Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

Summary

뼈 이식의 ex vivo 문화 뼈 생리학 및 뼈 리모델링 및 뼈 질환에서 약물의 잠재적인 평가의 연구에 대 한 귀중 한 도구가 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 두개골에서 분리 된 calvarias의 준비 및 문화뿐만 아니라 그 응용 프로그램을 설명합니다.

Abstract

뼈는 골세포, 골세포 및 파골세포로 구성된 결합 조직이며, 미네랄화된 세포외 매트릭스로 강도와 유연성을 제공하고 그 기능을 수행할 수 있게 합니다. 뼈는 병리학 적 조건에서 뼈 리모델링을 조절 할 수있는 다양한 자극에 지속적으로 노출됩니다. 뼈 생물학 및 질병을 연구하고 잠재적인 치료제를 평가하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 개발할 필요가 있었습니다.

이 원고는 뼈 형성 및 뼈 종양 미세 환경을 연구하기 위해 신생아 마우스로부터 분리 된 calvarias의 해부 과정 및 배양 조건을 설명합니다. 시험관 내 및 생체 내 모델과는 달리, 이 ex vivo 모델은 정의된 조건하에서 배양하는 동안 조직의 3차원 환경뿐만 아니라 뼈의 세포 다양성을 보존하여 원하는 미세 환경을 시뮬레이션할 수 있습니다. 따라서, 뼈 리모델링 및 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다., 다른 세포 유형과의 상호 작용 뿐만 아니라, 암 세포와 뼈 사이 상호 작용 등.

여기에서 보고된 분석은 5-7 일 오래된 BALB/C 마우스에서 calvarias를 이용합니다. 수득된 헤미-칼바리아는 인슐린, 유방암 세포(MDA-MB-231) 또는 유방암 세포 배양으로부터 조절된 배지의 존재하에 배양된다. 분석 후, 인슐린이 새로운 뼈 형성을 유도하는 것으로 확립되었으며, 암세포와 이들의 조절된 배지는 뼈 흡수를 유도하였다. calvarial 모형은 뼈 발달 및 암 유도한 뼈 질병을 공부하기 위하여 기초그리고 적용한 연구에서 성공적으로 이용되었습니다. 전반적으로, 그것은 쉬운, 유익한, 그리고 저렴 한 비용 분석에 대 한 훌륭한 옵션.

Introduction

뼈는 근육을 지원하고, 내부 장기와 골수를 보호하고, 칼슘과 성장 인자를 저장 및 방출하는 등 여러 기능을 가지는 동적 결합^조직1,,2. 무결성과 적절한 기능을 유지하기 위해 뼈 조직은 리모델링 과정에서 지속적으로 진행됩니다. 일반적으로, 뼈 리모델링의 주기는 뼈 재흡수와 뼈 형성으로 나눌 수 있습니다^1. 뼈 리모델링의 이 2단계 사이 불균형은 뼈 병리의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 또한, 유방암과 같은 질병은 종종 뼈의 무결성에 영향을 미칩니다. 진보된 단계에 있는 환자의 대략 70% 이상은 뼈 전이가 있을 것입니다. 유방암 세포가 뼈에 들어가면 뼈 대사에 영향을 미치고 과도한 흡수 (파골 세포 병변) 및 / 또는 형성 (골아세포^병변)3.

뼈 질환의 생물학을 이해하고 새로운 치료법을 개발하려면 뼈 리모델링과 관련된 메커니즘을 이해해야합니다. 암 연구에서, 뼈 전이 과정 및 전이성 미세 환경과의 관계를 조사하는 것이 필수적입니다. 1889년, 스티븐 파짓은 종양 세포와 표적 조직 사이에 호환성이 있을 때 전이가 발생한다고 가설하고, 전이성 부위는 미세환경^4에대한 종양의 친화도에 의존한다고 제안했다. 1997년, 문디와 기즈는 종양 세포가 생존과 성장을 달성하기 위해 뼈 미세 환경을 수정하는 방법과 뼈 미세 환경이 칼슘과 성장 인자를 제공함으로써 성장을 촉진하는 방법을 설명하기 위해 "뼈 전이의 악순환"의 개념을^{도입했다 5,,6,,7.}

뼈 리모델링 및 뼈 전이에 관여하는 메커니즘을 특성화하고 가능한 치료 잠재력을 가진 분자를 평가하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 개발할 필요가 있었습니다. 그러나, 이러한 모델은 현재 뼈 미세 환경의 단순화 된 표현과 같은 많은 제한사항을 제시하고, 그 비용^8,,9. 생체내 외형의 ex vivo 배양은 골세포의 다양성뿐만 아니라 3차원 조직을 유지하는 장점이 있다. 또한, 실험 조건을 제어할 수 있다. 이식 모델은 중족골 뼈, 대퇴머리, 칼바리아, 하악골 또는 근체 또는 궤적^{코어(10)의}배양을 포함한다. ex vivo 모델의 장점은 다양한 연구에서 입증되었습니다. 2009년, Nordstrand 및 협력자들은 뼈와 전립선암 세포 사이의 상호 작용에 기초하여 동문화 모델의 확립을 보고했다^11. 또한, 2012년, 커틴과 협력자들은 생체내 코컬쳐^12를이용한 3차원 모델의 개발을 보고했다. 이러한 생체내 모델의 목적은 정상 또는 병리학적 뼈 리모델링에 관여하는 메커니즘을 특성화하고 새로운 치료제의 효능을 평가할 수 있도록 가능한 한 정확하게 뼈 미세환경의 조건을 재현하는 것이다.

본 프로토콜은 Garrett¹³ 및 Mohammad et al.^14에의해 출판된 절차를 기반으로 합니다. 신생아 마우스 calvaria 배양체는 성숙한 파골세포및 파골세포로 이어지는 모든 분화 단계(즉, 골세포, 파골세포, 골혈계, 기질 세포)를 포함하여 발달 중인 뼈및 골세포의 3차원 구조를 유지하면서 실험 모델로 사용되어 왔으며, 이는 광물화된 미네랄화^{매트릭스뿐만}아니라 1.000.00.1이다. ex vivo 모델은 뼈 질환의 병리학 적 과정을 완전히 나타내지 않습니다. 그러나, 뼈 리모델링 또는 암 유발 뼈 골용해에 미치는 영향을 정확하게 측정할 수 있습니다.

간략하게, 이 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다: 5-7일 된 마우스에서 calvarias의 해부, calvaria preculture, calvaria 배양 응용 프로그램 (예를 들면, 인슐린의 존재에 있는 배양, 암세포 또는 조건부 배지, 및 에이전트를 가진 조차 치료 잠재력, 조사의 목적에 따라), 뼈 고정 및 calvaria decalcification, 조직 처리, 조직 분석 및 결과 해석.

Protocol

이러한 비약에 사용된 모든 마우스는 BALB/c 마우스 균주로부터 수득되었고, 남성과 암컷 마우스를 무차별적으로 사용하였다. 이전 배양 실험은 또한 FVB, 스위스 마우스, CD-1, 및 CsA 마우스^{11,,12,,14와}같은 다른 균주를 사용하여 수행되었다. 모든 마우스는 건강의 국가 학회 (NIH) 지침에 따라 보관되었다, 부록 Q. 동물 과목을 포함하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (IACUC) 엔세나다에서 과학 연구 및 고등 교육 센터 (CICESE).

1. 칼변리해부

1. 해부 기구 (예 : 1 x 2 치아 조직 집게, 직선 수술 가위, 해부 가위, 미세 팁 핀셋, 미세 한 곡선 팁 해부 집게, 해부 집게, 메스). 멸균 증류수는 각 해부 사이의 수술 도구를 청소하는 데 사용할 수 있으며 멸균 1x PBS는 각 헤미-칼바리아를 청소하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 멸균 해부 기구, 물, 1x PBS 및 필요한 물질을 라미나 유동 후드에 시술(예: 마이크로파이펫, 침전물 안경, 멸균 페트리 접시)에 놓는다.
   참고: 멸균 조건하에서 전체 절차를 수행하십시오.
3. 멸균 1x PBS 12 mL을 10cm 페트리 접시 2개에 넣습니다.
4. 새끼를 선택하고 후드 근처에 놓습니다.
   참고 : 5-7 일 된 새끼에서 calvarias를 해부하십시오.
5. 해부 집게를 사용하여 마우스를 조심스럽게 선택하고 잡습니다.
6. 해부 가위를 사용하여 마우스를 참수하고 PBS와 페트리 접시에 머리를 배치합니다.
   참고: 참수하는 오래된 마우스에는 적합하지 않습니다. 실험이 오래된 마우스로 수행되어야하는 경우, 안락사의 방법은 동물 실험 규칙에 따라 수정되어야한다.
7. 1 x 2 치아 조직 집게로 코 부위에 머리를 단단히 잡고 칼라바리아가 보일 때까지 두개골 위로 피부를 제거하십시오.
8. 노출된 칼바리아에서 두개골의 봉합사(즉, 시상, 관상 동맥 및 람도이드)를 식별합니다.
9. 양두 봉합사 뒤에 약 2mm의 마이크로시저 끝으로 침투하여 직선으로 잘라냅니다.
10. 두개골 뒤쪽에 미세매기의 팁을 삽입합니다. 양두 봉합사의 말단 면을 따라 코로나 봉합사를 향해 똑바로 자른다. 다른 양두 봉합사와 유사하게 진행하십시오.
11. 전방 폰타넬의 절단으로 만든 컷의 끝을 연결하기 위해 (45 ° 각도) 또 다른 컷을 합니다.
12. 다른 양두 봉합사를 가지고 1.10 단계와 1.11단계를 반복합니다.
    참고: 적절한 절단을 수행하고 적절한 임베딩 및 데이터 분석을 수행할 수 있도록 봉합사를 식별하는 것이 중요합니다.
13. 미세 팁 집게를 사용하여 칼바리아를 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. 메스로, 관상 봉합사를 통해 시상 봉합사를 따라 후방 폰타넬에서 직선 컷을하고 두 헤미 - 칼바리아를 얻기 위해 전면 폰타넬에서 끝납니다.
14. 미세하게 기울어진 핀셋으로 헤미-칼바리아를 각각 집어 들고 PBS가 들어있는 새로운 페트리 접시에 넣습니다.

2. 칼바리아 문화

1. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)과 1% 항생제/항균제(즉, 페니실린 및 스트렙토마이신)를 24웰 플레이트의 우물에 보충한 고당포도 DMEM 배지 1 mL을 첨가합니다. 미세 팁 집게로, 각 헤미 - calvaria를 선택하고 우물에 배치합니다.
   참고 : 헤미 - 칼바리아 오목 측면을 내려 놓습니다.
2. 37 °C에서 24 시간 동안 헤미 -calvarias를 5 %_CO2로배양합니다.
3. 각 웰로부터 배양 배지를 제거하고 화합물을 함유하는 신선한 배지1 mL을 첨가하여 다른 세포로부터 또는 컨디셔닝된 배지를 시험한다.
   참고: 각 치료 그룹에 대해 적어도 3개의 헤미-칼바리아를 사용하고 음성 및 양성 대조군을 사용하십시오.
4. 7 일 동안 헤미 - 칼바리아를 배양하고 2-3 일마다 미디어를 변경합니다.

3. 암세포를 가진 배양

1. 80-90% 합류에서 암세포가 있는 페트리 접시를 선택하고 시도해 보십시오. 트립시니즈를 시도하려면, PBS(75 cm² 플라스크당 5 mL)를 사용하여 암세포를 1x 세척한 다음 0.05% 트립신 과 0.53 mM EDTA(75 cm² 플라스크당 2 mL)를 함유하는 HBSS 용액에서 배양하였다.
2. 실온(RT)에서 5분 동안 800 x g에서 15 mL 원엽 튜브와 원심분리기에 셀 현탁액을 옮긴다.
3. 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
4. 2% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1% 항생제/항균제를 함유한 DMEM 의 2 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 라이브 셀을 계산합니다.
5. 각 연구 그룹(즉, RNA 또는 장기학 분석을 위한 음성 대조군 및 동문화 그룹)에 헤미-칼바리아를 할당한다.
6. 헤미-칼바리아에서 배양 배지를 제거하고 2% FBS와 1% 항생제/항균제를 함유한 DMEM 1 mL을 추가하거나 암세포로 보충하지 않습니다.
   참고: 추가할 셀의 양은 테스트된 세포주에 따라 변경될 수 있습니다. MDA-MB-231 또는 PC-3 같이 암세포로, 잘 당 500,000세포는 적당히 작동합니다.
7. 37 °C에서 24 시간 동안 5 %_CO2로배양하십시오. 각 헤미-칼바리아를 새로운 우물로 전달하여 뼈 조직에 부착된 암세포만 유지합니다.
8. 37°C에서 5%_CO2로 7일 동안 배양하고 2-3일마다 미디어를 변경합니다.

4. 고정

1. 티슈 페이퍼의 사각형을 잘라 헤미-칼바리아를 감싸는다.
   참고 : 생검 폼 패드 또는 작은 생검을위한 강철 캡슐도 사용할 수 있습니다.
2. 직선 미세 팁 집게를 사용하여 시상 봉합사에서 각 헤미 -calvaria를 집어 들고 티슈 페이퍼에 놓고 감싸세요.
3. 포장된 헤미-칼라바리아를 라벨이 붙은 임베딩 카세트 안에 넣습니다.
4. 카세트를 10% 인산완충 포르말린이 있는 용기에 넣습니다.
5. 4 °C에서 24 시간 동안 수정하십시오.

5. 탈석화

1. 포르말린을 제거하고 1 x PBS를 추가하고 30 분 동안 조직을 교반하여 헤미 칼바리아를 헹구습니다.
2. PBS를 제거하고 10% EDTA(pH = 8, 0.34 M)를 추가합니다.
   참고 : 용액이 조직을 완전히 덮고 있는지 확인하십시오.
3. 4 °C에서 48 시간 동안 조직을 decalcify.
4. EDTA 용액을 버리고 1x PBS를 추가하여 조직을 헹구십시오.
5. 헤미-칼바리아를 70% 에탄올에 보관하여 반학 처리전까지 보관한다.

6. 조직 처리

1. 96 % 에탄올, 60 분 (3 배) 라운드로 조직을 탈수하고 100 % 에탄올, 60 분 (3 배)을 채색합니다.
2. 에탄올을 100% 자일렌, 60분(3x)으로 교체합니다.
3. 파라핀 왁스로 카세트를 60 분 (2x)으로 배양합니다.

7. 포함

1. 카세트를 열고 티슈 페이퍼를 조심스럽게 제거하고 칼바리아를 풀습니다.
2. 각 calvaria를 조심스럽게 선택하고 같은 방향에서 같은 그룹에서 모든 헤미 - calvariasas를 스택.
3. 파라핀을 틀에 넣습니다.
4. 집게로 모든 헤미-칼바리아를 집어 들고 시상 봉합사를 금형의 베이스쪽으로 내려 놓고 금형 내부에 놓습니다.
   참고 : 포함 하는 동안 금형에 헤미-calvarias의 방향은 일관 된 조직 학적 섹션 및 재현 가능한 결과 얻을 중요 하기 때문에이 방향은 calvarias에서 전면 및 정수리 뼈의 후방 식별을 허용 하기 때문에 및 관상 봉합사는 정량적 평가를 용이하게한다.
5. 집게를 놓고 헤미-칼바리아가 제자리에 있는지 확인합니다.
6. 라벨이 붙은 카세트를 몰드 위에 놓고 더 많은 파라핀으로 채워 헤미-칼바리아를 덮습니다.
7. 금형을 차가운 표면으로 이동합니다.

8. 절제

1. 마이크로토메로 시상 봉합사의 500-600 μm를 다듬습니다.
2. 4 μm 두께의 섹션을 잘라 필요한 섹션을 수집합니다.
3. 다른 300 μm을 다듬습니다.
4. 절단 및 다른 6 4 μm 두께의 섹션을 수집합니다.
5. 블록 300 μm을 더 잘라내고 더 많은 섹션을 수집합니다.
6. 섹션을 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
7. RT에서 슬라이드를 건조합니다.

9화 염색

1. 100% 자일렌으로 3분 동안 담그면 됩니다.
2. 100% 에탄올에 1분 동안 담급전합니다.
3. 96% 에탄올을 1분 동안 병합합니다.
4. 80% 에탄올에 1분 동안 담그면 됩니다.
5. 70% 에탄올을 1분 동안 물에 담그고 있습니다.
6. 물로 3분 동안 헹구어 내보소서
7. 헤마톡실린에 3분 동안 담가 두면
8. 단면이 명확해질 때까지 물로 헹구어 보시고 자라고 합니다.
9. 포화 탄산리튬 용액에 10초 동안 담급하게 하십시오.
10. 물로 3분 동안 헹구어 내보소서
11. 96% 에탄올을 1분 동안 물에 담그고 있습니다.
12. 에오신에 3분 동안 담가 두면
13. 96% 에탄올에 1분 동안 담그면 됩니다.
14. 100% 에탄올에 1분 동안 담급전합니다.
15. 100% 자일렌에 3분 동안 담급전합니다.
16. 미끄럼틀에 장착 매체당 일부를 추가하고 커버슬립으로 보호합니다.
    참고: 타타르산성 산 인산산 인산(TRAP) 염색으로 염색된 헤마톡시라인과 에오신(H&E)을 보완하여 파골세포와 골다골용을 평가할 수 있습니다.

10. 정량적 평가: 분석 영역 정의

1. 저전력(즉, 4x)의 섹션을 검사하여 방향과 봉합사를 식별합니다.
2. 관상 봉합사를 정의하고 한쪽의 긴 뼈 표면과 다른 쪽의 짧은 표면을 식별합니다.
3. 40배 배율 로 관상 봉합사를 식별하고 긴 표면을 따라 봉합사에서 두 개 또는 세 개의 광학 필드를 멀리 이동합니다. 분석을 위해 이 영역의 이미지를 캡처합니다.
4. 이전 골격 영역과 새 골격 영역을 정의합니다. 오렌지 G와 eosin Y는 오래된 뼈가 어둡고 새로운 뼈가 더 밝아집니다.
5. 색상 임계값 도구를 사용하여 Image J 소프트웨어를 사용하여 이전 골격과 새 골격의 총 골격 면적을 측정합니다. 결과를 μm^2로표현합니다.

11. 데이터 분석

1. 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 그룹 간의 유의한 차이는 적절한 시험(예를 들어, 헤렐이 행해진 바와 같이 비모모문 Mann-Whitney U 시험)을 사용하여 결정될 수 있다.

Results

칼변리 모델에서 뼈 형성을 평가하기 위해 인슐린의 50 μg/mL 유무에 관계없이 매체에서 헤미-칼바리아를 재배했습니다. 조직 절편을 H&E로 제조하고 염색하였다. 이러한 조건에서 조직학은 종아리 뼈의 구조적 무결성이 유지되어 다른 성분의 식별을 허용하는 것으로 나타났습니다(그림 1). 인슐린으로 처리된 칼바리아는 대조군과 비교하여 뼈 조직의 양이 증가하였다(도2A). 헤미-칼바리아의 두께 및 뼈 영역에 대한 정량적 조직체 분석은 대조군과 비교하여 인슐린 처리 된 조직에서 두 파라미터 모두에 대한 유의한 증가를 확인하였다(도2B). 이들 데이터는 골 형성 조건을 재현하기 위한 생체 외 모델 프로토콜의 타당성을 나타낸다.

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Discussion

여기서, 우리는 뼈 형성 또는 재흡수를 평가하고 calvarial 마우스 뼈를 가진 암세포의 상호 작용을 연구하기 위하여 calvarial ex 생체 모델을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 기술의 중요한 단계는 칼바리아의 해부, 문화, 포함 및 조직 형성 분석입니다. 칼라핀 을 포함하는 동안 방향을 강하게 촉진하기 때문에 칼바리아를 사다리꼴로 자르는 것이 중요합니다. calvarias와 암 세포 상호 작용을 공부할 때, 암 세포가 뼈 대신 플라스틱에 준수하고 성장하는 것을 방지하기 위하여 세포 배양을 위해 취급되지 않는 multiwell 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 조직 포함 동안 각 헤미 -calvaria를 신중하게 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 그들은 파라핀 블록의 바깥쪽에 시상 테두리와 수직 방식으로 배치해야합니다. 뼈의 방향은 일관된 조직학적 섹션과 재현 가능한 결과를 얻기 위해 필수적입니다. 마찬가지로, 골격 리모델링을 측정하기 위해 칼바리아의 특정 영역을 정의하는 조직 형태 분석 중 일관성...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24웰 세포 배양	Corning	CLS3524
24웰 비조직 배양	Falcon	15705-060
2mL cryovial	SSI	2341-S0S
항생제-항진균제	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
원심분리기	Eppendorf	22628188	원심분리기 5810R
커버슬립	Corning	2935-24X50
Cytoseal 수지	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco의 Eagles Medium, 4.5g/L 포도당 및 L-글루타민, 피루브산 나트륨 없음	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
에베딩 카세트	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
임베딩 워크스테이션	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
에탄올 앱솔루트	JALMEK	E5325-17P
소 태아 혈청	Biowest	BIO-S1650-500
필터	Corning	CLS431229
겸자 및 가위	LANCETA HG	74165
포르말린 완충 10%	시그마	HT501320
유리 슬라이드 25 x 75 mm	프리미어	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
하이 프로파일 블레이드	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
소 췌장에서 추출한 인슐린	Sigma	16634
현미경	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
마우스 사료, 18% 보호, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
오렌지 G	바이오 베이직	OB0674-25G
파라핀	파라플라스트	39601006
파라핀 섹션 부양 목욕	전열	MH8517X1
페트리 접시	코닝	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan 블루	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
왁스 디스펜서	전열	MH8523BX1
크실렌	골든	534056-500ML