verkrijgen van de intracellulaire cholesterol, lyse de cellen door ze aan het broeden met 100 μl van lysis oplossing 2 per putje en schud de plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 25 minuten.
- Voor een optimale fluorescentie signaal detectie in de lysate celsteekproeven, vangen de intensiteit van de fluorescentie van de cel lysates in dezelfde witte 96-wells-plaat met duidelijk plat bodemplaat (de dezelfde waarin cellen werden zaadjes in stap 2.2).
- 6.3 meet de intensiteit van de fluorescentie (FI) in de luminometer terwijl het aanpassen van de parameter van de gevoeligheid tot 50 in de software (Zie Tabel van materialen).
7. resultaten analyse
- Het cholesterol efflux tarief van een monster wordt uitgedrukt als een percentage berekend met de formule:
- De definitieve maatregel van cholesterol efflux (CE) verkrijgen door de CE van de negatieve controle (voorbeeld vol met NBD-cholesterol maar geïncubeerd met kleurloze RPMI 1640 medium, zonder cholesterol acceptanten) af te trekken van de CE van een gegeven monsters:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van de bepaling van de efflux cholesterol is om in vitro de cholesterol efflux capaciteit van een bepaalde serum, plasma of supernatant met HDL-deeltjes. De methode bestaat uit geëtiketteerd-cholesterol in een cultuur van een standaard macrofaag cellijn laden en inducerende contact met het testen monster in FBS-vrije media met de cellen worden verdund. Tot slot worden de fluorescerende niveaus van de NBD gemeten in de media en de cel lysate. Voor het optimaliseren van metingen, wordt de effluxed cholesterol uit de cellen aan media gemengd met een volume van een oplosmiddel met ethanol. De NBD-cholesterol die in de cellen blijven is geresuspendeerde in een oplosmiddel met ethanol of wasmiddel voor metingen. Tot slot, de verhouding van effluxed/totale geëtiketteerd-cholesterol is bepaald. Voor het instellen van de techniek, werd apolipoproteïne B-verarmd serum (ABDS) uit een pool van gezonde donoren gebruikt.
De beste voorwaarden van de verdunning voor het NBD-cholesterol in zowel medium en ethanol werden onderzocht. We testten de fluorescerende gedrag van gratis NBD-cholesterol in verschillende oplosmiddel omgevingen, met inbegrip van verschillende verhoudingen van ethanol en kleurloze RPMI 1640. De intensiteit van de fluorescentie (FI) van NBD-cholesterol verdund in de waterige oplossing bleek de laagste waarden van de FI, terwijl NBD-cholesterol binnen pure ethanol de hoogste FI uitgestoten. Dit suggereert dat de uitstoot van de fluorescentie van de molecule 22-NBD-cholesterol is sterk afhankelijk van het medium waarin het zich bevindt. Bijgevolg is het signaal van de fluorescentie van de 22-NBD-cholesterol significant hoger wanneer in een media bevattend ethanol geplaatst. We hebben vastgesteld dat bij een verhouding van 1:1 media: ethanol, het signaal fluorescentie intensiteit proportioneel met de concentratie van de cholesterol in het bereik van 0.5-50 μM toeneemt, een passend gedrag van de sonde in dit geval suggereren analoge (Figuur 2 ). Het lineaire gedrag in de 1:1 voorwaarde (media: ethanol) wordt vertegenwoordigd door de follow-vergelijking: y = 20,88 x + 146.7 met R2 = 0.9341.
Een belangrijke stap in deze methode is de tijd die besteed het broeden van de geladen cellen met cholesterol acceptanten zodat de cholesterol vermag efflux. Om te bepalen van de vereiste incubatietijd, is cel media gekapt op verschillende timepoints (1 tot en met 24 h; Figuur 3). De efflux van cholesterol in het bereik van 0 tot en met 6 h geëvolueerd lineair (p < 0,0001; y = 18.2 x + 127.3) in een tijd-afhankelijke manier. Het maximale signaal gevangen bedroeg 6 h nadat ABDS werd toegevoegd aan de cellen. Na 6 uur verloren de cholesterol regelmatigheid in de efflux, zodat de variabiliteit verhoogd na 6 h van incubatie met de ABDS (Figuur 3).
We daarnaast getest de verzadiging drempel en dynamisch bereik zoals toegepast op menselijke ABDS waardering CE op verschillende percentages van de HDL-bevattende media (ABDS). De NBD-cholesterol efflux in de hoge doorvoer assay (96-wells-plaat) geëvolueerd lineair binnen 1-7% ABDS, waar FI verhoogd in een concentratie-afhankelijke manier met de ABDS, bereikte de piek cholesterol efflux capaciteit van 7% ABDS (Figuur 4). Bij concentraties hoger dan 7% daalden de FI in een omgekeerde relatie met de ABDS percentage. Dit kan hebben plaatsgevonden omdat de cholesterol opnieuw invoeren van was dat de cellen van de NBD-cholesterol geladen HDL aanwezig in de media.
De standaardmethode voor het meten van cholesterol efflux gebruikt radio-label (3H) cholesterol16. Om te beoordelen van de prestaties van onze fluorescentie gebaseerde methode, wij uitgevoerd en ten opzichte van TL zowel radio-geëtiketteerden technieken. We vonden dat de traditionele radioactiviteit techniek en onze NBD-cholesterol methode waren sterk gecorreleerd (Pearson's r = 0.97; p < 0.001) met behulp van verschillende concentraties van ABDS (1 – 8%; Figuur 5). Globaal, dit suggereert dat onze fluorescerende methode kan een veiliger alternatief dan de radioactieve techniek.
Tot slot, wij ten opzichte van onze methode fluorescente sonde NBD verschilt. We vergeleken onze methode om een commerciële cel-gebaseerde high-throughput assay kit poogde te bepalen de cholesterol efflux in cellen (cholesterol efflux assay kit, cel-gebaseerde). De methode ontwikkeld in onze fractie was gevoelig voor een verhoging van de acceptor concentratie (% ABDS) binnen CE waarden tussen 5 en 15%. Echter, de commerciële kit uitgevoerd na instructies van de fabrikant, resulteerde in CE maatregelen minder dan 5% langs het bereik van ABDS vehiculumcontrolegroep; de resulterende CE was dus in wezen niet beïnvloed wanneer ABDS was toegenomen (Figuur 6).
Figuur 1: moleculaire structuren van natuurlijke cholesterol (A) 22-NBD-cholesterol (B) en 25-NBD-cholesterol (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: NBD-cholesterol fluorescentie intensiteit (FI) met verschillende verhoudingen van ethanol en kleurloze RPMI 1640 middelgrote. NBD-cholesterol was verdund in 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 en 0:1 ethanol: waterige middellange ratio's bij NBD-cholesterol concentraties tussen 0,5 en 50 µM. FI signaal werd ontdekt door de luminometer met de parameter van de gevoeligheid ingesteld op 70 in de fluorimeter software. De FI-signaal voor media en cel lysate werd gemeten met behulp van witte 96-wells-platen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: tijd-progressie NBD-cholesterol efflux in macrofagen THP-1-afgeleide. De dmTHP-1 werden geladen met 5 µM NBD-cholesterol en geïncubeerd met 5% ABDS. Cel media werden gemeten in een witte 96-wells-plaat op verschillende timepoints (1-24 h). De waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking van quadruplicate wells. FI signaal werd ontdekt door de luminometer met de parameter van de gevoeligheid ingesteld op 70 in de fluorimeter software. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: NBD-cholesterol efflux in THP-1-afgeleide macrofagen in 96-wells-plaat met verschillende concentraties van ABDS. De dmTHP-1-cellen werden behandeld met 5 µM NBD-cholesterol, geïncubeerd met verschillende percentages van ABDS en lysed met ethanol. De FI-signaal voor media en cel lysate werd gemeten met behulp van een witte 96-wells-plaat in de fluorimeter op 1:1 (ethanol: lysis oplossing 1). De maatregelen van de negatieve controles (ABDS onbehandelde media) werden afgetrokken op de niveaus geleverd. De waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige wells. FI signaal werd ontdekt door de luminometer met de parameter van de gevoeligheid ingesteld op 50 in de fluorimeter software. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Correlatie van NBD-cholesterol en [3H]-cholesterol efflux in macrofagen THP-1-afgeleide. Volgende dmTHP-1 met de overeenkomstige geëtiketteerd-cholesterol voor 6 uur. De cholesterol efflux werd gemeten met behulp van 1-8% ABDS. Voor NBD-cholesterol monsters, was het signaal van de fluorescerende herkend met behulp van witte 96-wells-platen in de fluorimeter op ethanol: lysis van de 1:1 oplossing 1. FI signaal werd ontdekt door de luminometer met de parameter van de gevoeligheid ingesteld op 50 in de fluorimeter software. [3H]-cholesterol monsters, het radioactieve signaal werd ontdekt met behulp van 100 µL van medium en cel lysate gemengd met de Scintillatie cocktail en rood in de teller scintillation, volgens het protocol beschreven door lage et al.17. Correlatie-efficiëntie werd bepaald met behulp van de correlatiecoëfficiënt van Pearson's r. De maatregelen van de negatieve controles (ABDS onbehandelde media) werden afgetrokken van zowel fluorescentie en radioactieve niveaus geleverd. De waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige wells. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: vergelijking tussen hoge gegevensdoorvoer NBD-cholesterol efflux assay en een gecommercialiseerd fluorescerende cel-gebaseerde assay kit. Cholesterol efflux van ABDS evalueerden volgend op de beschreven protocol, gebruikt als lysis oplosmiddel ethanol (50%) of Tween 80 (1%). De fluorescerende cel-gebaseerde assay kit werd beoordeeld volgens de fabrikant protocol in de kit. De waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige wells. FI signaal werd ontdekt door de luminometer met de parameter van de gevoeligheid ingesteld op 50 in de fluorimeter software Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Werkstroomdiagram. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: NBD-cholesterol efflux van serummonsters van HIV-geïnfecteerde patiënten en een standaard positieve controle (C +). De Inter-individuele variatie van de NBD-cholesterol efflux methode toegepast op een verzameling van HIV-geïnfecteerde patiënten wordt weergegeven. Een positieve interne controle (C +) vertegenwoordigt de NBD-cholesterol efflux uit een pool van sera monsters van 8 gezonde patiënten. Foutbalken Toon standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TL-gelabelde cholesterol is een veelbelovende strategie om te analyseren en onderzoeken van de eigenschappen en het metabolisme van natuurlijke cholesterol in vitro. De belangrijkste voordelen zijn dat het kan worden overgenomen door cellen, toelaat voor intracellulaire en membraan distributie studies, en kan worden toegepast op cholesterol efflux assays zoals in dit protocol (Figuur 7). Aantal TL-gelabelde sterolen toestaan cholesterol bijhouden in vitro met inbegrip van BODIPY-cholesterol, dansyl-cholesterol, dehydroegrosterol en 22 - en 25-NBD-cholesterol12. Met name, is 22-NBD-cholesterol geschikt voor het bestuderen van cholesterol dynamiek met verschillende soorten cellen en als een substituut voor radio-geëtiketteerden cholesterol18. Er is geen consensus methode om te evalueren van het fluorescerende signaal in een cholesterol efflux assay. Song et al.14 geoogst medium en cel lysates te meten FI afzonderlijk; Liu et al.14 het medium overgedragen aan andere platen en de intracellulaire fluorescent signaal rechtstreeks werd gemeten bij de cultuur plaat; en Zhang et al.15 gebruikt een lysis-buffermengsel Lyse de cellen, gevolgd door de zuivering van het fluorescerende cholesterol tot Verdun het in pure ethanol en detecteren de fluorescentie intensiteit signaal19. In onze cholesterol efflux assay, gebruik van de dezelfde oplosmiddel eindsamenstelling in media en cellen toegestaan de homogenisering van de cel media en metingen van lysate efficiënt.
De huidige studie de NBD-cholesterol efflux geprofileerd na verloop van tijd en vond een progressie van de tijd-afhankelijke tot 6 h van incubatie met de acceptor ABDS, vergelijkbaar met Song et al.14 en Liu et al.14 en in tegenstelling tot Zhang et al., die een incubatieperiode van 1 h gebruikt met de lipide acceptanten19. We vonden dat na 6 uur incubatie, de effluxed-cholesterol lineariteit verloren; het is daarom primordiaal om niet te overschrijden 6 h. Onze optimaal bereik van cholesterol efflux was tussen 3 tot 6 uur na het toevoegen van de acceptanten. Wij stellen voor cellen gedurende 4 uur met de cholesterol acceptanten aan het broeden. Gebruik van de kleurloze media toe te passen de acceptanten teneinde achtergrond, het zaaien van een semi-confluente cellaag van de cultuur, en zorgen voor een correcte naleving van degenen aan de plaat zijn extra kritische stappen. Opgemerkt moet worden dat duidelijk onderin de witte plaat handig is te volgen van de cellen onder een omgekeerde lichte Microscoop.
Meeste cholesterol efflux tests worden uitgevoerd met behulp van gezuiverde lipide acceptanten in de test van de efflux cholesterol. De huidige techniek werd ontwikkeld om het verkrijgen van de cholesterol efflux capaciteit van menselijk serum of plasma monsters. We gebruiken de intrinsieke cholesterol acceptanten in het serum aanwezig, maar het is van cruciaal belang om de deeltjes met apolipoproteïne B, die zou de cholesterol moleculen binnen de cellen20,21recirculate te verwijderen. Als wijzigingen, kan gezuiverde ApoAI en HDL ook worden gebruikt als acceptanten. Ook cellijnen dan menselijke THP-1 zijn met succes gebruikt in fluorescerende cholesterol efflux testen, zoals rauwe 264.7 of J774A1 macrofagen en zou dus waarschijnlijk werk in onze methode15,22.
De belangrijkste beperkingen van deze methode is dat resultaten afhankelijk van de specifieke cellijn, een standaard cel maar cel-vrije methode zou nuttig zijn om te gebruiken als een biomarker. Ook de sera gebruikt voor het standaardiseren van deze methode was bevroren; de NBD-groep op cholesterol is minder fysiologische dan de radio-label, en zijn opname verschilt van de endogene cholesterol; en we het uiteindelijke resultaat van een aantal processen (dwz, waarbij serum deeltjes cellijn, mogelijk verestering van cholesterol, mogelijke verspreiding van cholesterol of gelijktijdige processen mogelijk efflux en toestroom) getest. Echter, als een voordeel, fluorescentie gebaseerde technieken hebben aangetoond dat hoog potentieel als vervangers voor traditionele radioactief gemerkte technieken en in de vervanging van [3H]-cholesterol, door een TL-gelabelde molecuul te controleren cholesterol efflux testen14.
Cholesterol efflux kan fungeren als biomarker van atherosclerose23, zoals het correleert met toekomstige cardiovasculaire gebeurtenissen24,25. Een mogelijkheid te bestuderen van de rol van macrofagen in atherosclerose is door middel van gezuiverde HDLs en de samenstelling daarvan; HDLs zuivering is echter een moeizaam en tijdrovend proces. Bovendien, tijdens de zuivering, andere componenten van het serum met atherogene effect kunnen worden onderschat of gemist. Om die reden ABDS werd gekozen als de lipide acceptor. De omvang van de hoge-doorvoer en de vermindering van de tijd werden mogelijk gemaakt door vervanging van de Scintillatie teller voor een afleesapparaat, meten de fluorescent signaal in de dezelfde cultuur plaat (in het geval van de cel lysate), en het verminderen van het protocol door twee dagen. Bovendien is deze techniek toont hogere gevoeligheid wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende concentraties van serum dan de maatregelen die zijn verkregen uit een gecommercialiseerd kit te beoordelen van cholesterol efflux.
Kortom, is een NBD-cholesterol efflux assay die met de traditionele radioactieve methode correleert beschreven. Wij vastbesloten de optimale tijd om te broeden lipide acceptanten van menselijke monsters (serum of plasma) in de vorm van ABDS. We geoptimaliseerd de cel zaaien, differentiatie, dynamisch bereik en verzadiging punt van de techniek. Wat betreft de belangrijkste nieuwigheid, we een oplosmiddel combinatie bij metingen gebruikt voor het verkrijgen van hoge intensiteiten en een betere lineaire reeks geoptimaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs willen verklaren dat ze de uitvinders van de octrooiaanvraag (EOB; 18382337.6-1118; 17 mei 2018) getiteld "Method for determining cholesterol efflux" op basis van deze methode.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het onderzoek verleent FIS (PS12/00866) van het Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (EFRO); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) en CERCA programma / Generalitat de Catalunya. De auteurs bedanken de Retrovirology en virale Immunopathologie laboratorium van het Institut d'Investigacions Biomèdiques augustus Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wij danken T. Escribà, C. Rovira en C. Hurtado voor hun hulp en S. Cufí van de kennis en de technologie Transfer Office voor haar begeleiding bij de bescherming van de uitvinding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
