Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos

Summary

Nós descrevemos um procedimento cirúrgico usado para induzir a isquemia periférica nos coelhos com hiperlipidemia e diabetes. Esta cirurgia actua como um modelo pré-clínico para as circunstâncias experimentadas na doença de artéria periférica nos pacientes. A angiografia também é descrita como um meio de medir a extensão da isquemia introduzida e a recuperação da perfusão.

Abstract

A doença vascular periférica é um problema clínico generalizado que afeta milhões de pacientes em todo o mundo. Uma consequência importante da doença vascular periférica é o desenvolvimento de isquemia. Em casos graves, os pacientes podem desenvolver isquemia crítica do membro em que experimentam a dor constante e um risco aumentado de amputação do membro. As terapias atuais para isquemia periférica incluem cirurgia de bypass ou intervenções percutâneas, como angioplastia com stent ou aterectomia para restaurar o fluxo sanguíneo. Entretanto, estes tratamentos falham frequentemente à progressão continuada da doença vascular ou do reestenose ou são contra-indicado devido à saúde pobre total do paciente. Uma abordagem potencial promissora para tratar a isquemia periférica envolve a indução de neovascularização terapêutica para permitir que o paciente desenvolva vasculatura colateral. Esta rede recém-formada alivia a isquemia periférica, restaurando a perfusão para a área afetada. O modelo pré-clínico mais freqüentemente empregado para isquemia periférica utiliza a criação de isquemia de membros posteriores em coelhos sadios através da ligadura da artéria femoral. No passado, no entanto, houve uma forte desconexão entre o sucesso dos estudos pré-clínicos e o fracasso dos ensaios clínicos em relação aos tratamentos para isquemia periférica. Os animais sadios têm tipicamente regeneração vascular robusta em resposta à isquemia cirurgicamente induzida, em contraste com a redução da vascularização e regeneração em pacientes com isquemia periférica crônica. Aqui, nós descrevemos um modelo animal aperfeiçoado para a isquemia periférica nos coelhos que inclui o hiperlipidemia e o diabetes. Este modelo reduziu a formação colateral e a recuperação da pressão sanguínea em comparação com um modelo com uma dieta mais elevada do colesterol. Assim, o modelo pode proporcionar melhor correlação com pacientes humanos com angiogênese comprometida a partir das comorbidades comuns que acompanham a doença vascular periférica.

Introduction

A doença arterial periférica (PAD) é um distúrbio circulatório comum em que a progressão da formação da placa aterosclerótica leva a um estreitamento dos vasos sanguíneos nos membros do corpo. O recente aumento dos fatores de risco para a aterosclerose, incluindo diabetes, obesidade e inatividade, tem levado ao aumento da prevalência de doença vascular¹. Atualmente, estima-se que 12% – 20% da população geral acima de 60 anos de idade tenha doença arterial periférica². Uma consequência importante da doença arterial periférica é o desenvolvimento de isquemia periférica, mais comumente encontrada nos membros inferiores. Em casos graves, os pacientes podem desenvolver isquemia crítica do membro, um estado em que há dor constante devido à falta de fluxo sanguíneo. Os pacientes com isquemia crítica do membro têm uma probabilidade de 50% de ter um membro amputado dentro de um ano do diagnóstico. Além disso, pacientes com diabetes apresentam maior incidência de doença arterial periférica e desfechos mais pobres após intervenções para revascularização^3,4. As terapias atuais para a isquemia periférica incluem intervenções percutaneous tais como o aterectomia e stenting ou o desvio cirúrgico. Entretanto, para muitos pacientes estes tratamentos fornecem somente benefícios a curto prazo e muitos não são saudáveis bastante para procedimentos cirúrgicos principais. Neste trabalho, descrevemos um modelo animal pré-clínico para testar novos tratamentos visando a doença vascular periférica que incorpora a geração de isquemia periférica em coelhos através da ligadura cirúrgica no contexto do estado da doença diabética.

O modelo de isquemia do membro Hind em coelhos tem sido utilizado como modelo fisiológico para doença vascular obstrutiva e precursor pré-clínico para estudos humanos há mais de meio século^5,6. Os coelhos são muitas vezes uma espécie preferida para estudos sobre isquemia periférica devido à musculatura desenvolvida do tornozelo e do músculo da panturrilha, em contraste com grandes modelos animais comuns que são ungulados (animais com cascos). Várias revisões recentes abordaram o uso desse modelo e outros na modelagem da doença vascular periférica em humanos^7,8. Modelos semelhantes, utilizando isquemia de membro posterior em coelhos, foram utilizados em estudos pré-clínicos de fatores de crescimento^{9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20}, terapia genética^{21,22,23, 24,25,26},^{27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37},³⁸,^39,40,^{41, 42,43,44}, e células-tronco^45,46,47,48,^{49,50 ,51}para neovascularização terapêutica nos membros. Infelizmente, os ensaios clínicos que seguiram estes estudos animais bem sucedidos não mostraram benefícios significativos para os pacientes⁵².

Uma explanação sugerida da razão para esta falha translacional é que a condição da isquemia periférica em pacientes humanos é uma que inclui a resistência aos sinais angiogênico^{53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59}. vários estudos demonstraram defeitos nas vias de sinalização angiogênica em diabetes e hiperglicemia. Diabetes e hiperlipidemia levam a uma perda de proteoglicanos de sulfato de heparan e um aumento de enzimas que cortam o sulfato de heparan, apresentando um potencial mecanismo de resistência à angiogênese terapêutica/arteriogênese com fatores de crescimento^{60 , 61}. assim, uma característica fundamental de um modelo de isquemia periférica deve incluir um aspecto da resistência terapêutica para que as terapias possam ser avaliadas no contexto do estado da doença presente em pacientes humanos.

Neste trabalho, nós descrevemos um modelo do coelho da isquemia periférica com a ligadura cirúrgica das artérias femoral. Um lead-in período com a indução de diabetes e hiperlipidemia é incorporado no modelo. Comparou-se este modelo a outro modelo que incorpora uma dieta mais gorda sem diabetes e constatou que o modelo com diabetes e menor nível de hiperlipidemia foi mais eficaz na redução do crescimento dos vasos sanguíneos. Nosso modelo combina avanços que têm sido utilizados por grupos distintos, com o objetivo de fornecer um método prático e padronizado para alcançar resultados consistentes na pesquisa de doenças vasculares periféricas.

Protocol

Estudos envolvendo animais foram realizados com a aprovação da Universidade do Texas em Austin e o centro de ciência UTHealth no Comitê de cuidados e uso de animais institucionais de Houston (IACUC), o serviço de revisão de cuidados e uso de animais (ACURO) do exército dos Estados Unidos Pesquisa médica e materiel Command Office de proteções de pesquisa, e de acordo com as diretrizes da NIH para o cuidado dos animais. 1. indução de diabetes e hiperlipidemia Transição do…

Representative Results

Após a indução do diabetes e a iniciação da dieta do colesterol de 0,1%, o colesterol total para os coelhos com dieta do diabetes e do colesterol era 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 coelhos masculinos) média de pontos de tempo totais e coelhos. O nível de BGL para esses coelhos foi de 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 coelhos machos). Um curso do tempo para químicas do sangue e relações da pressão sanguínea do pé em um coelho típico é mostrado em Figura 3 em comparaç?…

Discussion

Nós apresentamos um modelo pré-clínico para induzir a isquemia do membro traseiro nos coelhos com diabetes e hyperlipidemia. Em muitos estudos, há ambigüidade à técnica utilizada para criar isquemia de membro posterior em coelhos. Em camundongos, a severidade e a recuperação da isquemia dos membros posteriores é altamente dependente da localização da ligadura e da técnica utilizada para induzir isquemia. O significado da técnica apresentada neste trabalho é que permite a indução consistente da isquemia q…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Henry Schein Medical	1537468 / 1531434	250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL Syringe	VWR	BD309628
10 mL Syringe	VWR	BD309695
10% Formalin	Fisher-Scientific	23-245684
18G Needle	VWR	89219-294
20G Needle	VWR	89219-340
25G Needle	VWR	89219-290
27G Needle	VWR	89219-288
5 mL Syringe	VWR	BD309646
5% Dextrose	Patterson Veterinary	07-800-9689
Acepromazine	Patterson Veterinary	VEDC207
Alfaxalone	Patterson Veterinary	07-891-6051
Alginate	Sigma-Aldrich	PHR1471-1G
Alloxan Monohydrate	Sigma-Aldrich	A7413
Angiography Equipment	Toshiba	Infinix-i
Angiography Injector	Medrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008	Secondary Antibody for IHC
a-SMA Antibody	Abcam	ab5694	Primary Antibody for IHC
Baytril	Bayer Animal Health	724089904201	Enrofloxacin
Blood Chemistry Panel	IDEXX	2616	Rabbit Panel
Blood Pressure Cuff	WelchAllyn		Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure Monitor	Vmed Technology		Vmed Vet-Dop2
Bupivacaine	Henry Schein Medical	6023287
Buprenorphine	Patterson Veterinary	42023017905
Buprenorphine SR	ZooPharm
Calcium Sulfate	CB Minerals		Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine Scrub	Patterson Veterinary	07-888-4598
Chloroform	Fisher-Scientific	C298-4
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8503
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248
Ear Vein Catheter	Patterson Veterinary	SR-OX165	Surflo IV catheters
Endotracheal tube	Patterson Veterinary		Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size
Glucometer	Amazon	B001A67WH2	Accu-Chek Aviva
Glucometer Test Strips	McKesson Medical-Surgical	788222	Accu-Chek Aviva Plus
Guidewire	Boston Scientific	39122-01
Hair Clippers	Amazon	B000CQZI3Q	Oster #40 blade
Heating Pad	Cincinnati Subzero	273
Heating Pad Pump	Gaymar		Gaymar T/Pump
Hemostat	Fine Science Tools	13009-12	Curved Mosquito Hemostat
Heparin	Patterson Veterinary
Insertion Tool	Merit Medical Systems	MAP550	metal wire insertion tool
Insulin	HPB Pharmacy		Novalin R & Novalin N
Insulin Syringes	McKesson Medical-Surgical	942674
Introducer	Cook Medical	G28954	3F Check Flo Performer Introducer
Isoflurane	Henry Schein Medical	1100734
Ketamine	Patterson Veterinary	856440301
Lactated Ringers	McKesson Medical-Surgical	186662
Lidocaine	McKesson Medical-Surgical	239936
Lidocaine/Prilocaine cream	McKesson Medical-Surgical	761240
Ligaloop	V. Mueller	CH117 / CH116	White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn Oil	Amazon	B0049IIVCI
Medrad Syringe	McKesson Medical-Surgical	346920	150 mL
Meloxicam	Patterson Veterinary
Metal ball sutures	Ethicon-Johnson & Johnson	K891H	4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum Scissors	Fine Science Tools	14019-13
Midazolam	Henry Schein Medical	1215470
Nitroglycerin	McKesson Medical-Surgical	927528
PECAM Antibody	Novus Biologicals	NB600-562	Primary Antibody for IHC
Perfusion Pump	Masterflex
Pigtail Catheter	Merit Medical Systems	1310-21-0053	3F pigtail
Polydioxanone (PDS II) suture	McKesson Medical-Surgical	129271	4-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) suture	McKesson Medical-Surgical	129031	4-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) suture	Butler	7233-41	3-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) suture	McKesson	104373	4-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa)	LabDiet	5321
Rabbit Restrainer	VWR	10718-000
Rib Cutters	V. Mueller
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10015-00	#15 blade
Silk Sutures	Ethicon-Johnson & Johnson	A183H	4-0 silk ties 18"
Stainless Steel Ball	McMaster-Carr	1598K23	3-mm diameter
Surgical Drapes	Gepco	8204S
Syringe Pump	DRE Veterinary		Versaflow VF-300
Visipaque contrast media	McKesson Medical-Surgical	509055
Weitlaner Retractor	Fine Science Tools	17012-13