Summary
Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l'espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.
Abstract
Nell'optogenetica dei primati non umani (NHP), infettare grandi aree corticali con vettori virali è spesso un compito difficile e dispendioso in termini di tempo. Qui, dimostriamo l'uso di risonanza magnetica (MR) convezione avanzata consegna (CED) di vettori virali optogenetici in cortici somatosensoriali primari (S1) e motori (M1) di macachi per ottenere un'espressione corticale efficiente e diffusa di canali ionici sensibili alla luce. I vettori virali associati ad adeno (AAV) che codificano l'opsin C1V1 con spostamento rosso sono stati iniettati nella corteccia dei macachi rhesus sotto il CED guidato dalla RM. Tre mesi dopo l'infusione, l'imaging epifluorescente ha confermato ampie regioni di espressione optogenetica (>130 mm2) in M1 e S1 in due macachi. Inoltre, siamo stati in grado di registrare risposte elettrofisiologiche affidabili evocate dalla luce dalle aree che esprimono utilizzando array microelettrocorticografici. L'analisi istologica successiva e l'immunostaining contro il reporter hanno rivelato un'espressione optogenetica diffusa e densa in M1 e S1 corrispondente alla distribuzione indicata dall'imaging epifluorescente. Questa tecnica ci permette di ottenere l'espressione su vaste aree della corteccia entro un periodo di tempo più breve con danni minimi rispetto alle tecniche tradizionali e può essere un approccio ottimale per la consegna virale optogenetica in animali di grandi dimensioni come gli NNP. Questo approccio dimostra un grande potenziale per la manipolazione a livello di rete dei circuiti neurali con specificità di tipo cellulare nei modelli animali evolutivamente vicini agli esseri umani.
Introduction
L'optogenetica è un potente strumento che consente la manipolazione dell'attività neurale e lo studio delle connessioni di rete nel cervello. L'implementazione di questa tecnica nei primati non umani (NHP) ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione del calcolo neurale su larga scala, cognizione, e il comportamento nel cervello dei primati. Sebbene l'optogenetica sia stata implementata con successo negli NFP negli ultimi anni1,2,3,4,5,6,7, una sfida che ricercatori faccia sta raggiungendo alti livelli di espressione in grandi aree del cervello in questi animali. Qui, stiamo fornendo un approccio efficiente e semplificato per raggiungere alti livelli di espressione optogenetica in vaste aree della corteccia nei macachi. Questa tecnica ha un grande potenziale per migliorare gli studi optogenetici attuali in questi animali in combinazione con la registrazione all'avanguardia8,9 e stimolazione ottica10 tecnologie.
La convezione avanzata Delivery (CED) è un metodo consolidato di consegna di agenti farmacologici e altre grandi molecole, tra cui vettori virali, al sistema nervoso centrale11,12,13. Mentre i metodi di consegna convenzionali comportano infusioni multiple a basso volume distribuite tra piccole regioni del cervello, il CED può ottenere una distribuzione più ampia e uniforme degli agenti con meno infusioni. La convezione (convezione) di fluido sfuso guidato dalla pressione durante l'infusione consente una trasduzione più ampia e uniforme del tessuto bersaglio quando si forniscono vettori virali con CED. In studi recenti, abbiamo dimostrato la trasduzione e la successiva espressione optogenetica di ampie aree del motore primario (M1) e somatosensoriale (S1) cortices9 e talamo14 utilizzando la risonanza magnetica (MR) guidato CED.
Qui, illustreremo l'uso del CED per ottenere l'espressione optogenetica in grandi aree corticali con solo poche iniezioni corticali.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dall'Università della California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La seguente procedura è stata eseguita utilizzando due macachi rhesus maschi adulti di 8 e 7 anni di età, del peso rispettivamente di 17,5 kg e 16,5 kg (scimmia G e scimmia J).
NOTA: utilizzare tecniche asestetiche standard per tutte le procedure chirurgiche.
1. Imaging di base
- Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale sotto isoflurane (la concentrazione è cambiata tra 0 e 5% in base alle esigenze, a seconda dei segni vitali come la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca). Monitorare la temperatura dell'animale, la frequenza cardiaca, la saturazione di ossigeno, le risposte elettrocardiografiche e la pressione parziale finale delle maree di CO2 durante tutta la procedura.
- Posizionare l'animale in un telaio stereotassico compatibile con MR (vedere la Tabella dei Materiali) in cui rimarrà per tutta la procedura. Collegare l'animale a una macchina portatile di isoflurane compatibile con MR e trasportarlo allo scanner MRI (3 T).
- Acquisire il T1 standard (angolo di rilancio - 9o, tempo di ripetizione/eco - 668,6, dimensione della matrice: 192 x 192 x 80, spessore della fetta , 1 mm) e T2 (angolo di rilancio : 130 , tempo di ripetizione/tempo di eco , 52,5, dimensione della matrice, 256 x 256 x 45, spessore della fetta e 1 mm di immagini MR anatomiche) come linea di base riferimento e per la pianificazione chirurgica.
- Recuperare l'animale dall'anestesia e trasportarlo nell'area di alloggiamento degli animali.
- Utilizzare le immagini T1 e T2 acquisite per determinare il posizionamento della craniotomia. La posizione della craniotomia può essere determinata con precisione abbinando l'area corticale di interesse da MR con l'atlante del cervello del macaco (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition). Inoltre, queste immagini di base possono fornire una stima per le posizioni dell'infusione virale. Le regioni corticali di interesse qui dimostrate sono M1 e S1.
2. Impianto camera compatibile con MR
- Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale con monitoraggio anestetico standard come in 1.1.
- Posizionare l'animale nel telaio stereotassico compatibile con MR in cui rimarrà durante l'impianto della camera e la consegna di vettori virali. Collegare l'animale a una macchina isoflurane compatibile con MR portatile.
- Creare un'incisione sagittale a circa 2 cm dalla linea mediana con una lunghezza di circa 5 cm con un bisturi.
- Rimuovere il tessuto molle sottostante dal cranio utilizzando ascensori (vedere Tabella dei materiali).
- Creare una craniotomia circolare (di2,5 cm di diametro) per coprire le traiettorie pre-pianificate per le iniezioni utilizzando una trefinene (vedere Tabella dei materiali).
- Abbassare il punto di centratura della trefra oltre il bordo della trefrina. Creare un'indentazione al centro della craniotomia pianificata sufficientemente profonda nel cranio per ancorare la trefrautilizzando utilizzando il punto di centratura regolabile della trefra. Prestare attenzione per evitare di penetrare completamente attraverso la profondità del cranio in quanto ciò potrebbe causare danni al tessuto neurale sottostante.
- Lavare periodicamente l'area con la salina in base alle esigenze per mantenere l'umidità dei tessuti per tutta la craniotomia.
- Una volta che il centro è stato fatto, abbassare la trephine sul cranio e ruotare la trefrade in senso orario e antiorario mentre si applica la pressione verso il basso fino a quando il tappo osseo può essere rimosso con pinze. Prestare attenzione per evitare di danneggiare il tessuto sottostante con la trephine.
- Infilare una sutura fine (taglia 6-0) attraverso la dura al centro della craniotomia e sollevare la dura tirando delicatamente la sutura dalla superficie del cervello creando una tenda al centro della craniotomia.
- Successivamente, forare la dura vicino al centro della tenda utilizzando forbici oftalmiche fini per evitare di danneggiare il cervello. Quindi tagliare la dura dal centro al bordo della craniotomia e continuare lungo il bordo con forbici opfaliche fini.
- Montare la camera cilindrica compatibile cED MR (Figura1; vedere la sezione 4 per le istruzioni di produzione) sul cranio sulla parte superiore della craniotomia per fornire supporto cannula durante l'infusione cED in modo tale che la curvatura della flangia della camera si allinea bene con la curvatura del cranio.
- Fissare gli impianti al cranio utilizzando viti di plastica e acrilico dentale o alcune viti in titanio.
3. Consegna vettoriale virale
- Subito dopo aver impiantato la camera compatibile con MR e inserito nella camera la griglia di iniezione della cannula (Figura1A-B, Figurasupplementare 1 ) , riempire la griglia con riempire le cavità della camera con gelatina asorbente sterile bagnato per mantenere l'umidità del cervello (Figura 1F).
- Coprire la pelle e il cilindro con un incisione antimicrobico sterile per mantenere la sterilità dei cilindri durante il trasporto e le infusioni di MR. Posizionare una capsula di vitamina E per contrassegnare la parte superiore della griglia di iniezione per l'identificazione positiva.
- Mentre l'animale rimane intubato, staccare il tubo endotracheale dal circuito di anestesia e riattaccarlo a una macchina isoflurane compatibile con MR portatile e trasportarlo allo scanner MRI.
- Acquisire immagini T1 (angolo di rilancio - 9o, tempo di ripetizione / eco - 668,6, dimensione della matrice - 192 x 192, spessore della fetta , 1 mm, 80 fette) per calcolare la distanza dalla parte superiore della griglia di iniezione e la superficie corticale. La capsula di vitamina E è chiaramente visibile nelle immagini T1 e deve essere utilizzata come marcatore per la parte superiore della griglia di iniezione (Figura 2A). Utilizzare lo strumento righello del software di imaging MR per misurare la distanza tra la parte superiore della griglia di iniezione e la superficie corticale.
- Acquisire immagini T2 (angolo di capovolgimento - 130 gradi, tempo di ripetizione/eco - 52,5, dimensione della matrice : 256 x 256, spessore della fetta : 1 mm, 45 fette) per determinare le guide cannula ottimali per ogni sito in base al sito mirato di infusione (Figura2B-C). Come accennato in precedenza, la griglia cannula è piena di salina che è meglio visibile nelle immagini T2. Utilizzando il software di imaging MR, scorrere i piani coronali e sagittali per trovare la posizione di destinazione dell'infusione.
- Dopo aver scongelato il vettore virale per alcune ore a temperatura ambiente, mescolare il vettore virale con l'agente di contrasto RM gadoteridol (Rapporto di 250:1; 2mM Gd-DTPA, vedi Tabella dei materiali) con pipetta o vortice miscelazione.
NOT: La tecnica presentata è stata testata per i vettori AAV con un'espressione di guida DiCKIIa di C1V1 fusa su EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titro: 2,5 x 1012 molecole di virus/mL; vedi Tabella dei materiali). - Caricare il virus misto in un tubo IV ad alta pressione da 0,2 ml (vedere Tabella dei materiali).
- Stabilire un campo sterile all'esterno dello scanner MR per preparare la linea di infusione virale.
- Utilizzando tubi IV ad alta pressione, collegare una lunga linea di estensione (circa 3-5 metri, a seconda della posizione della pompa di infusione rispetto al foro MR) ad una siringa DA 3 mL compatibile con MR e prime con salina.
- Collegare l'estremità distale della linea di estensione lunga all'estremità prossimale del tubo da 0,2 mL IV caricato con il virus e attaccare la cannula resistente al reflusso con una punta a gradini di 1 mm (Figura 2D; vedi sezione 5 per le istruzioni di produzione della cannula) all'estremità distale di questo assieme con un connettore catetere in stile morsetto (vedere Tabella dei materiali) ( Figura2E).
- Infine, impostare la siringa in una pompa compatibile con MR (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il controller della pompa nella sala di controllo dello scanner in quanto non è compatibile con MR.
- Utilizzando le immagini MR anatomiche di base ottenute in precedenza, selezionare la posizione della griglia di iniezione di cannula e la profondità di inserimento necessarie per raggiungere il sito di infusione bersaglio. Contrassegnare la profondità di inserimento sulla cannula utilizzando un nastro sterile.
- Iniziare l'infusione ad una velocità di 1 l/min e convalidare visivamente il flusso del fluido nella linea di infusione osservando l'espulsione del fluido dalla punta della cannula.
- Inserire manualmente la cannula attraverso la griglia di iniezione alla profondità di destinazione mantenendo il flusso nella linea di infusione, in quanto ciò impedirà al tessuto penetrato di intasare la cannula durante l'inserimento.
- Acquisire immagini ponderate T1 flash veloce (angolo di capovolgimento : 30 gradi, tempo di ripetizione/eco: 3,05, dimensione della matrice: 128 x 128, spessore della fetta, 1 mm, 64 fette) per il monitoraggio online dell'infusione di vettori virali.
- Dopo aver infuso 10 l del vettore in modo tale da un numero sufficiente di virus da rilevare nello scanner MR, ottenere immagini MR per verificare il corretto posizionamento della cannula come evidente dalla diffusione osservata del virus. Se la profondità della cannula inserita non è corretta, regolare la profondità di conseguenza o rimuovere lentamente la cannula e ritentare l'inserimento come in 3.12.
- Monitorare l'infusione tramite la guida di immagini MR online (flash T1 ponderata) e aumentare il tasso di infusione a 5 l/min di 1 l/min di passi ogni pochi minuti (Figura3A).
- Dopo aver infuso circa 40 l del vettore virale, iniziare a ridurre la velocità di infusione di 1 gradini luna/min e fermare l'infusione dopo 50 dollari e lasciare la cannula in posizione per 10 minuti.
- Rimuovere lentamente la cannula dal cervello e passare alla posizione successiva. Ripetere i passaggi da 3.9 a 3.19 per ogni posizione.
- Coprire il cilindro con un drappo sterile alla fine delle iniezioni, prima del trasporto degli animali. Quindi trasportare l'animale di nuovo alla sala operatoria.
- Espiantare la camera compatibile con MR e chiudere l'incisione chirurgica sostituendo il lembo osseo e il muscolo sovrastante e suturando la pelle utilizzando tecniche asettiche standard o sostituire la camera con un cilindro di titanio e dura artificiale (vedi Yazdan-Shahmorad et al. 20169) per la registrazione neurale e la stimolazione.
4. Produzione di camere compatibili con MR
- Fabbricare la griglia di iniezione di cannula in nylon (Figura 1A-B) mediante lavorazione in base alle dimensioni specificate (Figura supplementare 1).
- Stampa 3D del cilindro compatibile con MR in acrylonitrile butadiene titino (plastica ABS0 (Figura 1C-E) (vedere File supplementare 1–3; vedere Tabella dei materiali per stampante e materiali 3D).
NOT: Un progetto mantiene una griglia di iniezione di cannula fissa all'interno del cilindro compatibile con MR (Figura 1C), mentre un altro consente la rotazione della griglia, estendendo la regione di iniezione (Figura 1D-E). - Infilare la griglia di iniezione della cannula e toccare la cavità corrispondente della camera compatibile con MR in modo che entrambi i pezzi presentino lo stesso filettatura.
NOT: È possibile utilizzare qualsiasi tipo di filettatura, a condizione che entrambi i componenti abbiano lo stesso threading. - Inserire la griglia di iniezione di cannula in nylon avvitandonel foro del cilindro compatibile con MR.
5. Produzione Cannula resistente al reflusso13
- Tagliare un tubo di silice lungo 30 cm con ID 0,32 mm e 0,43 mm OD per il tubo di silice interno (vedi Tabella deimateriali) utilizzando una lama di rasoio.
- Tagliare un tubo di silice lungo 7,5 cm e 5 cm con ID 0,45 mm e 0,76 mm OD per il tubo di silice esterno (vedere Tabella dei materiali).
- Aderisci al tubo esterno di 7,5 cm al tubo interno di 30 cm con il cianoacrylato in modo che la camera d'aria si estenda per 1 mm oltre il tubo esterno, rendendo il passo resistente al reflusso (Figura 2D). Per garantire che il cianoacrylato non entri all'interno del tubo interno, posizionare il cianoacrylato all'esterno del tubo interno lontano dalla punta della cannula.
- Incollare il tubo di silice lungo 5 cm all'altra estremità del tubo interno per l'attacco al connettore catetere in stile morsetto (vedere il passaggio 3.10).
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Representative Results
Convezione Enhanced Delivery (CED) sotto MRI Guidance
La diffusione del vettore virale è stata monitorata durante l'infusione di CED sotto la guida delle immagini MR online (Figura 3A). In questo studio, S1 e M1 di due scimmie sono stati presi di mira (Figura 3B). I volumi di distribuzione tridimensionali sono stati stimati in un'analisi post-hoc delle immagini MR (Figura 3C) come descritto da Yazdan-Shahmorad et al. 20169, confermando la copertura di ampie aree della corteccia. Le infusioni di M1 per la scimmia G sono state effettuate senza guida MR a causa di vincoli di tempo.
Convalida dell'espressione virale
Grande espressione optogenetica corticale è stata confermata da imaging epifluorescente, registrazioni elettrofisiologiche e analisi istologiche come descritto da Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Abbiamo monitorato l'espressione optogenetica mediante l'imaging dell'epiorescenza superficiale del reporter fluorescente2,9 e abbiamo stimato più di 130 mm2 di espressione lungo la superficie corticale in M1 e S1 di due macachi solo da tre iniezioni corticali9,15. La stimolazione della luce (488 nm, potenza di 20 mW sulla punta; vedi Tabella deimateriali) ha prodotto risposte elettrofisiologiche affidabili nelle aree di espressione misurate da array micro-elettrocorticografici semi-trasparenti8,9 ,16 (Figura 4).
L'analisi delle immagini MR ha prodotto circa 233 mm3 e 433 mm3 di diffusione vettoriale in M1 e S1 della scimmia J, rispettivamente, e 317 mm3 in S1 della scimmia G9. Abbiamo eseguito analisi istologiche su sezioni coronali seriali e osservato espressione optogenetica su larga scala intorno ai siti di infusione in M1 e S1 (Figura 5C-I), con una stima del 70-80% delle cellule che esprimono l'opsina. L'espressione osservata dall'istologia allineata con la distribuzione stimata dell'espressione dall'imaging epifluorescente (Figura 5A-D). Una delle due infusioni eseguite al di fuori dello scanner MR nella scimmia G non ha avuto successo, senza produrre alcuna espressione nella regione corrispondente (Figura 5D). Lo spread stimato dalla risonanza magnetica era completamente entro i limiti delle misure epifluorescenti e istologiche della diffusione virale (Figura 5E-G). L'espansione dell'imaging epifluorescente oltre la stima MR può essere attribuita alla diffusione di particelle virali oltre la regione di immersione. Inoltre, la stima istologica si estendeva oltre la stima dell'epiorescenza a causa della mancanza di accesso ottico oltre la craniotomia. I dettagli di queste tecniche sono inclusi nel nostro precedente articolo9.
Figura 1: cilindro compatibile con MR e griglia di iniezione della cannula. (A, B) griglia di iniezione in nylon su misura. (C) Cilindro fisso compatibile con MR. (D,E) Cilindro compatibile con MR. (F) Cilindro di infusione compatibile con MR con posizione griglia fissa. Le frecce indicano le cavità che sono progettate per essere riempite con gelatina asorbente sterile bagnato mantenendo la superficie del cervello umida per tutta la durata dell'iniezione. (G) Cannula inserita nella griglia. Questa cifra è stata modificata da Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging MR di base e cannula resistente al reflusso. (A) Immagine ponderata T1 di vitamina E che è stata attaccata alla parte superiore della griglia di iniezione che ci permette di misurare la distanza dalla superficie del cervello (freccia bianca). (B) Immagine ponderata T2 del cervello aiuta a pianificare la posizione di iniezione dalla griglia cannula riempita con salina. (C) Immagine MR della camera di infusione e della griglia cannula piena di salina. Le linee ortogonali rappresentano i piani sagittale (giallo) e coronale (viola). (D) Foto della punta di cannula ad iniezione resistente al reflusso con il passo resistente al reflusso (freccia nera). (E) Linee di infusione. Questa cifra è stata modificata da Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rm durante l'infusione e la distribuzione stimata. (A) Diffusione di 50 l del vettore virale nelle sezioni coronali della scimmia G per un sito di iniezione in S1 (mostrato con una freccia in B). (B) Rendering della superficie RM della superficie corticale sotto il cilindro per le scimmie G e J, rispettivamente. Le posizioni di infusione S1 sono visualizzate in blu, ovvero M1 in rosso. (C) MR Ricostruzione volume della diffusione del vettore virale dopo l'infusione di CED. Il cervello è mostrato in grigio chiaro; I volumi di infusione S1 e M1 sono mostrati rispettivamente in blu e in rosso. Non è disponibile alcuna ricostruzione del volume MR per le infusioni di M1 per la scimmia G poiché non sono state eseguite nello scanner MR. Questa cifra è stata modificata da Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Registrazioni elettrofisiologiche di attività rivocanti dalla luce. Durante la stimolazione ottica con microelettrografia si sono verificate registrazioni di microelettrografia. Le tracce di registrazione sono state dall'elettrodo più vicino al sito di stimolazione per esempi di posizioni di stimolazione M1 (rosso) e S1 (verde). Le aree ombreggiate intorno alle tracce rappresentano un errore standard in 25 prove. I quadrati blu sulle tracce mostrano la tempistica della stimolazione (1 ms). Il set completo di forme d'onda attivate dallo stimolo per entrambe le coppie campione di siti di stimolazione e registrazione è sovrapposto alla forma d'onda media, come mostrato sul lato sinistro del pannello. Questa cifra è stata modificata da Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi istologica. (A) Immagine coronale di riferimento MR nella scimmia G. (B) Diffusione dell'agente di contrasto dopo l'infusione per la stessa fetta coronale MR come in A. ( (C) Una sezione di tessuto coronale approssimativamente lo stesso sito come in A e B; la colorazione perossidasi riflette l'espressione del eYFP-reporter. (D) Si osserva un buon allineamento tra l'area di espressione EYFP misurata con epiflourescenza superficiale (aree verdi scure) e con colorazione istologica (linee verdi chiare). Questi includono la regione di diffusione vettoriale stimata dalle immagini MR (linea bianca); punti bianchi indicano i siti di iniezione, e l'intera regione nera rappresenta l'area esposta dalla craniotomia. I due siti di iniezione più a sinistra si trovano in M1, e i due siti a destra la maggior parte dei siti si trovano in S1. (E) Immagine a basso ingrandimento della sezione coronale macchiata con anticorpi anti-GFP che mostrano l'aspetto medio-laterale dell'espressione YFP nella corteccia somatosensoriale della scimmia J (aree 1, 2, 3). La punta della freccia nera indica la posizione della traccia cannula; il tessuto adiacente (telaio nero) è mostrato in F, con maggiore ingrandimento per mostrare la distribuzione laminare delle cellule YFP-positive. (F) Le regioni densamente popolate di cellule YFP-positive si trovano prevalentemente negli strati II-III e V-VI, e mostrano anche la tipica morfologia piramidale (le cellule in cornici bianche sono ulteriormente ingrandite nei pannelli (G-I). Le punte di freccia bianche sui pannelli inferiori G-I puntano alle tipiche celle piramidali nei livelli II-III (G); strato V (H); e lo strato VI (I). Barre della scala : 2 mm (E); 200 m (F); 100 m (G-I). Questa cifra è stata modificata da Yazdan-Shahmorad et al. 20169 e Yazdan-Shahmorad et al. 201815. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Figura 1: La griglia di iniezione di cannula prima del filetto. La lunghezza e il diametro della griglia di iniezione sono rispettivamente 15,00 mm e 12,00 mm. Il modello della griglia di iniezione è costituito da fori di diametro di 0,8 mm che formano tre cerchi concentrici (diametro: 1,6, 3,2 e 4,8 mm) intorno al centro della griglia. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementari. Fare clic qui per scaricare questi file.
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Discussion
Qui, descriviamo una tecnica fattibile ed efficiente per ottenere espressione optogenetica su larga scala nella corteccia somatosensoriale e motoria di NHP da CED guidata da MR. L'uso del CED a guida MR presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali di infusione virale nel cervello NHP. Uno di questi vantaggi è la capacità di raggiungere l'espressione su grandi aree con meno infusioni richieste. Ad esempio, con i metodi convenzionali, iniezioni multiple di 1-2 L dell'espressione di rendimento vettoriale in una regione di diametro di 2-3 mm1,2,5,17. Mentre i precedenti tentativi di raggiungere la diffusione vettoriale su larga scala hanno prodotto volumi di espressione di circa 10 mm3 con iniezioni multiple18, qui presentiamo un metodo per ottenere espressione superiore a 200 mm3 con solo poche infusioni . Una singola infusione di 50 -L by CED può ottenere la diffusione vettoriale fino a 10 mm dal sito di iniezione per il CED corticale9 e la copertura completa delle aree corticali frontali con CED talamico14.
Inoltre, è stato dimostrato che l'utilizzo del CED può ottenere una distribuzione più omogenea dell'agente iniettato12,19,20,21,22, portando a livelli di espressione uniformi intorno al sito di infusione vettoriale virale, rispetto alle microiniezioni tradizionali. Nei nostri esperimenti che impiegano CED, abbiamo osservato livelli di espressione uniformemente elevati con circa il 70-80% dei neuroni che esprimono l'opsin8,9 ( Figura5). Al contrario, le iniezioni convenzionali basate sulla diffusione presentano regioni di alta espressione concentrate vicino asiti di iniezione avvolti indebolendo i livelli di espressione4,5,17. La ridotta necessità di iniezioni multiple rende l'infusione di CED un metodo efficiente in termini di tempo per ottenere un'espressione optogenetica uniforme su larga scala. A causa del minor numero di iniezioni e dei tassi di infusione più rapidi, siamo stati in grado di pianificare e infondere il vettore virale sotto la guida della risonanza magnetica. L'uso di immagini MR online consente di indirizzare con precisione le infusioni e il monitoraggio della diffusione del vettore virale durante l'infusione. Tuttavia, se la profondità iniziale della cannula inserita non è corretta, ciò può produrre espressione in posizioni indesiderate a causa dell'infuso iniziale di 10 dollari per rilevare visivamente l'infusione tramite MR. In alternativa, sistemi di navigazione neurochirurgica commerciale utilizzando i marcatori fiduciari può essere impiegato anche al posto della guida MR. Inoltre, i costi dell'imaging online possono essere aggirati contrassegnando la profondità desiderata di inserimento sulla cannula prima dell'inserimento e confermando visivamente l'infusione completa attraverso la linea di infusione, anche se l'accuratezza del posizionamento della cannula sarebbe ridotto. Tuttavia, come visto dall'iniezione non riuscita in M1 della scimmia G (Figura5D),la guida MR può essere fondamentale per garantire un'infusione di successo.
Studi precedenti hanno dimostrato la sicurezza delle infusioni di CED di particelle non virali e virali senza danni ai tessuti osservati al di fuori del tratto di cannula e senza deficit comportamentali9,11,12,13 ,14,15,20. Qui e nelle nostre pubblicazioni precedenti9,14 riportiamo risultati simili dopo l'infusione di CED di vettori virali optogenetici. Oltre a nessun deficit comportamentale osservato dopo l'infusione, NeuN e Nissl9,14,15 colorazione rivelato la morte delle cellule neuronali e gliosi era limitata solo al tratto cannula, come è stato riportato con metodi basati sulla diffusione5. Per ridurre al minimo i danni dalla pista di cannula, possiamo potenzialmente ridurre il diametro della cannula. Tuttavia, sono necessarie ulteriori indagini per valutare l'effetto della riduzione delle dimensioni della cannula sul raggiungimento di ampie aree di espressione. Inoltre, poiché alti tassi di infusione possono anche portare a danni ai tessuti13, si raccomanda di mantenere un tasso di infusione a o al di sotto di 5 l/min. Per informazioni più dettagliate sulla tecnica CED si prega di consultare la nostra precedente pubblicazione9.
L'uso del CED a guida MR per raggiungere ampie regioni di espressione optogenetica mirata nella corteccia dei primati può portare a ulteriori indagini sulla dinamica dei circuiti su larga scala, sulla plasticità neurale e sulla connettività di rete.
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Disclosures
PNS ha interesse finanziario in Neuralink Corp., una società che sta sviluppando terapie cliniche utilizzando la stimolazione cerebrale.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (AY), dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dalla Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e dall'UCSF Neuroscience Imaging Center. Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development dei National Institutes of Health sotto il premio Numero K12HD073945, il Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e il Center for Neurotechnology (CNT, un National Science Foundation Engineering Research Center sotto Grant EEC-1028725). Ringraziamo Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews per il loro aiuto con gli esperimenti e Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun per l'aiuto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
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