Summary
כאן, אנו מדגימים תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופרת משלוח (משופר) של וקטורים ויראלי לתוך קליפת המוח כגישה יעילה ומפושטת להשגת ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים במוחו של מקוק.
Abstract
בפרימטים שאינם אנושיים (NHP) אלקטרואופטיקה, הדבקת אזורים קורטיקליים גדולים עם וקטורים ויראליות היא לעתים קרובות משימה קשה זמן רב. כאן, אנו מדגימים את השימוש של תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופר משלוח (למעלה) של אלקטרואופטיקה וקטורים ויראלי לתוך המגע הראשוני (S1) ו מנוע (M1) ממדקים של קופי לקבל יעיל, ביטוי קליפת המין הנרחב של ערוצי יונים רגישים לאור. Adeno-הקשורים ויראלי (aav) וקטורים קידוד האדום העביר אופסין C1V1 התמזגו חלבון פלורסנט צהוב (eyfp) הוזרקו לתוך קליפת התוכי רזוס ques תחת MR-מונחה על. שלושה חודשים פוסט אינפוזיה, הדמיה אפיפלורנטית אישר אזורים גדולים של ביטוי אלקטרואופטיקה (> 130 מ"מ2) ב M1 ו S1 בשני מקופי. יתר על כן, הצלחנו להקליט אמין אור מעורר התגובות האלקטרופיזיולוגיה מאזורי הביטוי באמצעות מיקרו-electrocorticographic מערכים. ניתוח היסטולוגית מאוחר יותר וכנגד העיתונאי חשף ביטוי אופגנטי נרחב וצפוף ב-M1 ו-S1 המתאימים להפצה המצוינת על ידי הדמיה אפיפלורנטית. טכניקה זו מאפשרת לנו להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בתוך תקופה קצרה יותר של זמן עם נזק מינימלי לעומת טכניקות מסורתיות והוא יכול להיות גישה אופטימלית עבור אלקטרואופטיקה משלוח נגיפי בעלי חיים גדולים כגון NHPs. גישה זו ממחישה פוטנציאל רב לתפעול ברמת הרשת של מעגלים עצביים עם ספציפיות לסוג התא במודלים של בעלי חיים הקרובים ביותר לבני אדם.
Introduction
אלקטרואופטיקה היא כלי רב עוצמה המאפשר מניפולציה של פעילות עצבית וחקר חיבורי הרשת במוח. יישום טכניקה זו בפרימטים לא אנושיים (NHPs) יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את ההבנה שלנו של חישוביות עצבית בקנה מידה גדול, קוגניציה והתנהגות במוח הפרימטים. למרות אלקטרואופטיקה יושמה בהצלחה nhps בשנים האחרונות1,2,3,4,5,6,7, אתגר כי פנים החוקרים משיג רמות גבוהות של ביטוי על פני אזורי מוח גדולים בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים גישה יעילה ופשוטה כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בקופי. טכניקה זו יש פוטנציאל גדול לשפר את המחקרים אלקטרואופטיקה הנוכחי בבעלי חיים אלה בשילוב עם הקלטת המדינה האמנות8,9 ו גירוי אופטי10 טכנולוגיות.
הסעה משופרת משלוח (למעלה) היא שיטה הוקמה של משלוח של סוכני תרופתי ומולקולות גדולות אחרות, כולל וקטורים ויראלי, למערכת העצבים המרכזית11,12,13. בעוד שיטות המסירה המקובלת כרוכות במספר חליטות של נפח נמוך מספר מפוזרים על פני אזורים קטנים במוח, משרד הרישוי יכול להשיג הפצה רחבה יותר ואפילו יותר של הסוכן עם פחות חליטות. זרימת נוזל בצובר מונחה לחץ (הסעה) במהלך האינפוזיה מאפשר התמרה נרחבת יותר ואחידה מופץ של רקמת היעד בעת אספקת וקטורים ויראלי עם לח. במחקרים שנעשו לאחרונה, הדגמנו את התמרה ואת הביטוי האופגנטי העוקב של אזורים גדולים של מנוע ראשי (M1) והסוחושי (S1) הקורמיתיים9 ו תלמוס14 באמצעות תהודה מגנטית (MR)-מונחה.
כאן, אנו מתווה את השימוש ב-, כדי להשיג ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים עם רק כמה זריקות קורטיקלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו מוסדיים טיפול בעלי חיים הוועדה השימוש (IACUC) והם תואמים את המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. ההליך הבא נעשה באמצעות שני רזוס קופי מבוגר הזכר של 8 ו 7 שנים של גיל, במשקל 17.5 ק"ג ו 16.5 ק"ג (קוף G ו-J קוף), בהתאמה.
הערה: השתמש בטכניקות התקן אספטי עבור כל ההליכים כירורגי.
1. הדמיה בסיסית
- הרגעה וצנרור החיה ושמירה על הרדמה כללית תחת isof, הריכוז השתנה בין 0 ל -5% לפי הצורך, תלוי בסימנים חיוניים כגון קצב הנשימה וקצב הלב. עקוב אחר טמפרטורת החיה, קצב הלב, רווית החמצן, תגובות אלקטרוקרדיוגרפיות, והלחץ החלקי בקצה השני של CO2 לכל אורך התהליך.
- הנח את החיה במסגרת סטריאוטקאית תואמת MR (עיין בטבלת החומרים) שבה היא תישאר לאורך כל התהליך. חבר את בעל החיים למכונת התאמה למחשב הנייד התואם ל-MR, והרכב אותו לסורק ה-MRI (3 T).
- לרכוש T1 סטנדרטי (להעיף זווית = 9 °, זמן חזרה/הד זמן = 668.6, מטריצה גודל = 192 x 192 x 80, עובי פרוסה = 1 מ"מ) ו T2 (להעיף זווית = 130 °, זמן חזרה/הד זמן = 52.5, גודל מטריצה = 256 x 256 x 45, עובי פרוסה = 1 מ"מ) האנטומיה התמונות MR כבסיס התייחסות ותכנון כירורגי.
- לשחזר את החיה מהרדמה ולהעביר אותו לאזור המגורים בעלי חיים.
- השתמש בתמונות T1 ו-T2 שנרכשו כדי לקבוע את המיקום של פתיחת הגולגולת. המיקום של פתיחת הגולגולת ניתן לקבוע בדיוק על ידי התאמת האזור הקליפת המוח של העניין MR עם אטלס המח מקוק (Paxinos, חואנג , פטרידה, טוגה 2 מהדורה). בנוסף, תמונות בסיסיות אלה יכולות לספק אומדן עבור מיקומי העירוי הנגיפי. אזורי העניין הקורטיקליים. הפגינו כאן הם M1 ו-S1
2. MR-השתלת הקאמרית התואמת
- הרגעה וצנרור החיה ושמירה על הרדמה כללית עם ניטור סטנדרטי הרדמה כמו ב 1.1.
- הנח את בעל החיים במסגרת הסטריאוטקאית התואמת ל-MR, בה הוא יישאר במהלך השרשה קאמרית ומשלוח וקטורי ויראלי. חברו את בעל החיים למכונת. התאמה למחשב הנייד של מר מיסטר
- צור חתך משונן כ 2 ס מ מקו האמצע עם אורך של כ 5 ס מ עם אזמל.
- הסירו את הרקמה הרכה הבסיסית מהגולגולת באמצעות מעליות (ראו טבלת חומרים).
- צור פיום גולגולת עגול (2.5 ס מ) כדי לכסות את התוואי המתוכנן מראש לזריקות באמצעות טרפין (ראו טבלת חומרים).
- הנמך את נקודת המרכוז של הטרפין מעבר לקצה הטרפין. צרו כניסה במרכז פתיחת הגולגולת המתוכננת בצורה מספקת בתוך הראש כדי לעגן את הטרפין באמצעות נקודת המרכוז הניתנת לכוונון של הטרפין. היזהרו כדי למנוע חדירה לחלוטין דרך עומק הגולגולת כמו זה יכול לגרום נזק לרקמות העצביות הבסיסית.
- מדי פעם מרוקן את האזור עם תמיסת מלח לפי הצורך כדי לשמור על לחות הרקמה במהלך פתיחת הגולגולת.
- ברגע שהמרכז נעשה, הנמך את הטרפין על הגולגולת וסובב את הטרפין בכיוון השעון ונגד כיוון השעון בזמן החלת לחץ כלפי מטה עד שמכסה העצם ניתן להסרה באמצעות מלקחיים. היזהרו להימנע מפגיעה ברקמה הבסיסית עם הטרפין.
- הפתיל תפר דק (גודל 6-0) דרך הדורא במרכז פתיחת הגולגולת והרימו את הדורה על ידי משיכת בעדינות את התפר ממשטח המוח היוצר אוהל במרכז פתיחת הגולגולת.
- לאחר מכן, נקב את השכבה בסמוך למרכז האוהל באמצעות מספריים אופטלמולוגיות משובחים כדי למנוע פגיעה במוח. לאחר מכן חותכים את הדורא מהמרכז עד לקצה הפיום וממשיכים לאורך הקצה בעזרת מספריים בעלי אופלית.
- הר הגלילי מותאם אישית (איור 1; ראה סעיף 4 לקבלת הוראות הפקה) לגולגולת על גבי פתיחת הגולגולת כדי לספק תמיכה בצינורית במהלך עירוי לח כגון העקמומיות של האוגן הקאמרית מיישרת טוב. עם העקמומיות של הגולגולת
- לאבטח את השתלים לגולגולת באמצעות ברגים פלסטיק ואקריליק שיניים או כמה ברגים טיטניום.
3. משלוח וקטורי נגיפי
- זמן קצר לאחר השתלת החדר תואם MR והכנסת צינורית הזרקה (איור 1A-B, איור משלים 1) לתוך החדר, למלא את הרשת עם תמיסת מלח (0.9% הנאל) להמחיש את מיקומי ההזרקה באמצעות תמונות אנטומיים MR ו ממלאים את החללים הקאמריים בג שנספג בלחות רטובה כדי לשמור על לחות המוח (איור 1F).
- מכסים את העור ואת הצילינדר עם כיסוי מיקרוביאלית סטרילי לשמור על עקרות של צילינדרים במהלך הובלה וחליטות מר. מניחים קפסולת ויטמין E כדי לסמן את החלק העליון של רשת ההזרקה לזיהוי חיובי.
- בעוד שהחיה נשארת מטוצרת, מנתק את הצינורית האנדוקנה ממעגל ההרדמה ומחבר אותו למכונת מחשב מותאמת מאוד לMR, ומשגר את החיה לסורק ה-MRI.
- רכישת תמונות T1 (זווית היפוך = 9 °, זמן חזרה/הד זמן = 668.6, גודל מטריצה = 192 x 192, עובי פרוסה = 1 מ"מ, 80 פרוסות) כדי לחשב את המרחק מראש רשת ההזרקה ואת משטח קליפת הדופן. הקפסולה ויטמין E הוא גלוי בבירור תמונות T1 ויש להשתמש בו כסמן עבור החלק העליון של רשת ההזרקה (איור 2A). השתמש בכלי הסרגל של תוכנת הדימות של MR כדי למדוד את המרחק בין החלק העליון של רשת ההזרקה לבין משטח קליפת האדמה.
- לרכוש תמונות T2 (זווית היפוך = 130 °, זמן חזרה/הד זמן = 52.5, גודל מטריצה = 256 x 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, 45 פרוסות) כדי לקבוע את מדריכי הצינורית האופטימליים עבור כל אתר המבוסס על אתר ייעודי של אינפוזיה (איור 2B-C). כפי שהוזכר קודם לכן, רשת הצינורית מלאה בתמיסת מלח, שהיא הטובה ביותר הנראית בתמונות T2. באמצעות תוכנת הדמיה MR, לגלול דרך מטוסי ילתית ו משונן למצוא את מיקום היעד של אינפוזיה.
- לאחר הפשרה וקטור ויראלי למשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, לערבב את וקטור ויראלי עם הסוכן הניגודיות MR gadoteridol (יחס של 250:1; 2mM Gd-DTPA, ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטה או מערבולת ערבוב.
הערה: הטכניקה המוצגת נבדקה עבור וקטורים AAV עם ביטוי הנהיגה CamKIIa מיזם של C1V1 התמזגו כדי EYFP (AAV 2.5-Camkiia-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 1012 מולקולות וירוס/mL; ראה טבלה של חומרים). - לטעון את הווירוס מעורב לתוך 0.2 mL לחץ גבוה העירוי צינורות (ראה טבלת חומרים).
- הקמת שדה סטרילי מחוץ לסורק MR להכנת קו העירוי הנגיפי.
- באמצעות צינורות העירוי בלחץ גבוה, לחבר קו הארכה ארוך (כ 3-5 מטרים, בהתאם למיקום של משאבת האינפוזיה ביחס MR נשא) למזרק תואם MR 3 מ ל ו הראשי עם תמיסת מלח.
- לחבר את הקצה המרוחק של קו השלוחה הארוכה אל הקצה החזיתי של הצינורות 0.2 mL IV טעון עם הווירוס ולצרף את הצינורית עמידים לריפלוקס עם טיפ 1 מ"מ צעד (איור 2D; ראה סעיף 5 לקבלת הוראות הפקה) עד הסוף של הרכבה עם מחבר קטטר סגנון התפס (ראה טבלת חומרים) (איור 2e).
- לבסוף, הגדר את המזרק במשאבה תואמת MR (ראה טבלת חומרים). הנח את בקר המשאבה בחדר הבקרה של הסורק כפי שהוא אינו תואם ל-MR.
- באמצעות התמונות האנטומיות בסיסית MR שהתקבלו לפני, בחר את מיקום רשת ההזרקה ועומק ההכנסה הדרושים כדי להגיע לאתר העירוי של היעד. סמן את עומק ההכנסה על הצינורית באמצעות קלטת סטרילית.
- התחילו את העירוי בקצב של 1 μL/min ומאמתים באופן חזותי את זרימת הנוזל בקו האינפוזיה על ידי התבוננות בפליטה של נוזלים מהצינורית.
- הכנס את הצינורית באופן ידני דרך רשת ההזרקה לעומק היעד תוך שמירה על הזרימה בקו העירוי, מאחר שפעולה זו תמנע מהרקמה המוחדרת לסתימת הצינורית במהלך ההכנסה.
- לרכוש מהר (2 דקות) פלאש T1 משוקלל תמונות (להעיף זווית = 30 °, זמן חזרה/הד זמן = 3.05, גודל מטריצה = 128 x 128, פרוסה עובי = 1 מ"מ, 64 פרוסות) עבור ניטור מקוון של עירוי וקטורי ויראלי.
- לאחר החדרת החוצה ~ 10 μL של וקטור כזה וירוס מספיק מוחדרת לזהות בסורק MR, להשיג תמונות MR כדי לוודא את המיקום הנכון צינורית כפי שניכר על ידי התפשטות נצפתה של הווירוס. אם העומק של הצינורית שנוספה שגויה, כוונן את העומק בהתאם או הוצא לאט את הצינורית ונסה שוב לבצע את ההוספה כמו ב-3.12.
- ניטור האינפוזיה באמצעות הדרכה של תמונות MR מקוונת (פלאש T1 משוקלל) ולהגדיל את קצב העירוי ל 5 μL/min על ידי 1 μL/min צעדים מדי כמה דקות (איור 3A).
- לאחר החדרת כ 40 μL של וקטור ויראלי, להתחיל להקטין את קצב האינפוזיה על ידי 1 μL/min שלבים ולעצור את האינפוזיה לאחר ~ 50 μL מוזרק ולהשאיר את הצינורית במקום 10 דקות.
- הסר את הצינורית באיטיות מהמוח ועבור למיקום הבא. חזור על שלבים 3.9 עד 3.19 עבור כל מיקום.
- לכסות את הצילינדר עם כיסוי סטרילי בסוף הזריקות, לפני הובלה בעלי חיים. ואז להעביר את החיה. לחדר הניתוח
- או לחקור את התא תואם MR ולסגור את החתך כירורגי על ידי החלפת כנף העצם ושריר על גבי ואת העור באמצעות טכניקות אספטי סטנדרטי או להחליף את החדר עם גליל טיטניום ודורה מלאכותי (ראה יזדדן-שאהורל ואח ' 20169) להקלטה עצבית ולגירוי.
4. הפקה קאמרית מותאמת לMR
- הרכיבו צינורית ניילון ברשת ההזרקה (איור 1A-B) בעיבוד שבבי לפי המידות שצוינו (איור משלים 1).
- 3D להדפיס את הצילינדר תואם MR מתוך יריעות אקרילוניטריל בוטריפן (ABS0 פלסטיק (איור 1C-E) (ראה קובץ משלים 1 – 3; ראה טבלת חומרים עבור מדפסת תלת-ממד וחומרים).
הערה: עיצוב אחד שומר על רשת הזרקת צינורית קבועה בתוך גליל תואם MR (איור 1C), בעוד אחרת מאפשר סיבוב של הרשת, הרחבת אזור ההזרקה (איור 1C-E). - הפתיל רשת הזרקת צינורית ולהקיש על החלל המקביל של התא תואם MR, כך ששתי החתיכות מוצג השחלה זהה.
הערה: ניתן להשתמש בכל סוג של השחלה בתנאי שלשני הרכיבים יש את אותו השרשור. - הכנס צינורית ניילון הזרקת הרשת על ידי לתוך החור הקיש של גליל תואם MR.
5. הפקת צינורית עמיד בפני הריפלוקס13
- לגזור צינורות סיליקה 30 ס מ עם 0.32 מ"מ מזהה ו 0.43 mm OD עבור צינורות סיליקה הפנימי (ראה טבלת חומרים) באמצעות להב תער.
- חותכים 7.5 ס מ ארוך ו 5 ס"מ-סיליקה אבובים עם מזהה 0.45 מ"מ ו 0.76 mm OD עבור צינורות סיליקה החיצוני (ראה טבלת חומרים).
- לדבוק את צינורות 7.5 ס מ החיצוני לצינורות הפנימי 30 ס מ עם ציאנואקריאקרילי כגון הצינור הפנימי מרחיב 1 מ"מ מעבר לצינור החיצוני, מה שהופך את הצעד עמידים לריפלוקס (איור 2D). כדי לוודא כי הציאנואקריאקרילי אינו נכנס לתוך הצינורות הפנימיים, מניחים את הציאנואקריאקרילי על החלק החיצוני של הצינורות הפנימיים הרחוקים מהצינורית.
- הדבק את הצינורות באורך 5 ס מ לקצה השני של אבובים הפנימי עבור מצורף בסגנון קלאמפ מחבר קטטר (ראה שלב 3.10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הסעה משופרת משלוח (לח) תחת הדרכה MRI
התפשטות של וקטור ויראלי היה מפוקח במהלך עירוי מתחת להדרכה של תמונות MR באינטרנט (איור 3A). במחקר זה, S1 ו M1 של שני קופים היו ממוקדות (איור 3B). אמצעי ההפצה התלת-ממדיים הוערכנו בניתוח שלאחר-הוק של תמונות MR (איור 3C) כפי שמתואר על ידי yazdan-שאהמוראד ואח '. 20169, מאשרת כיסוי של שטחים גדולים של קליפת המוח. חליטות M1 עבור קוף G נעשו ללא הדרכה MR עקב אילוצי זמן.
ואלידציה של הביטוי הנגיפי
הביטוי הגדול בקליפת האשך אושרה על ידי הדמיה אפיפלורנטית, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, וניתוח היסטולוגית כפי שמתואר על ידי יזידאן-שאהמוראד ואח '. 20169. אנו מנוטרים ביטוי אלקטרואופטיקה על ידי פני השטח הדמיה אפיפלואורסצנטית של כתב פלורסנט2,9 ומוערך יותר מ 130 מ"מ2 של הביטוי לאורך משטח קורטיקלית ב M1 ו S1 של שני מקופי מתוכי רק שלושה זריקות קורטיקלית.תשע,15 גירוי קל (488 ננומטר, 20 mW חשמל בקצה; ראה טבלה של חומרים) הניבו תגובות אלקטרופיסיולוגיים אמין באזורים ביטוי כפי שנמדד על ידי חצי שקוף מיקרו-electrocorticographic מערכים8,9 ,16 (איור 4).
ניתוח של תמונות MR הניב מוערך 233 mm3 ו 433 מ"מ3 של התפשטות וקטור M1 ו s1 של קוף J, בהתאמה, ו 317 mm3 ב s1 של הקוף G9. ביצעת ניתוחים היסטלוגיים על מקטעים טוריים מקוריתים ונצפו ביטוי האופגנטי בקנה מידה גדול סביב אתרי העירוי ב-M1 ו-S1 (איור 5C-I), עם מוערך 70-80% של תאים המבטאים את opsin. הביטוי שנצפה מהיסטולוגיה מיושר עם פיזור הביטויים המשוער מהדמיה אפיפלורנטית (איור 5A-D). אחת משתי החליטות שבוצעה מחוץ לסורק ה-MR בקוף G לא הצליחה, מניב ביטוי באזור המתאים (איור 5D). התפשטות מוערך של MR הדמיה היה לחלוטין בתוך הגבולות של האפיפלורסנט ואת האמצעים היסטלוגיים של התפשטות ויראלי (איור 5E-G). ניתן לייחס את התפשטות ההדמיה האפיפלורנטית מעבר להערכת ה-MR לדיפוזיה של חלקיקים ויראליים מעבר לאזור ההדמיות. יתר על כן, ההערכה היסטולוגית המורחבת מעבר הערכה אפיפלואורסצנטית עקב חוסר גישה אופטית מעבר לפתיחת הגולגולת. הפרטים של טכניקות אלה נכללים בעיתון הקודם שלנו9.
איור 1: רשת בעלת תאימות MR ו-צינורית הזרקת. (A, B) רשת הזרקת ניילון מעוצבת בהתאמה אישית. (ג) בצילינדר קבוע תואם MR. (D, E) סיבוב בצילינדר תואם MR. (ו) MR-צילינדר אינפוזיה תואם מיקום רשת קבוע. החיצים מצביעים על חללים המיועדים להתמלא בג הנספג במים רטובים ולשמור על פני השטח של המוח לחות למשך ההזרקה. (G) צינורית שנוספה ברשת. הדמות הזאת השתנתה מיזדדן-שאהורל ואח '. 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בסיס הדמיה MR ו-צינורית עמידים לריפלוקס. (A) T1-משוקלל תמונה של ויטמין E שהיה מחובר לראש רשת ההזרקה המאפשרת לנו למדוד את המרחק אל פני השטח של המוח (חץ לבן). (ב) התמונה משוקלל של המוח באמצעות T2 מסייעת לתכנן את מיקום ההזרקה מרשת הצינורית המלאה בתמיסת מלח. (ג) מר תמונה של תא האינפוזיה ורשת הצינורית ממולאת בתמיסת מלח. הקווים האורתוגונתיים מייצגים את המטוסים המשונן (הצהובים) והקורonal (הסגולים). (ד) תמונה של צינורית הזריקה עמידים לריפלוקס עם הצעד העמיד לריפלוקס (חץ שחור). (ה) קווי אינפוזיה. הדמות הזאת השתנתה מיזדדן-שאהורל ואח '. 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: MR. הדמיה במהלך אינפוזיה והפצה מוערך. (א) התפשטות של 50 μl של וקטור ויראלי בסעיפים ילתית של הקוף G עבור אתר זריקה אחד S1 (מוצג עם חץ ב B). (ב) סריקת פני השטח של ה-MRI מתחת לצילינדר עבור קופים G ו-J, בהתאמה. מיקומי העירוי של S1 מוצגים במיקום כחול, מיקומי M1 באדום. (ג) מר שחזור נפח של התפשטות וקטור ויראלי לאחר אינפוזיה משופרת. המוח מוצג באפור בהיר; אמצעי העירוי S1 ו-M1 מוצגים בכחול ואדום, בהתאמה. אין שחזור אחסון MR זמין עבור חליטות ה-M1 עבור קוף G מאז הם לא נעשו בסורק MR. הדמות הזאת השתנתה מיזדדן-שאהורל ואח '. 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. של פעילות מעורר האור מיקרו-electrocorticography (μECoG) הקלטות אירעו במהלך גירוי אופטי פעמו. עקבות ההקלטה היו מהאלקטרודה הקרובה ביותר לאתר הגירוי לדוגמאות של מיקומי הגירוי M1 (אדום) ו-S1 (ירוק). אזורים מוצללים סביב העקבות מייצגים שגיאה סטנדרטית על פני 25 מבחנים. הריבועים הכחולים על העקבות מראים את עיתוי הגירוי (1 אלפיות הראשונה). הקבוצה המלאה של צורות הגל הגירוי מופעלות עבור שני זוגות לדוגמה של הגירוי ואתרי ההקלטה מונחים על צורת גל ממוצע כפי שמוצג בצד שמאל של הפאנל. הדמות הזאת השתנתה מיזדדן-שאהורל ואח '. 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח היסטולוגית. (A) תמונה בסיסית ילתית MR בקוף (ב) התפשטות של סוכן הניגודיות לאחר העירוי של אותו הפרוסה מר ילתית כמו ב. (ג) סעיף הרקמה הקורילית מאותו אתר כמו ב ו-B; peroxidase צביעת משקפת ביטוי של הכתב EYFP. (ד) יישור טוב הוא הבחין בין האזור של ביטוי eyfp נמדד עם אפיפלאורררררהאור (אזורים ירוקים כהים) עם כתמים היסטולוגית (קווים ירוקים בהירים). אלה כוללים את האזור של התפשטות וקטור מוערך מתמונות MR (הקו הלבן); נקודות לבנות מציינות אתרי הזרקה, והאזור השחור כולו מייצג את האזור שנחשף על ידי פתיחת הגולגולת. שני אתרי ההזרקה השמאליים ביותר ממוקמים ב-M1, ושני האתרים הנכונים ביותר ממוקמים ב-S1. (ה) התמונה הגדלה נמוכה של סעיף ילתית מוכתם אנטי-gfp נוגדן מראה את ההיבט הרוחבי של מדיה ביטוי yfp בקליפת המגע של קוף J (אזורים 1, 2, 3). ראש החץ השחור מציין את מיקום מסלול הצינורית; הרקמה הסמוכה (מסגרת שחורה) מוצגת ב- F, בהגדלה גדולה יותר כדי להציג התפלגות למינארי של תאי yfp-חיוביים. (ו) אזורים מאוכלסים בצפיפות של תאים yfp-חיוביים ממוקמים בעיקר בשכבות II-III ו-V-VI, ומציגות גם מורפולוגיה טיפוסית של הפירמידה (התאים במסגרות לבנות מוגדלים עוד יותר בפאנלים (G-I). ראשי חץ לבנים על לוחות התחתון G-אני מצביע על התאים הטיפוסיים הפירמידה בשכבות II-III (ז); שכבה V (ח); ושכבה VI (I). קנה מידה של סרגלים = 2 מ"מ (E); 200 יקרומטר (נ); 100 יקרומטר (G-I). הדמות הזאת השתנתה מיזדדן-שאהורל ואח ' 20169 ויזידן-שאהמוראד ואח ' 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: רשת הזרקת צינורית לפני השחלה. האורך והקוטר של רשת ההזרקה הם 15.00 מ"מ ו 12.00 מ"מ, בהתאמה. תבנית רשת ההזרקה מורכבת מחורים בקוטר 0.8 מ"מ היוצרים שלושה עיגולים קונצנטריים (קוטר: 1.6, 3.2 ו-4.8 מ"מ) ברחבי מרכז הרשת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קבצים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתווה טכניקה אפשרית ויעילה להשגת ביטוי האופגנטי בקנה מידה גדול ב-NHP המוח העיקרי של התפקוד המוטורי וקליפת המנוע של MR-מונחה. השימוש MR-מונחה מציג יתרונות משמעותיים על שיטות מסורתיות של עירוי ויראלי במוח NHP. יתרון אחד כזה הוא היכולת להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים ובעלי חליטות פחות נדרשות. למשל, עם שיטות קונבנציונליות, זריקות מרובות של 1-2 μl של ביטוי תשואה וקטורית באזור בקוטר 2-3 מ"מ1,2,5,17. בעוד ניסיונות קודמים להשגת התפשטות וקטור בקנה מידה גדול הניבו כמויות של ביטויים של כ 10 מ"מ3 עם זריקות מרובות18, כאן אנו מציגים שיטה להשיג ביטוי מעל 200 mm3 עם רק כמה אינפוזיות . עירוי יחיד של 50 μL על-ידי מעלה יכול להשיג התפשטות וקטור עד 10 מ"מ מן האתר ההזרקה עבור כיסוי מלאה של האזור הקורטינטלית9 וסיקור מלא של אזורים קורטיקלית הקדמית עם התלמי14.
יתר על כן, זה הוכח כי שימוש לח יכול להשיג התפלגות הומוגנית יותר של סוכן מוזרק12,19,20,21,22, המוביל לרמות ביטוי אחיד סביב האתר של אינפוזיה וקטורית ויראלית, לעומת מיקרוזריקות מסורתיות. בניסויים שלנו מעסיקים, הבחנו ברמות ביטויים גבוהים ברמה גבוהה עם כ 70-80% מהנוירונים המבטאים את אופסין8,9 (איור 5). בניגוד לכך, זריקות קונבנציונליות מבוססות דיפוזיה מוצגים אזורים של ביטוי גבוה מרוכז ליד אתרי הזרקה עטוף על ידי היחלשות רמות הביטוי4,5,17. הצורך מופחתת עבור זריקות מרובות מספק אינפוזיה משופרת שיטה יעילה בזמן קבלת הבעה בקנה מידה גדול, הביטוי אלקטרואופטיקה אחיד. בשל מספר קטן יותר של זריקות ושיעורי אינפוזיה מהיר יותר, הצלחנו לתכנן ולהחדיר את הווקטור הנגיפי תחת הדרכתו של MRI. השימוש בתמונות מקוונות של MR מאפשר פילוח מדויק של חליטות וניטור התפשטות הווקטור הנגיפי במהלך העירוי. עם זאת, אם העומק ההתחלתי של הצינורית שנוספה שגויה, זה עשוי להניב ביטוי במיקומים בלתי רצויים כתוצאה הראשונית החדירים ~ 10 μL הצורך לזהות חזותית את העירוי באמצעות MR. לחילופין, מערכות ניווט נוירוניתוחי מסחריות ניצול סמנים fiducial יכול גם להיות מועסק במקום הדרכה MR. בנוסף, את העלויות של הדמיה מקוונת ניתן להקיף על ידי סימון העומק הרצוי של הכניסה על צינורית לפני ההוספה ויזואלית מאשרת העירוי המלא דרך קו העירוי, למרות הדיוק של מיקום הצינורית יהיה ופחת. עם זאת, כפי שניתן לראות על ידי זריקה מוצלחת M1 של קוף G (איור 5D), MR הדרכה יכול להיות קריטי להבטחת אינפוזיה מוצלחת.
מחקרים קודמים הפגינו בטיחות של חליטות מובחנות של חלקיקים שאינם ויראליות ונגיפי ללא פגיעה ברקמות שנצפו מחוץ לצינורית בדרכי וללא חסרים התנהגותיים9,11,12,13 ,14,15,20. כאן ובפרסומים הקודמים שלנו9,14 אנו מדווחים על תוצאות דומות בעקבות עירוי משופרת של וקטורים ויראגנטיים. בנוסף לא התנהגות הנצפים לאחר אינפוזיה, neun ו nissl9,14,15 צביעת חשף מוות של תאים עצביים ו gliosis היה מוגבל רק לצינורית בדרכי, כפי שדווח בשיטות מבוססות דיפוזיה5. , כדי למזער את הנזק מהצינורית. נוכל להקטין את קוטר הצינורית עם זאת, יש צורך בחקירה נוספת כדי להעריך את ההשפעה של צמצום גודל הצינורית על השגת שטחים גדולים של הבעה. יתר על כן, כי שיעורי אינפוזיה גבוהה יכול גם לגרום נזק לרקמות13, מומלץ לשמור על קצב אינפוזיה בתוך או מתחת 5 μl/min. לקבלת מידע מפורט יותר על הטכניקה משופרת נא לראות את הפרסום הקודם שלנו9.
השימוש מר מונחה על מנת להשיג אזורים רחבים של ביטוי אלקטרואופטיקה ממוקד בקליפת הפרימטים יכול להוביל לחקירות נוספות של דינמיקה במעגל רחב, הפלסטיות העצבית, קישוריות הרשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
להיקפית יש אינטרס פיננסי בחברת נוירולינק, חברה המפתחת טיפולים קליניים באמצעות גירוי מוחי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית למחקר בתר-דוקטורט (AY), הגנה מתקדמים מחקר פרויקטים הסוכנות (DARPA) התארגנות ופלסטיות כדי להאיץ שחזור פציעה (תיקון; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, ועל ידי המרכז לדימות מדעי המוח. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של יוניס קנדי רעד של בריאות הילד & התפתחות האדם של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס מספר K12HD073945, המרכז הלאומי לחקר הפרימטים של וושינגטון (WaNPCR, וסטנג p51 OD010425), ו המרכז למדעי המוח (CNT, מרכז המדע הלאומי לחקר הנדסת בסיס במסגרת גרנט EEC-1028725). אנו מודים לקאמילו דיאז-בוטיה, טים הנסון, ויקטור ח'אזייה, דניאל סילברסמית ', קארן ג'יי מקלאוד, ג'וליאנה, ובלייקלי אנדרוס על עזרתם בניסויים ובנאן טיאן, ג'יווי הוא, פיטר לדוצ'ניש, מישל מהריביז, וטוני האון לעזרה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al.
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
