Summary
骨外植物的外生培养是骨生理学研究的宝贵工具，是骨改和骨病药物的潜在评价。提交的协议描述了从新生小鼠头骨分离的钙瓦里亚的制备和培养及其应用。
Abstract
骨骼是由成骨细胞、骨细胞和成骨细胞组成的结缔组织，是一种成矿的细胞外基质，赋予其强度和灵活性，使其能够履行其功能。骨骼不断受到各种刺激，在病理条件下可以放松对骨重塑的调节。为了研究骨生物学和疾病，并评估潜在的治疗药物，有必要开发体外和体内模型。
本稿描述了从新生儿小鼠分离的钙质的解剖过程和培养条件，以研究骨骼形成和骨肿瘤微环境。与体外和体内模型不同，这种前活体模型允许保存组织的三维环境以及骨骼的细胞多样性，同时在规定的条件下进行培养以模拟所需的微环境。因此，可以研究骨重塑及其机制，以及与其他细胞类型的相互作用，如癌细胞和骨骼之间的相互作用。
这里报告的测定使用5-7天大的BALB/C小鼠的钙瓦里。获得的中度钙瓦解是在存在胰岛素、乳腺癌细胞（MDA-MB-231）或乳腺癌细胞培养物的调节介质的情况下培养的。经分析，确定胰岛素诱发新的骨骼形成，而癌细胞及其条件介质诱发骨吸收。钙质模型已成功应用于基础和应用研究，研究骨骼发育和癌症诱发的骨病。总体而言，它是简单、信息丰富、低成本测定的绝佳选择。
Introduction
骨骼是一种动态的结缔组织，具有多种功能，包括支持肌肉，保护内脏器官和骨髓，储存和释放钙和生长因子11，2。2为了保持其完整性和功能，骨组织不断进行重塑。一般来说，骨重塑的周期可以分为骨吸收和骨骼形成1。骨重塑这两个阶段之间的不平衡可能导致骨病理学的发展。此外，乳腺癌等疾病通常影响骨骼完整性;大约70%以上的晚期患者有或将有骨转移。当乳腺癌细胞进入骨骼时，它们影响骨骼代谢，导致过度再吸收（骨质病变）和/或形成（骨质病变）3。
要了解骨病的生物学，开发新的治疗方法，必须了解骨重塑所涉及的机制。在癌症研究中，研究骨转移过程及其与转移微环境的关系至关重要。1889年，Stephen Paget假设当肿瘤细胞和目标组织之间存在相容性时就会发生转移，并建议转移位点取决于肿瘤对微环境4的亲和力。1997年，蒙迪和吉斯引入了"骨转移的恶性循环"的概念，以解释肿瘤细胞如何改变骨微环境以实现其生存和生长，以及骨微环境如何通过提供钙和生长因子55、6、76,7来促进其生长。
为了描述骨重塑和骨转移所涉及的机制，并评估具有潜在治疗潜力的分子，有必要在体外和体内培养模型。然而，这些模型目前存在许多限制，如骨微环境的简化表示，其成本88，9。9骨外植物外植物的培养具有保持三维组织以及骨细胞多样性的优点。此外，可以控制实验条件。外植模型包括骨骼、股骨头、钙质体和颌骨或纹芯10的培养。在不同研究中，前活体模型的优点得到了证明。2009年，Nordstrand和合作者报告说，建立了基于骨癌和前列腺癌细胞11相互作用的共同培养模型。此外，在2012年，Curtin和合作者报告说，使用外野共同培养12的三维模型的发展。这种前活体模型的目的是尽可能准确地重现骨微环境的条件，以便能够描述正常或病理性骨重塑所涉及的机制，并评估新的治疗剂的疗效。
本议定书以加勒特13和穆罕默德等人14日公布的程序为基础。新生儿小鼠钙质培养物已被用作实验模型，因为它们保留了发育中的骨骼和骨细胞的三维结构，包括分化所有阶段的细胞（即成细胞、成骨细胞、骨细胞、基质细胞），这些细胞导致成熟成骨细胞和成骨细胞，以及矿化基质14。前活体模型并不完全代表骨病的病理过程。然而，对骨骼重塑或癌症引起的骨裂的影响可以准确测量。
简而言之，该协议包括以下步骤：从5-7天大小鼠的钙质解剖，钙质预培养，钙质培养应用（例如，在胰岛素存在培养，癌细胞或中等，甚至剂与治疗潜力，根据调查的目的），骨固定和钙质化贴花，组织处理，组织分析，结果解释。
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Protocol
这些测定中使用的所有小鼠都是从BALB/c小鼠菌株中获得的，不分青红皂白地使用雄性小鼠和雌性小鼠。以前的培养实验也使用其他菌株进行，如FVB、瑞士小鼠、CD-1和CsA小鼠11、12、14。11,12,14所有小鼠均根据国家卫生研究院（NIH）指南，涉及动物主题的附录Q程序已获得恩塞纳达科学研究和高等教育中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 卡尔瓦里解剖
- 消毒解剖仪器（例如，1 x 2 牙齿组织钳、直手术剪刀、解剖剪刀、细尖钳、细曲线尖端解剖钳、解剖钳、手术刀）。无菌蒸馏水可用于清洁每次解剖之间的手术工具，无菌 1x PBS 可用于清洁每个下部。
- 将无菌解剖仪器、水、1x PBS 和执行该程序所需的材料（例如，微移液器、沉淀玻璃、无菌培养皿）放入层压流量罩中。
注：在无菌条件下执行整个过程。 - 将 12 mL 无菌 1x PBS 加入两个 10 厘米的培养皿中。
- 选择小狗并将其放置在引擎盖附近。
注：从5-7天老小狗中分离到钙瓦里亚。 - 使用解剖钳仔细挑选和握住鼠标。
- 用解剖剪刀将鼠标斩首，并将头放在带有PBS的培养皿中。
注：斩首不适合年龄较大的小鼠。如果实验必须用年龄较大的小鼠完成，则应根据动物实验规则修改安乐死方法。 - 用 1 x 2 牙齿组织钳子牢牢握住头部，将头骨上的皮肤移开，直到骨瓦里亚可见为止。
- 识别裸露的颅骨的缝合线（即下垂、冠状和羊皮）。
- 在羔羊缝合线后面用大约 2 mm 的微剪刀尖端穿透，并沿着它进行直切。
- 将微剪刀的尖端插入头骨的后侧。沿着羊皮缝合线的远端向日冕缝合线直切。以其他羔羊缝合线进行类似操作。
- 进行另一个切割（以 45° 角）连接前方字体的切口的末端。
- 重复步骤 1.10 和 1.11 与其他羊羔缝合线。
注： 识别缝合线以进行适当的切割并能够执行适当的嵌入和数据分析非常重要。 - 使用细尖钳来去除卡瓦里亚，并将其放入培养皿中。用手术刀，沿着下垂缝合线沿着下垂缝合线从后方骨直接切开，最后以前方骨，获得两个半叶素。
- 拿起每个中度卡瓦里亚与细尖钳，并把它们放在一个新的培养皿含有PBS。
2. 卡尔瓦里亚文化
- 在24孔板的井中加入1 mL高葡萄糖DMEM介质，补充0.1%的牛血清白蛋白（BSA）和1%的抗生素/抗霉素（即青霉素和链霉素）。用细尖钳，拿起每个中部卡瓦里，并将其放在井里。
注：将下部反压板凹面。 - 在37°C下用5%CO2孵育了24小时。
- 从每个井中取出培养介质，并添加1 mL含有化合物的新鲜介质，以测试或调节其他细胞中的培养介质。
注：对每个治疗组至少使用三个中度钙化物，并使用负和阳性对照。 - 孵育了7天的中部性，每2-3天更换一次媒体。
3. 癌细胞培养
- 选择一个与癌细胞在80-90%汇合处的培养皿，并尝试它们。要尝试化，使用PBS（每75厘米2瓶5 mL）清洗癌细胞1倍，然后孵育在含有0.05%胰蛋白酶和0.53 mM EDTA（每75厘米2瓶2瓶2 mL）的HBSS溶液中孵化。
- 在室温 （RT） 下，将电池悬浮液转移到 15 mL 锥形管和 800 x g的离心机中 5 分钟。
- 取出并丢弃上清液。
- 在含有2%胎儿牛血清（FBS）和1%抗生素/抗病菌的2 mLDMEM中重新悬浮颗粒。计算活动单元格。
- 将神经-钙化物分配给每个研究组（即用于RNA或组织学分析的负对照和共同培养组）。
- 从半钙化物中取出培养介质，加入1 mLDMEM，含有2%FBS和1%抗生素/抗肿瘤，补充或未补充癌细胞。
注： 要添加的单元格量可能会根据所测试的单元格行而变化。对于MDA-MB-231或PC-3等癌细胞，每口50万个细胞工作正常。 - 在37°C下孵育24小时，CO2为5%。将每个神经质转移到一个新的井，只保留粘附在骨组织的癌细胞。
- 在37°C孵育7天，同时进行5%的CO2，每2-3天更换一次介质。
4. 固定
- 切上纸巾的正方形来包裹中部性钙。
注：也可使用用于小型活检的活检泡沫垫或钢胶囊。 - 使用直细尖钳从下垂缝合线拾取每个下部钙化物，放在纸巾上，然后包裹。
- 将包裹的中式卡瓦里放入有标签的嵌入盒中。
- 将盒式磁带放入装有 10% 磷酸盐缓冲形式中的容器中。
- 在 4 °C 下修复 24 小时。
5. 标记
- 取出形式素，加入1x PBS，搅拌组织30分钟以冲洗半卡半部。
- 卸下 PBS 并添加 10% EDTA（pH = 8，0.34 M）。
注：验证溶液是否完全覆盖组织。 - 在4°C下，将组织标记48小时。
- 丢弃 EDTA 溶液，加入 1x PBS 冲洗纸巾。
- 将中部钙瓦解储存在 70% 乙醇中，直到进行本体处理。
6. 组织处理
- 用96%乙醇、60分钟（3倍）的轮值脱水组织，然后是100%乙醇，60分钟（3倍）。
- 用100%二甲苯，60分钟（3倍）代替乙醇。
- 用石蜡孵育盒，60 分钟（2 倍）。
7. 嵌入
- 打开盒式磁带，小心地取出纸巾，然后解开卡瓦里亚。
- 小心地拾取每个卡瓦里亚，并将同一组的所有反式钙化体堆叠在同一方向上。
- 在模具中放一些石蜡。
- 用钳子拾取所有下部，并将其放入模具内，用下垂缝合线朝下向模具底部。
注： 在加入过程中，模具中半钙化体的定向对于获得一致的组织学部分和可重复的结果至关重要，因为这种方向将允许从卡瓦里亚对前骨和体骨进行后识别和日冕缝合线促进定量评估。 - 松开钳子并验证中部卡瓦里亚是否保持原位。
- 将贴有标签的盒式磁带放在模具顶部，用更多的石蜡填充，以覆盖半卡瓦里斯。
- 将模具移到冷表面。
8. 分节
- 用微缩体修剪500-600 μm的下垂缝合线。
- 切割 4 μm 厚的截面，并收集所需的部分。
- 再修剪 300 μm。
- 切割并收集另外六个 4 μm 厚的部分。
- 进一步修剪块 300 μm 并收集更多部分。
- 将部分安装到玻璃显微镜幻灯片上。
- 在 RT 处干燥幻灯片。
9. 染色
- 将部分浸入 100% 二甲苯中 3 分钟。
- 浸入100%乙醇1分钟。
- 在 96% 乙醇中合并 1 分钟。
- 浸入80%乙醇1分钟。
- 浸入70%乙醇1分钟。
- 在水中冲洗3分钟。
- 在血氧林中浸泡3分钟。
- 在水中冲洗，直到部分变清。
- 浸入饱和碳酸锂溶液中 10 秒。
- 在水中冲洗3分钟。
- 在96%乙醇中浸入1分钟。
- 潜入欧辛3分钟。
- 浸入96%乙醇1分钟。
- 浸入100%乙醇1分钟。
- 浸入 100% 二甲苯 3 分钟。
- 向幻灯片中添加一些每个安装介质，并带有盖玻片。
注：您可以用耐酸酸磷酸酶 （TRAP） 染色来补充血氧素和欧辛 （H&E） 染色，以评估骨质和骨质致病。
10. 定量评估：确定分析领域
- 检查低功耗（即 4x）下的节，以确定方向和缝合线。
- 定义日冕缝合线，并识别一侧的长骨表面和另一侧的短表面。
- 在 40 倍放大倍率下识别日冕缝合线，并沿长表面将两个或三个光学场从缝合线移开。捕获此区域的图像进行分析。
- 定义旧骨区域和新骨区域。橙色 G 的 eosin Y 使旧骨变暗，新的骨打火机。
- 使用 Image J 软件使用颜色阈值工具测量新旧骨骼的总骨面积。将结果表示为 μm2。
11. 数据分析
- 使用统计软件分析结果。组之间的显著差异可以通过适当的测试（例如，非参数曼-惠特尼 U 测试，如执行护套）来确定。
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Representative Results
为了评估钙质模型中的骨形成，我们在具有或不含50μg/mL胰岛素的介质中培育了中层钙质。组织部分被制备并染色H&E。在这些条件下，组织学表明，骨骼的结构完整性得以保持，从而能够识别其不同成分（图1）。与对照相比，用胰岛素治疗的钙质比骨组织的数量增加了（图2A）。对血型钙质厚度和骨面积的定量组织形态分析证实，与对照对照相比，胰岛素治疗组织中的两个参数都有显著增加（图2B）。这些数据表明，前活体模型协议对骨骼形成条件进行复制的可行性。
此外，钙质外活体模型可用于重现癌症和骨微环境条件。该协议用于评估乳腺癌细胞MDA-MB-231对鼠钙瓦里亚的影响。为此，钙质骨直接与癌细胞共同培养，或只与癌细胞的调节培养介质。经过7天的培养，将钙化物嵌入石蜡中，并进行了H&E染色。与MDA-MB-231乳腺癌细胞的共培养似乎增加了骨解，如骨的减少和对钙质结构的损害，与只使用介质培养的控制性钙质相比（图2A）。与对照相比，卡尔瓦里亚的骨面积定量显示，使用MDA-MB-231癌细胞培养的钙质瘤的总骨面积显著减少（图2B）。这些结果表明，具有钙质组织的癌细胞的共生可以重现癌症和骨微环境，可用于研究骨质骨转移的机制或评估这一过程的可能抑制剂。
图1：骨骼组织结构。H&E染色后，中部-钙瓦里的代表组织部分。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：胰岛素增加了体温器的骨面积和厚度，同时将血红细胞与MDA-MB-231乳腺癌细胞共同培养，诱导骨解。对于骨形成模型，在胰岛素存在或不存在的情况下培养了血红素（50 μg/mL），而对于与癌细胞的共培养，在5×105 MDA-MB-231细胞存在或缺席的情况下培养了7天，在H&E染色部分进行了组织形态分析。（A） 代表性组织部分。（B） 骨面积的形态学分析.结果表示为平均值 = SEM （n = 3）。*P < 0.05， 非参数曼-惠特尼 U 测试.请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了计算骨骼形成或吸收以及研究癌细胞与钙质小鼠骨骼相互作用的钙质前活体模型的协议。该技术的关键步骤是钙质的解剖、培养、嵌入和形态学分析。在解剖钙质时，将半部钙质切成梯形至关重要，因为它将有力地促进石蜡加入过程中的方向。在研究癌细胞与钙质的相互作用时，使用未为细胞培养治疗的多孔板来防止癌细胞粘附和生长在塑料上而不是骨头上是很重要的。在组织内含过程中，仔细定向每个中部卡瓦里亚非常重要。它们需要以垂直方式放置，在石蜡块的外侧有下垂边框。骨骼的方向对于获得一致的组织部分和可重复的结果至关重要。同样，在态化分析期间，在计算骨骼重塑时定义特定区域以测量骨骼重塑，对于一致性也至关重要。在这里，我们首先确定了日冕缝合线，然后是拍摄照片和测量的长骨表面。
为了实现标准化并开发所述协议，我们稍微修改了一些既定方法。在解剖中，PBS用于冲洗小鼠头部，而不是培养介质。为了确定对钙化菌产生作用所需的细胞数量，组织用不同数量的乳腺癌细胞孵育。一般来说，5 x 105癌细胞在7天的测定中工作良好。此外，在固定过程中，使用纸巾代替海绵来保护钙化。纸巾在纸里保存得很好。
描述的模型有一些限制。新生儿小鼠的钙质缺乏作为转移受体的骨骼的某些成分，无论是结构（即曲骨）还是细胞成分（如免疫细胞或骨髓的其他细胞），包括癌细胞相互作用的造血干细胞。体外钙质的培养不能模拟完整的物理病理学。此外，当涉及到骨转移，乳腺癌细胞很少转移到钙质，并倾向于骨骼更活跃的重塑，如椎骨，臀部，或手臂和腿的长骨。此外，中层钙质与癌细胞的共培养只代表转移级联的最新步骤：骨骼的殖民化和转移的生长。此外，样本数量受每只垃圾幼崽数量的限制。建议每个实验使用一个垃圾，不要混合垃圾，以避免结果发生变化。我们使用BALB/c或FVB小鼠的钙质计算时，在骨重塑方面也取得了类似的结果，但该菌株是否影响该测定中骨重塑的时间反应仍有待确定。
与体内模型相比，骨质外活体模型的主要优点包括成本更低、测定简单，以及获得骨骼重塑响应的实验时间较短。癌细胞和钙质的共培养允许研究细胞接触的依从性相互作用以及分泌因子对骨骼重塑的影响，而使用条件介质则能够关注可溶性因素的影响。此外，直接接触模型还有助于骨转移微环境细胞间相互作用和分子机制的表征，以及研究和评估治疗恶性肿瘤骨骼并发症的新药。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
作者感谢马里奥·野村、医学博士和鲁道夫·迪亚斯在《本体学》方面的帮助，以及皮耶里克·富尼尔博士为提高论文质量而提出的宝贵意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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