Summary
La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.
Abstract
L'osso è un tessuto connettivo costituito da osteoblasti, osteociti e osteoclasti e una matrice extracellulare mineralizzata, che gli conferisce la sua forza e flessibilità e gli permette di svolgere le sue funzioni. L'osso è continuamente esposto a una varietà di stimoli, che in condizioni patologiche possono deregolare il rimodellamento osseo. Per studiare biologia e malattie ossee e valutare potenziali agenti terapeutici, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo.
Questo manoscritto descrive il processo di dissezione e le condizioni di coltura dei calvarias isolati dai topi neonemici per studiare la formazione ossea e il microambiente tumorale osseo. A differenza dei modelli in vitro e in vivo, questo modello ex vivo consente la conservazione dell'ambiente tridimensionale del tessuto e della diversità cellulare dell'osso durante la coltura in condizioni definite per simulare il microambiente desiderato. Pertanto, è possibile studiare il rimodellamento osseo e i suoi meccanismi, nonché le interazioni con altri tipi di cellule, come le interazioni tra cellule tumorali e ossa.
I saggi qui riportati usano calvarias da topi BALB/C di 5-7 giorni. Le emi-calvarias ottenute sono coltivate in presenza di insulina, cellule del cancro al seno (MDA-MB-231), o mezzo condizionato dalle colture di cellule del cancro al seno. Dopo l'analisi, è stato stabilito che l'insulina ha indotto nuova formazione ossea, mentre le cellule tumorali e il loro rinnovano osseo medio condizionato. Il modello calvariale è stato utilizzato con successo nella ricerca di base e applicata per studiare lo sviluppo osseo e le malattie ossee indotte dal cancro. Nel complesso, è un'opzione eccellente per un saggio facile, informativo e a basso costo.
Introduction
L'osso è un tessuto connettivo dinamico che ha diverse funzioni, tra cui sostenere i muscoli, proteggere gli organi interni e il midollo osseo, e immagazzinare e rilasciare calcio e fattori di crescita1,2. Per mantenere la sua integrità e la corretta funzione, il tessuto osseo è continuamente sotto il processo di rimodellamento. In termini generali, un ciclo di rimodellamento osseo può essere diviso in risorsurare l'osso e la formazione ossea1. Uno squilibrio tra queste due fasi di rimodellamento osseo può portare allo sviluppo di patologie ossee. Inoltre, malattie come il cancro al seno spesso influenzano l'integrità ossea; circa il 70% dei pazienti in stadi avanzati ha o avrà metastasi ossee. Quando le cellule del cancro al seno entrano nelle ossa, influenzano il metabolismo osseo, con conseguente eccessiva riinstallazione (lesioni osteoclastiche) e/o formazione (lesioni osteoblastiche)3.
Per comprendere la biologia delle malattie ossee e sviluppare nuovi trattamenti, è necessario comprendere i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo. Nella ricerca sul cancro, è essenziale studiare il processo di metastasi ossea e la sua relazione con il microambiente metastatico. Nel 1889, Stephen Paget ipotizzò che le metastasi si verificano quando c'è compatibilità tra le cellule tumorali e il tessuto bersaglio, e suggerì che il sito metastatico dipende dall'affinità del tumore per il microambiente4. Nel 1997, Mundy e Guise hanno introdotto il concetto di "circolo vizioso delle metastasi ossee" per spiegare come le cellule tumorali modificano il microambiente osseo per raggiungere la loro sopravvivenza e crescita, e come il microambiente osseo promuove la loro crescita fornendo fattori di calcio e crescita5,6,7.
Per caratterizzare i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo e nella metastasi ossea e per valutare le molecole con un possibile potenziale terapeutico, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo. Tuttavia, questi modelli presentano attualmente molte limitazioni, come la rappresentazione semplificata del microambiente osseo, e il loro costo8,9. La coltura degli espiatori ossei ex vivo ha il vantaggio di mantenere l'organizzazione tridimensionale e la diversità delle cellule ossee. Inoltre, le condizioni sperimentali possono essere controllate. I modelli espiantanti includono la coltura delle ossa metatarsale, teste femorali, calvarias, e nuclei mandibolari o trabecolari10. I vantaggi dei modelli ex vivo sono stati dimostrati in diversi studi. Nel 2009, Nordstrand e collaboratori hanno riferito l'istituzione di un modello di cocultura basato sulle interazioni tra le cellule tumorali ossee e prostata11. Inoltre, nel 2012, Curtin e collaboratori hanno riportato lo sviluppo di un modello tridimensionale utilizzando coculture ex vivo 12. Lo scopo di tali modelli ex vivo è quello di ricreare le condizioni del microambiente osseo nel modo più accurato possibile per poter caratterizzare i meccanismi coinvolti nel normale o patologico rimodellamento osseo e valutare l'efficacia di nuovi agenti terapeutici.
Il presente protocollo si basa sulle procedure pubblicate da Garrett13 e Mohammad etal. Le colture neovari chevariate di calvaria topo sono state utilizzate come modello sperimentale, in quanto conservano l'architettura tridimensionale dell'osso in fase di sviluppo e cellule ossee, comprese le cellule in tutte le fasi di differenziazione (cioè osteoblasti, osteoclasti, osteociti, cellule stromali) che portano a osteoclasti maturi e osteoblasti, nonché alla matrice minerale14. Il modello ex vivo non rappresenta totalmente il processo patologico delle malattie ossee. Tuttavia, gli effetti sul rimodellamento osseo o sull'osteolisi ossea indotta dal cancro possono essere misurati con precisione.
In breve, questo protocollo consiste nei seguenti passaggi: la dissezione dei calvarias da topi vecchi di 5-7 giorni, precoltura calvaria, applicazioni di coltura calvaria (ad esempio, coltura in presenza di insulina, cellule tumorali o mezzi condizionati, e persino agenti con potenziale terapeutico, secondo lo scopo dell'indagine), fissazione ossea e decalcificazione calvaria, elaborazione dei tessuti, analisi istologica e interpretazione dei risultati.
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Protocol
Tutti i topi utilizzati in questi saggi sono stati ottenuti da ceppi di topi BALB/c, usando indiscriminatamente topi maschi e femmine. Precedenti esperimenti di coltura sono stati eseguiti anche utilizzando altri ceppi, come FVB, topi svizzeri, CD-1 e mouse CsA11,12,14. Tutti i topi sono stati ospitati secondo le linee guida dei National Institutes of Health (NIH), le procedure dell'Appendice Q. che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) presso il Center for Scientific Research and Higher Education di Ensenada (CICESE).
1. Dissezione calvariale
- Sterilizzare gli strumenti di dissezione (ad esempio, 1 x 2 pinze del tessuto dei denti, forbici chirurgiche dritte, forbici dissecistrici, pinzette con punta fine, pinze di dissezione con punta fine, pinze dissetiche, bisturi). L'acqua distillata sterile può essere utilizzata per pulire gli strumenti chirurgici tra ogni dissezione, e sterile 1x PBS può essere utilizzato per la pulizia di ogni emi-calvaria.
- Posizionare gli strumenti di dissezione sterili, l'acqua, l'1x PBS e i materiali necessari per eseguire la procedura (ad esempio, micropipette, bicchieri precipitati, piatti Petri sterili) in un cappuccio a flusso laminare.
NOTA: Eseguire l'intera procedura in condizioni sterili. - Aggiungere 12 mL di pbS sterile 1x in due piatti da 10 cm Petri.
- Selezionare i cuccioli e posizionarli vicino al cofano.
NOTA: Dissezionare i calvarias da cuccioli di 5-7 giorni. - Sollevare e tenere il mouse con attenzione utilizzando pinze di ssezione.
- Decapitare il topo utilizzando forbici sezionate e mettere la testa in un piatto Petri con PBS.
NOTA: La decapitazione non è adatta ai topi più anziani. Se l'esperimento deve essere fatto con topi più anziani, il metodo di eutanasia dovrebbe essere modificato secondo le regole della sperimentazione animale. - Tenere la testa saldamente per la zona del naso con 1 x 2 pinze del tessuto dei denti e rimuovere la pelle sopra il cranio fino a quando la calvaria è visibile.
- Identificare le suture (ad esempio, sagittale, coronale e lambdoid) del cranio sulla calvaria esposta.
- Penetrare con la punta dei microscissors circa 2 mm dietro la sutura lambdoid e fare un taglio dritto a fianco.
- Inserire la punta dei microscissori sul lato posteriore del cranio. Fare un taglio dritto lungo il lato distale della sutura lambdoid verso la sutura coronale. Procedere in modo simile con l'altra sutura lambdoid.
- Fare un altro taglio (con un angolo di 45 gradi) per collegare l'estremità del taglio realizzato con il taglio della fontanel anteriore.
- Ripetere i passaggi 1.10 e 1.11 con l'altra sutura lambdoid.
NOTA: è importante identificare le suture per effettuare tagli appropriati e per essere in grado di eseguire un'adeguata incorporazione e analisi dei dati. - Utilizzare pinze a punta fine per rimuovere la calvaria e metterla in un piatto Petri. Con un bisturi, fai un taglio dritto dalla fontanella posteriore lungo la sutura sagittale attraverso la sutura coronale e termina nella fontanel anteriore per ottenere due emi-calvarias.
- Raccogliere ciascuna delle emi-calvarias con le pinzette a punta fine e metterle in una nuova teglia Petri contenente PBS.
2. Cultura calvaria
- Aggiungere 1 mL di medio DMEM ad alto glucosio integrato con 0.1% di albumina di siero bovino (BSA) e 1% antibiotico/antimicotico (cioè, penicillina e streptomicina) nei pozzi di una piastra di 24 pozze. Con pinze a punta fine, raccogliere ogni emi-calvaria e metterlo in un pozzo.
NOTA: Mettere il lato concavo emi-calvarias verso il basso. - Incubare le emi-calvarias per 24 h a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Rimuovere il supporto di coltura da ogni pozzo e aggiungere 1 mL di supporti freschi contenenti il composto per testare o condizionato supporto da altre celle.
NOTA: Utilizzare almeno tre emi-calvarias per ciascun gruppo di trattamento e controlli negativi e positivi. - Incubare le emi-calvarias per 7 giorni, cambiando i media ogni 2-3 giorni.
3. Coltura con cellule tumorali
- Selezionare un piatto Petri con cellule tumorali a 80-90% confluenza e provare a provarli. Per provare, lavare le cellule tumorali 1x utilizzando PBS (5 mL per 75 cm2 fiaschetta) seguito da incubazione in una soluzione HBSS contenente 0,05% di trypsin e 0,53 mM EDTA (2 mL per 75 cm2 fiaschetta).
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere e scartare il super-natante.
- Risospendere il pellet in 2 mL di DMEM contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico/antimicotico. Contare le cellule vive.
- Assegnare emi-calvarias a ciascun gruppo di studio (cioè il gruppo di controllo e cocultura negativo per l'RNA o l'analisi istologica).
- Rimuovere i mezzi di coltura dall'emi-calvarias e aggiungere 1 mL di DMEM contenente 2% FBS e 1% antibiotico/antimicotico integrato o non integrato con cellule tumorali.
NOTA: la quantità di celle da aggiungere può cambiare a seconda della linea della cella testata. Con le cellule tumorali come MDA-MB-231 o PC-3, 500.000 cellule per bene funzionano in modo appropriato. - Incubare per 24 h a 37 gradi centigradi con 5% di CO2. Passare ogni emi-calvaria in un nuovo pozzo per trattenere solo le cellule tumorali che hanno aderito al tessuto osseo.
- Incubare per 7 giorni a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e cambiare i media ogni 2-3 giorni.
4. Fissazione
- Tagliare quadrati di carta velina per avvolgere le emi-calvarias.
NOTA: Possono essere utilizzati anche cuscinetti in schiuma biopsia o capsule d'acciaio per piccole biopsie. - Utilizzare pinze dritte a punta fine per raccogliere ogni emi-calvaria dalla sutura sagittale, posizionare su una carta velina e avvolgere.
- Posizionare l'emi-calvaria avvolto all'interno di una cassetta di incorporamento etichettata.
- Collocare la cassetta in un contenitore con formalina tampone di fosfato al 10%.
- Fissare per 24 h a 4 gradi centigradi.
5. Decalcificazione
- Rimuovere la formalina, aggiungere 1x PBS e agitare i tessuti per 30 min per sciacquare le emi-calvarias.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 10% EDTA (pH - 8, 0,34 M).
NOTA: verificare che la soluzione copra completamente i tessuti. - Decalcificare i tessuti per 48 h a 4 gradi centigradi.
- Eliminare la soluzione EDTA e aggiungere 1x PBS per sciacquare il tessuto.
- Conservare le emi-calvarias nel 70% di etanolo fino all'elaborazione istologica.
6. Lavorazione dei tessuti
- Disidratare i tessuti con giri del 96% di etanolo, 60 min (3x), seguiti da 100% etanolo, 60 min (3x).
- Sostituire l'etanolo con 100% xilene, 60 min (3x).
- Incubare le cassette in cera di paraffina, 60 min (2x).
7. Incorporamento
- Aprire le cassette, rimuovere con cura la carta velina e srotolare il calvaria.
- Raccogliere ogni calvaria con attenzione e impilare tutte le emi-calvarias dello stesso gruppo nello stesso orientamento.
- Mettere un po 'di paraffina in uno stampo.
- Raccogliere tutte le emi-calvarias con le pinze e metterle all'interno dello stampo con la sutura sagittale verso la base dello stampo.
NOTA: L'orientamento degli emi-calvarias nello stampo durante l'inclusione è fondamentale per ottenere sezioni istologiche coerenti e risultati riproducibili perché questo orientamento consentirà l'identificazione posteriore delle ossa anteriori e parietali dai calvarias e la sutura coronale che facilita la valutazione quantitativa. - Rilasciare le pinze e verificare che le emi-calvarias rimangano al loro posto.
- Posizionare la cassetta etichettata sopra lo stampo e riempirla con più paraffina per coprire le emi-calvarias.
- Spostare gli stampi sulla superficie fredda.
8. Sezionamento
- Tagliare 500-600 m di sutura sagittale con il microtoma.
- Tagliare 4 sezioni spesse 4 m e raccogliere le sezioni necessarie.
- Tagliare altri 300 m.
- Tagliare e raccogliere altri sei sezioni spesse 4 m.
- Tagliare ulteriormente il blocco di 300 m e raccogliere altre sezioni.
- Montare le sezioni su vetrini al microscopio in vetro.
- Asciugare i vetrini a RT.
9. Colorazione
- Immergi le sezioni in xilene al 100% per 3 min.
- Sommergi in etanolo al 100% per 1 min.
- Unire nel 96% etanolo per 1 min.
- Immergere nell'80% di etanolo per 1 min.
- Immergere nel 70% di etanolo per 1 min.
- Risciacquare in acqua per 3 min.
- Immergere in ematossitale per 3 min.
- Sciacquare in acqua fino a quando la sezione è libera.
- Sommerso in una soluzione di carbonato di litio satura per 10 sec.
- Risciacquare in acqua per 3 min.
- Sommergi in 96% etanolo per 1 min.
- Sommerse in eosina per 3 min.
- Immergere nel 96% di etanolo per 1 min.
- Sommergi in etanolo al 100% per 1 min.
- Sommergi lo xilene al 100% per 3 min.
- Aggiungere un po 'per supporto di montaggio al vetrino e proteggerlo con un coperchio.
NOTA: È possibile completare la colorazione ematossina ed eosina (H&E) con colorazione fosfosciasi acida resistente alla crostata (TRAP) per valutare l'osteoclasta e l'osteolisi.
10. Valutazione quantitativa: definizione delle aree di analisi
- Esaminare le sezioni a bassa potenza (ad esempio, 4x) per identificare l'orientamento e le suture.
- Definire la sutura coronale e identificare la lunga superficie ossea da un lato e la superficie corta dall'altro.
- Identificare la sutura coronale sotto l'ingrandimento di 40x e allontanare due o tre campi ottici dalla sutura lungo la superficie lunga. Acquisire immagini di quest'area per l'analisi.
- Definire la vecchia area ossea e la nuova area ossea. L'eosin A Y con G arancione macchia il vecchio osso più scuro e il nuovo osso più chiaro.
- Misurare l'area totale dell'osso del vecchio e del nuovo osso con il software Image J utilizzando lo strumento di soglia del colore. Esprimi i risultati come m2.
11. Analisi dei dati
- Analizzare i risultati utilizzando un software statistico. Le differenze significative tra i gruppi possono essere determinate utilizzando test appropriati (ad esempio, test Non parametrico Mann-Whitney U come viene fatto qui).
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Representative Results
Per valutare la formazione ossea nel modello calvariale, abbiamo coltivato le emi-calvarias nei media con o senza 50 g/mL di insulina. Le sezioni dei tessuti sono state preparate e macchiate di H&E. In queste condizioni, l'istologia ha dimostrato che l'integrità strutturale dell'osso calvariale è stata mantenuta, consentendo l'identificazione dei suoi diversi componenti (Figura 1). Le calvarias trattate con insulina presentavano un aumento della quantità di tessuto osseo rispetto al controllo (Figura 2A). L'analisi quantitativa istomorfometrica per lo spessore e l'area ossea dell'emi-calvaria ha confermato un aumento significativo per entrambi i parametri nei tessuti trattati con insulina rispetto al controllo (Figura 2B). Questi dati indicano la fattibilità del protocollo modello ex vivo per riprodurre le condizioni di formazione ossea.
Inoltre, il modello economico ex vivo può essere utilizzato per riprodurre il cancro e le condizioni di microambiente osseo. Il protocollo è stato utilizzato per valutare l'effetto delle cellule del cancro al seno MDA-MB-231 su murine calvarias. Per eseguire questo, le ossa calvariali sono state costati direttamente con le cellule tumorali o coltivate solo con i mezzi condizionati delle cellule tumorali. Dopo 7 giorni di cultura, le calvarias sono state incorporate nella paraffina, e la colorazione H&E è stata eseguita. La cocultura con le cellule del cancro al seno MDA-MB-231 sembrava aumentare l'osteolisi, come dimostra la diminuzione dell'osso e i danni alla struttura calvariale rispetto ai calvarias di controllo coltivati solo con i media(Figura 2A). La quantificazione dell'area ossea dei calvarias ha mostrato una significativa diminuzione dell'area totale ossea dei calvarias coltivati con cellule tumorali MDA-MB-231 rispetto al controllo (Figura 2B). Questi risultati hanno dimostrato che le coculture delle cellule tumorali con tessuto calvariale possono ricreare il cancro e il microambiente osseo e potrebbero essere utilizzate per studiare i meccanismi della metastasi ossea o per valutare i possibili inibitori di questo processo.
Figura 1: struttura istologica dell'osso calvariale. Sezione tissutale rappresentativa dell'emi-calvaria dopo la colorazione H&E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'insulina ha aumentato l'area ossea e lo spessore delle emi-calvarias ex vivo durante la cocultura di emi-calvarias con cellule tumorali mammarie indotte da MDA-MB-231. Per il modello di formazione ossea, le emi-calvarias sono state coltivate in presenza o assenza di insulina (50 g/mL), mentre per la cocoltura con le cellule tumorali, le emi-calvarias sono state coltivate in presenza o assenza di 5 x 105 cellule MDA-MB-231 per 7 giorni ed è stata eseguita l'analisi di ederametrica su sezioni colorate H&E. (A) Sezioni di tessuto rappresentative. (B) Analisi istomormetrica dell'area ossea. I risultati sono rappresentati come la media , SEM (n , 3). P < 0,05, test non parametrico Mann-Whitney U. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo il protocollo per un modello di ex vivo calvariale per valutare la formazione o il risurrezione ossea e per studiare le interazioni delle cellule tumorali con l'osso cavariale del topo. I passaggi critici di questa tecnica sono la dissezione, la cultura, l'incorporamento e l'analisi istomormetrica dei calvarias. Durante la dissezione delle calvarias, è fondamentale tagliare le emi-calvarias in un trapezio, in quanto faciliterà fortemente l'orientamento durante l'inclusione della paraffina. Quando si studiano le interazioni delle cellule tumorali con le calvarias, è importante utilizzare piastre multiwell che non vengono trattate per la coltura cellulare per evitare che le cellule tumorali aderiscano e crescano sulla plastica invece che sull'osso. Durante l'inclusione dei tessuti, è importante orientare attentamente ogni emi-calvaria. Devono essere collocati in modo verticale con il bordo sagittale sul lato esterno del blocco di paraffina. L'orientamento dell'osso è essenziale per ottenere sezioni istologiche coerenti e risultati riproducibili. Allo stesso modo, è fondamentale per la coerenza durante l'analisi istomorfometrica definire una regione specifica nella calvaria per misurare il rimodellamento osseo. Qui, abbiamo identificato prima la sutura coronale e poi la lunga superficie ossea dove sono state scattate le immagini e le misurazioni effettuate.
Per ottenere la standardizzazione e sviluppare i protocolli descritti, abbiamo modificato leggermente alcune metodologie consolidate. Durante la dissezione dell'emi-calvarias, la PBS è stata utilizzata per sciacquare le teste dei topi invece dei mezzi di coltura. Per determinare il numero di cellule necessarie per produrre un effetto sulle calvarias, il tessuto è stato incubato con diversi numeri di cellule del cancro al seno. In generale, 5 x 105 cellule tumorali funzionano bene per un saggio di 7 giorni. Inoltre, durante la fissazione, la carta velina è stata utilizzata al posto delle spugne per proteggere le calvarias. Il tessuto era ben conservato all'interno della carta.
Il modello descritto presenta alcune limitazioni. Le calvarias dei topi neooalati mancano di alcuni componenti delle ossa che sono il destinatario delle metastasi, sia strutturali (cioè l'osso trasbecolare) che componenti cellulari come le cellule immunitarie o altre cellule del midollo osseo, comprese le cellule staminali ematopoietiche con cui le cellule cancro interagiscono. La cultura delle calvarias in vitro non può simulare la fisiopatologia completa. Inoltre, quando si tratta di metastasi ossee, le cellule del cancro al seno raramente metastazzano alla calvaria, e tendono a favorire le ossa con un rimodellamento osseo più attivo, come le vertebre, l'anca o le ossa lunghe delle braccia e delle gambe. Inoltre, la cocultura delle emi-calvarias con le cellule tumorali rappresenta solo gli ultimi passi della cascata metastatica: la colonizzazione dell'osso e la crescita delle metastasi. Inoltre, il numero di campioni è limitato dal numero di cuccioli per cucciolata. Si raccomanda di utilizzare una lettiera per esperimento e di non mescolare le cucciolate per evitare variazioni all'interno dei risultati. Abbiamo ottenuto risultati simili nel rimodellamento osseo quando si utilizzacal calvarias da topi BALB/c o FVB, ma se il ceppo influisce sulla risposta temporale del rimodellamento osseo in questo test rimane da determinare.
I principali vantaggi del modello calvariale ex vivo rispetto ai modelli in vivo includono costi inferiori, semplicità del test e tempi sperimentali più brevi per ottenere una risposta di rimodellamento osseo. La cocultura delle cellule tumorali e calvarias permette di studiare le interazioni dipendenti dal contatto cellulare e l'effetto di fattori secreti sul rimodellamento osseo, mentre l'uso di supporti condizionati consente di concentrarsi sull'effetto di fattori solubili. Inoltre, il modello a contatto diretto può facilitare la caratterizzazione delle interazioni intercellulari e dei meccanismi molecolari della microambiente della metastasi ossea, nonché lo studio e la valutazione di nuovi farmaci per il trattamento delle complicanze scheletriche delle neoplasie.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Mario Nomura, M.D. e Rodolfo Daaz per il loro aiuto con l'istologia, e Pierrick Fournier, Ph.D. per i suoi preziosi commenti per migliorare la qualità della carta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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