HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계
Summary
CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.
Abstract
CCCTC-바인딩 요소 (CTCF)-안정적인 도메인 토폴로지가 연결 (TADs) TADs 이웃에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에 중요 한 역할을 할 중재. CTCF 배아 발달, 신체 모방, 조, 및 leukemogenesis 제어 하는 HOX 유전자의 공간 및 시간 표현 조절에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 그것은 크게 알 수 없는 남아 여부와 HOX loci 관련 CTCF 경계 chromatin 조직과 HOX 유전자 발현을 조절 하는 방법. 현재 프로토콜에서 HOXA/B/C/D loci에서 모든 CTCF 바인딩 사이트를 타겟팅 하는 특정 sgRNA 풀링된 라이브러리 생성 CTCF 관련 chromatin 경계 태 드 형성과 HOX 유전자에 방해의 효과 검사 하 식입니다. CRISPR-Cas9를 통해 유전자 검사, HOXA7/HOXA9 유전자 (CBS7/9) 사이 위치한 CTCF 바인딩 사이트 종양 chromatin 도메인으로 소성 HOX 유전자를 유지 하기 위한 중요 하 고 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. MLL 재배열 급성 골수성 백혈병 (AML)에 식 패턴. 따라서,이 sgRNA 접근 차단 특정 유전자 loci에서 중재 CTCF 게놈 조직에 새로운 통찰력을 제공 도서관과 또한 두 코딩 주석된 유전 규제 요소 기능 특성에 대 한 기초를 제공 하 고 noncoding 포스트 인간 게놈 프로젝트 시대에 정상적인 생물학 과정.
Introduction
최근 게놈 상호 작용 연구 밝혀 인간의 핵 게놈 형태 토폴로지가 연결 도메인 (TADs) 세포 유형 및 종 보존을 안정. 별도 도메인으로 게놈의 조직 촉진 하 고 규제 요소 (예: 강화 및 발기인) 간의 상호 작용을 제한. CCCTC-바인딩 요소 (CTCF) 태 드 경계 한다 이웃 TADs1에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에서 중요 한 역할을 한다. 그러나, 게놈 넓은 CTCF 바인딩 데이터 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 비록 자주 작동 하는지 다른 제안에 한 셀만 특정 사이트에서 chromatin 장벽으로 밝혀 그 CTCF 기능 함께 chromatin 경계2의 형성에 다른 활동. 알 수 없는 남아 여부 경계 요소 (CTCF 바인딩 사이트) 직접 CTCF의 생물학 기능에 연결 되 고 이러한 링크 발생 하는 방법 이다. 따라서, 우리는 게놈에 특정 CTCF 바인딩 사이트 직접 TADs의 형성을 조절 및 이러한 도메인 내에서 또는 이웃 도메인 간에 발기인/증강 상호 작용을 제어 가설. 인간과 마우스 게놈 시퀀싱 프로젝트 후속 epigenetic 분석 완료 게놈의 새로운 분자 및 유전 서명을 발견 했습니다. 그러나, 유전자 규칙 및 세포질 기능을, 뿐만 아니라 그들의 분자 따라 장치를 마더보드에, 특정 서명/수정 역할은 아직 완전히 이해 될.
증거의 여러 줄 CTCF 중재 TADs 기능 chromatin 도메인3,4,5대표 지원 합니다. 비록 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 게놈 넓은 CTCF 칩 seq 데이터 CTCF 종종 다른2에 한 셀만 chromatin 장벽 기능 공개 했다. CTCF 게놈 조직4,,67중재 하 여 개발 시 필수적인 역할을 재생 합니다. CTCF 경계의 증강/발기인 상호 작용, 유전자 발현, 발달 방해로 이어지는 손상. 이것은 CTCF TADs 중재 구조 구성 요소 뿐만 아니라 적절 한 증강 행동과 유전자 전사5,,89에 필요한 규정 단위는.
HOX 유전자는 배아 개발 하는 동안 중요 한 역할을 재생 하 고 그들은 일시적으로 그리고 공간 제한 됩니다 그들의 표현 패턴. HOXA 소재 시 두 안정 TADs CTCF 관련 경계 요소 hESCs 및 IMR90 셀1에 의해 앞쪽 및 후부 유전자를 분리 형성 한다. 최근 보고서는 HoxBlinc, HoxB 관련 된 로커 스 lncRNA 중재 CTCF 형성 시연 TADs와 HOXB 소재 시 상호 작용 증강/발기인 감독. 이것은 ESC 헌신과 차별화10중 앞쪽에 HOXB 유전자 활성화. 또한, 특정 유전자 loci HOXA 소재 시를 포함 하 여에 CTCF의 변경 태 드 도메인 변경 계보 특정 유전자 표현 프로필을 중재 하 고 질병 상태11,12의 개발과 관련 된 했다. 증거는 CTCF 유전자 전사를 조정 하 고 기능 도메인으로 게놈을 구성 하 여 셀 정체성 결정에 대 한 기본 기능을 지원 합니다.
조, 중 배아 개발에서의 역할에도 불구 하 고 HOX 유전자 조절 조 혈 줄기와 조상 세포 (HS/PC) 기능. 이것은 확산 및 감 별 법10,13,,1415사이의 균형을 제어 하 여 이루어집니다. HOX 유전자의 표현 사양과 HS에 가장 높은 표정으로 조 혈 모 세포의 분화를 통해 긴밀 하 게 규제 / pc HOX 유전자 발현의 최저 수준으로 성숙 하는 동안 점차 감소 조 혈 모 세포16차별에서 발생. HOX 유전자 dysregulation leukemic 전이17,18선도 HS/Pc의 dysregulating 자체 갱신 및 차별화 속성으로 leukemic 전이의 지배적인 메커니즘입니다. 그러나, 구축 및 유지 관리 관련된 규제 네트워크 HOX 유전자의 종양 식 패턴 대 정상의 기계 장치는 불분명 남아 있습니다.
CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리 심사 잘으로 비-코딩 유전자, lncRNA20 와 미르21 종 등으로 단백질 코딩 유전자19 가 널리 사용 되었습니다. 그러나, 새로운 게놈 목표를 식별 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리를 사용 하는 비용 때문에 높은 처리량 게놈 시퀀싱은 종종 sgRNA 라이브러리 심사 확인, 높은 남아 있습니다. 우리의 sgRNA 시스템 심사 특정 게놈 loci에 집중 하 고 HOXA9같은 마커 유전자 발현에 따라 1 단계 RT-PCR을 통해 대상 sgRNAs를 평가. 또한, 생어 시퀀싱 게놈, 및 Indel 돌연변이에 sgRNA 통합 되었다 확인 사이트를 대상으로 sgRNA를 식별 하기 위해 검색할 수 있습니다. Loci 특정 CRISPR Cas9 유전자 검사를 통해 CBS7/9 chromatin 경계 종양 chromatin 도메인을 설정 하 고 급성 골수성 백혈병의 병 인에서 소성 HOX 유전자 표현 패턴 유지를 위한 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. 12. 메서드 CTCF 경계 배아 개발, 조, leukemogenesis, 뿐만 아니라 CTCF 경계에서의 특정 기능 뿐만 아니라 미래의 후 치료에 대 한 잠재적인 치료 대상으로 식별에 널리 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. CTCF sgRNALibrary 온라인 도구를 사용 하 여 디자인
- 유전 섭 동 (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) 플랫폼 (GPP) 디자이너 도구를 사용 하 여 인간 HOX loci에서 CTCF 바인딩 사이트를 대상으로 sgRNA 디자인.
- 1070 sgRNAs sgRNAs 303 무작위 대상 유전자, 60 긍정적인 컨트롤, 500 인간 대상으로 컨트롤 및 207 CTCF 요소 또는 lncRNA 유전자 (그림 1, 표 1)을 대상으로 대상으로 구성 된 총 음성 합성. 각 대상 DNA 요소 5-10 다른 sgRNAs 대상 이다.
2. sgRNA 라이브러리 복제
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CRISPR 백본 lentiviral 벡터 (lentiCRISPRv2)에 합성된 oligonucleotides 클론.
- LentiCRISPRv2 벡터 2 h 37 ° C에서 BsmBI 제한 효소로 다이제스트.
- 큰 밴드의 존재에 대 한 보고 (약 12,873 bp)에 BsmBI 소화 후 젤 젤 추출 키트와 함께 그것을 정화 하 고.
참고: 2 kb 작은 필러 조각, 소화 후 젤에도 있지만이 무시 됩니다. - 위하여 합성된 oligonucleotides 및 150 LentiCRISPR 벡터 소화의 ng LentiCRISPR DNA, 1 µ L 10 µ M oligos, 10 x T4 리가 버퍼의 2 µ L, T4 리가의 1 µ L의 소화 그리고 다음 품 어 그들 16 ° C에서 하룻밤.
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확대를 위한 전기 유능한 세포에 lentiviral CRISPR/sgRNA 라이브러리 변환.
- 1.8에는 electroporator을 준비 kV, 200 Ω와 25 µ F. 미리 복구 SOC 미디어 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 그리고 사전 37 ° c.에 파운드 암 피 실린 항생제 접시를 따뜻하게
- 유능한 세포 10 분 동안 얼음에 녹여
- 1.5 mL 마이크로 원심 튜브와 1mm electroporation 큐 벳 얼음에 준비 합니다.
- 10 ng / µ L 도서관 플라스 미드 DNA 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 유능한 세포의 25 µ L로의 1 µ L를 혼합 하 고 수동으로 튜브의 하단에 몇 번을 터치 하 여 부드럽게 혼합.
- 베트 충분히 추워요, 일단 그것에 DNA/유능한 세포 혼합물을 옮기십시오. 싱크대에 두 번 누르고 조직 종이 베트의 외관에서 어떤 물방울을 닦아. 다음은 멧 electroporation 모듈에 놓고 펄스를 누릅니다.
- 37 ° C 미리 따뜻하게 SOC 미디어의 975 µ L을 추가 하는 즉시. 아래로 pipetting 15 mL 튜브에 의해 혼합.
- 회전 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 100 µ L 셀 SOC 미디어의 900 µ L로 희석 하 고 파운드 암 피 실린 항생제 한 접시에 100 µ L를 놓습니다. 37 ° c.에서 밤새 품 어
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제조업체의 프로토콜에 설명된대로 맥시 준비 열을 사용 하 여 결합 된 식민지에서 플라스 미드 DNA를 추출 합니다.
- 파운드 한 천 배지에서 모든 식민지를 긁어 파운드 암 피 실린 항생제 매체의 2 mL의 스타터 문화를 접종 하 고 활기찬 동요 (~ 200 x g) 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 초보 문화 1: 500 파운드 암 피 실린 매체의 100 mL로 희석 하 고 활기찬 동요 (~ 200 x g)와 12-16 h 37 ° C에서 품 어.
- 4 ° c.에 15 분 동안 6000 x g 에서 원심 분리에 의해 세균성 세포 pellet을 수확
- 다시 서 스 펜 션 버퍼의 10 mL에서 세균 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 세포의 용 해 버퍼의 10 mL와 함께 일시 중단 된 펠 릿을 lyse 하 고 적극적으로 반전 4-6 시간. 실 온에서 5 분 동안 lysate를 품 어.
- 냉장된 중립화 버퍼의 10 mL와 lysate 무력화. 부드럽게 반전 튜브 4-6 시간으로 혼합 하 고 얼음에 20 분 동안 품 어.
- 4 ° c.에 30 분 동안 13500 x g 에서 스핀 다운 신속 하 게 새로운 튜브에 플라스 미드 DNA를 포함 하는 상쾌한 전송.
- 2.3.7, 단계를 반복 하 고 신속 하 게 새로운 튜브에 플라스 미드 DNA를 포함 하는 상쾌한 전송.
- 재래식 버퍼의 10 mL를 적용 하 여 열을 equilibrate 고 중력 흐름에 의해 빈을 열 수 있습니다.
- 열에는 상쾌한을 추가 하 고 중력 흐름에 의해 수 지를 입력할 수 있도록.
- 워시 버퍼 세척 2 x 30 mL로 열.
- 차입 버퍼의 15 mL와 함께 DNA elute
- 실 온 소 프로 파 놀 eluted dna의 10.5 mL와 DNA를 침전. 믹스 및 스핀 15000 x g 4 ° C에서 30 분 동안에 즉시 아래로 부드럽게는 상쾌한을 가만히 따르다.
- 70% 에탄올, 10 분 15000 x g 에서 원심 분리기 DNA 펠 릿의 5 mL와 함께 DNA 펠 릿을 세척 하 고 맑은 상쾌한 삭제.
- 2.5.14 두 번 더 반복 합니다.
- 10 분 동안 15000 x g 에서 펠 릿 DNA를 원심 고 부드럽게는 상쾌한 DNA 펠 렛을 방해 하지 않고 가만히 따르다.
- 5-10 분, 펠 릿 건조 하 고 필요한 양의 버퍼 (TE 버퍼, pH 8.0)에서 DNA를 분해.
3. 높은 Titer sgRNA 라이브러리 Lentivirus 세대
- 준비 셀: 문화 HEK293T 세포에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% (vol/vol) 페니실린-스 (PS) 항생제 T-25 플라스 크에 보충. 37 ° C, 5% CO2배양 기에 넣어.
- Lentivirus 패키지: 공동 transfect 2 패키지 플라스 미드 (psPAX2)의 15 µ g과 10 µ g 바이러스를 수확 하기 전에 48 h에 대 한 봉투 플라스 미드 (pMD2.G)의 단계에서 순화 된 라이브러리 벡터의 20 µ g HEK293T 셀.
- 바이러스 컬렉션: 후 48 h, collectthe 바이러스 표면에 뜨는 0.45 μ m 낮은 단백질 바인딩 PVDF 멤브레인 통해 표면에 뜨는 바이러스 필터링.
- 바이러스 농도: lentiviral 상쾌한 50-fold 집중 장치를 사용 하 여 집중 하 고 5 단계에서 바이러스 나 테스트.
- 바이러스 저장소: 약 수는 집중 된 바이러스 및 저장소-80 ° C 냉동 고에.
4. 최적화 된 Puromycin 농도
- 백혈병 세포 배양: 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 T-125 플라스 크에서 페니실린-스 (PS) 항생제 x 1 보충 RPMI 1640 문화 MOLM13 AML 셀. 37 ° C, 5% CO2배양 기에 넣어.
참고: 세포는 일반적으로 모든 4-5 d 70 %confluency 보다는 더 많은 분할 비율 1:4 또는 1:6, 도달 하는 세포를 허용 하지에 전달 됩니다. - 잘 (2.0 x 104 셀) 당 2 mL의 총 볼륨에서 104 셀/mL, x 1.0의 밀도와 12-잘 접시의 MOLM13 세포를 설정 합니다.
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시간-과정 분석 결과: 치료 MOLM13 셀 puromycin 증가 농도 (0.1 µ g/mL, 0.2 µ g/mL, 0.5 µ g/mL, 1.0 µ g/mL와 2.0 µ g/mL)에 7 일을
- 하루 0에 puromycin 치료 없이 MOLM13 세포를 설정 하 컨트롤로 puromycin 치료 없이 3 복제 우물을 하루 0에서에서 7 일을 합니다.
- 3 복제 우물을 포함 하는 각 실험 조건으로 0.1 µ g/mL, 0.2 µ g/mL, 0.5 µ g/mL, 1.0 µ g/mL, 2.0 µ g/mL, MOLM13 셀을 별도로 취급 합니다.
- 라이브 셀 비율을 계산 하 고 하루 7 포함 된 모든 조건에 0에서 생존 곡선.
- 생존 곡선: Trypan 파랑 및 수 생존 매일 생존 곡선 각 puromycin 농도 가진 셀을 얼룩.
- 최소한의 puromycin 농도 최적화: Trypan 푸른 얼룩 통해 최소 puromycin 농도 모든 MOLM13에 세포 5-7 일 사이 사망 확인.
5. 적정 Lentiviral 도서관 MOLM13 백혈병 세포에서의
- 급성 골수성 백혈병 세포 준비: MOLM13 AML 셀 변환 매체와 수집 (RPMI 1640, 10 %FBS, 1 %PS 및 8.0 µ g/mL 코팅 매체) 1.5 x 10의 밀도에서6 셀 /mL.
- MOLM13 셀에 각 잘 106 셀 x 1.5 12-잘 접시에 놓습니다.
- lentivirus 녹여:-80 ° C 냉동 고에서 집중된 lentivirus를 제거 하 고 얼음에 녹여.
- 0, 1, 2.5, 5를 포함 하 여 별도 우물에 집중된 lentivirus의 다른 복용량 믹스 MOLM13 셀 7.5, 10 µ L (총 6 그룹).
- 즉시 1000 x g 33 ° C에서 2 시간에이 혼합물을 원심 고 12-잘 접시를 다시 4 h에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 전송.
- 4 h 후 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g 에 감염 된 세포를 스핀.
- 부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음 다시 신선한 미디어 (RPMI 1640, 10 %FBS 1 %PS) transduced 셀을 일시 중단 및 다음 T-25 플라스 크를 전송 고 puromycin 없이 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 48 h 후 2 플라스 크 (2 그룹)에 이러한 셀을 분할: 1 µ g/mL puromycin 5 일 동안 치료 하는 실험적인 그룹 그리고 puromycin 5 일에 대 한 치료를 하지 않고 제어 그룹.
- 모든 비 불리고 제어 셀 죽 었 때까지 4 단계에 따라 1 µ g/mL puromycin 5 일 동안 puromycin 선택 수행 합니다. 신선한 미디어 2 일 마다 교환입니다.
- 라이브 셀 puromycin puromycin 치료 없이 세포의 수와 처리 수를 나누어 변환에 대 한 최적화 된 MOI 값을 측정 합니다.
6. 풀링된 CRISPR-Cas9 코 라이브러리의 변환
- Lentivirus와 변환: 1.5 x 106 MOLM13 셀 중간에 sgRNA 풀링된 lentivirus의 0.3 나 감염 (RPMI 1640, 10 %FBS, 1 %PS, 및 8 µ g/mL 코팅 매체) 6 잘 플레이트에 lentivirus 감염 없이 셀을 사용 하 여 컨트롤.
- 즉시 원심에서 spinfect에 33 ° C에서 2 시간에 대 한 1000 x g 6 잘 플레이트 세포 고 4 h 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 플레이트를 전송.
- 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g 에 감염 된 세포를 스핀.
- 부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 발음 다시 신선한 미디어 (RPMI 1640, 10 %FBS 1 %PS) transduced 셀을 일시 중단 및 다음 T-25 플라스 크를 전송 고 puromycin 없이 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 48 h 후 5 일 동안 1 µ g/mL puromycin 셀을 취급 합니다. 2 일 후 신선한 미디어에 대 한 교환 하 고 최적의 세포 조밀도에 계속.
- 희석 방법 제한 96 잘 접시에 단일 클론 씨 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 이러한 단일 클론을 품 어. 3-4 주 동안 그들을 문화.
- 단일 셀에 인구 성장, 후 puromycin 선택 추가 문화에 대 한 24-잘 접시로 셀의 절반을 전송 하 고 단계에서 이러한 클론을 확인 합니다. 셀의 나머지를 유지.
7. 심사 단계 실시간 정량 Pcr는 풀링된 CRISPR-Cas9 코 도서관
- 1 단계 역전사 연쇄 반응 (단계 RT-정량)와 마커 유전자 HOXA9 의 식을 계산 하 여 심사 하는 sgRNA 통합된 복제의 효과 결정 합니다.
참고: HOXA9 높은 leukemogenesis22,23MOLM13 AML 셀에 표시 됩니다. - 수는 sgRNA MOLM13 셀 및 전송 1 x 104 셀 당 96 잘 PCR 접시에 잘 통합.
- 5 분, 1000 x g 에서 튜브 원심 그리고 철저 하 게 제거 하 고 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 한 피펫으로와 상쾌한 삭제.
- 125 µ L의 PBS 버퍼에 포함 된 셀을 세척 하 고 원심 1000 x g 5 분에 관. 다음는 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 120 µ L을 제거 하 고 각 잘에서 PBS의 약 5 µ L을 유지.
- 각 잘을 포함 하는 세포 세포의 용 해 버퍼, 가수분해 K 솔루션 (10 mg/mL)의 1 µ L DNase 솔루션 (1 mg/mL)의 1 µ L의 48 µ L 셀 세포 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다. 다음 셀 펠 릿을 다시 중단 5 번 위아래로 피펫으로.
- 37 ° C에서 5 분 뒤 실 온에서 10 분 동안 혼합 품 어 그리고 다음 75 ° C 5 분.
- -80 ° C 냉장고에 세포 lysate를 저장 합니다.
- 1 단계 실시간 정량 Pcr 반응의 준비: 해빙 단계 반응 혼합 및 다른 반응 구성 요소 4 ° c 다음 스핀 아래로 짧게 아래쪽 튜브의 솔루션을 수집 하 여 빛 없이 얼음에. 혼합 하 고 부드럽게 회전.
- 표식 유전자의 앞으로 뇌관의 1 µ L를 포함 하 여 실시간 정량 Pcr 반응 혼합으로 PCR 웰 스에 세포 lysate의 1 µ L를 추가 (300 nM) 및 뇌관 역 (300 nM), 0.125 µ L의 역전사 (10 U / µ L), 및 1 단계 반응 혼합 (2 배)의 5 µ L.
- 광학 투명 필름, 그리고 부드럽게 소용돌이 우물을 밀봉 하 고 혼합 반응 구성 요소.
- 실시간 PCR 장비에서 PCR 96 잘 접시를 놓습니다.
- 중 합 효소 비활성화와 95 ° c.에 1 분 동안 DNA 변성 50 ° C에서 10 분 동안 반전 녹음 방송 반응 실행
- PCR 반응의 40 주기 함께 RT-PCR을 수행: 15 변성 s 95 ° C, 어 닐 링/확장 및 플레이트 형광 20에 대 한 읽기에서 60 ° C, 그리고 2-5 s/단계에서 0.5 ° C 증가 통해 65-95 ° C에서 용융 곡선 분석 s.
- 설정 upregulated downregulated, HOXA9 유전자의 표현 수준에 따라 변경 그룹이 비교 하 여 컨트롤은 별도로. Β-말라 유전자를 사용 하 여 내부 관리 유전자 제어로.
8. 통합된 sgRNAs 유전형과 생어 시퀀스를 통해 긍정적인 클론의 확인
- 생어 통해 HOXA9 감소 식 클론 확인 시퀀싱 하 고 50-100 ng MOLM13 게놈 DNA, 5 µ L 중 합 효소 반응 버퍼 (10 배), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M)으로 PCR을 수행 (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)와 1 µ L 역 뇌관 (10 µ M) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µ L dNTP (10 m m), 중 합 효소 1 단위 (5 U /µL). 30 94 ° C에서 초기 변성으로 PCR 반응을 수행 s, 그리고 다음 더 변성 20 94 ° C에서 20 위한 56 ° C에서 어 닐 링 s s, 20 68 ° C에서 확장 s (총 30 주기), 10 분 동안 68 ° C에서 최종 확장 다음 4 ° c.에서 개최
- 추출 하 고 PCR 정화 키트 PCR 제품 (크기 285 bp)를 정화.
- 2 µ L T4 결 찰 버퍼 (10 배), 50 ng T 벡터 DNA T 벡터에 순화 된 PCR 제품 선 (50 ng / µ L), 25 ng 정화 PCR DNA (285 bp), 1 µ L T4 리가 (3 단위 / µ L), 그리고 장소는 결 찰 16 ° C에 인큐베이터에 하룻밤 사이 혼합.
- 결 찰 믹스 DH5α 유능한 셀으로 전송, 파운드 암 피 실린 항생제 한 접시에 성장 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 파운드 플레이트에서 단일 클론을 선택 하 고 유전형과 생어에 의해 확인 연속.
9. sgRNAs Nuclease 소화 분석 결과 의해 유도 Indel 변이의 탐지
- SgRNA 통합된 단일 클론 유도 Indel 요금 nuclease 테스트 분석 결과 의해 감지.
- 별도로 50-100 ng Indel 돌연변이 (테스트)와 PCR 템플릿으로 야생-타입 (WT, 참조) DNA PCR amplicons 준비 5 µ L 중 합 효소 반응 버퍼 (10 배), 1 µ L dNTP (10 m m), 중 합 효소 1 단위 (5 U / µ L), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M) (5′-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3′), 그리고 1 μ L 역 뇌관 (10 µ M) (5′-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3′). PCR 반응 초기 변성에 대 한 30, 98 ° C에 그리고 20 98 ° C에서 변성으로 수행한 20 56 ° C에서 어 닐 링 s s, 확장 30 s (총 30 주기), 72 ° C에서 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 4 ° c.에서 개최
- 200 heteroduplex 혼합 그룹 설정 “참조” (20 ng / µ L) 및 200 ng ng 0.2 mL PCR 튜브에 “테스트” (20 ng / µ L) PCR amplicons만 400 homoduplex 혼합 그룹의 “참조” PCR amplicons 컨트롤의 ng.
- 별도로 가득 물 800 mL 및 다음 anneal heteroduplex 또는 homoduplexes를 형성 하는 실내 온도를 점차적으로 진정 1 리터 비 커에 5 분 동안 95 ° C에서 heteroduplex 및 homoduplex 혼합물을 품 어.
- 1 µ L indel 돌연변이 탐지 nuclease (2.5 U / µ L)와 2 µ L nuclease 반응 버퍼 (10 배) 60 분 동안 42 ° C에서 단련 된 heteroduplex 및 homoduplex 혼합물의 별도로 다이제스트 400 ng.
- Agarose 젤 전기 이동 법으로 소화 샘플을 분석, 작은 조각 (70-250 bp), 및 homoduplex DNA에 heteroduplex 혼합물 DNA를 절단 한다 (320 bp) 절단 한다.
Representative Results
Discussion
단백질 코딩 유전자 관련 sgRNA 라이브러리 유전자와 sgRNA 농축24,,2526 통해 특정 세포 기능을 통제 하는 네트워크를 식별 하는 기능 심사 시스템에 적용 된 ,2728. 여러 비 코딩 영역 sgRNA 라이브러리 또한 표시 했다 유전자 특정 기능 화면 원심 및 인접 요소, BCL11A, 약물 저항, Tdgf1a 등 규제 관련 유전자28, 규제 29,30. 이러한 sgRNA 라이브러리 모두 자세한 생물 정보학에 의해 생성 된 디자인, oligonucleotide 종합 및 하위 oligonucleotide 기능과 벡터에 클로닝. 전체 게놈 넓은 검사 방법은 매우 강력 하 고 유용 하지만 게놈 넓은 sgRNA 디자인 및 비싼 합성;에 대 한 일관 된 자금에 대 한 전산 전문 지식이 필요로 따라서, 그것은 여전히 대부분 실험실에 대 한 도전입니다. 그러나, 접근 차단 loci 특정 sgRNA 도서관은 편리 하 고 효율적인 CTCF 바인딩 사이트 chromatin 조직과 transcriptional 규칙 (그림 1 에 관련 된 특정 DNA 요소를 식별 하 그리고 그림 2). CTCF 경계를 대상으로 우리 sgRNA 대상 클론 특정 마커 유전자, HOXA9의 식 수준에 따라 평가를 원스텝 RT-PCR을 적용. 또한 우리가 수행 생어 시퀀싱 이러한 긍정적인 통합된 sgRNAs 클론 (그림 2 및 그림 4)을 확인 하. 기능을 확인 하려면 이러한 긍정적인 sgRNAs 클론을 대상으로, 우리는 sgRNA 대상 사이트 삽입 또는 삭제 돌연변이 (그림 5) 유도 여부를 결정 하기 위해 PCR 기반 유전형 및 돌연변이 탐지 분석 결과 실행. 이 우리가 특정 비 코딩 DNA 요소 대상 포유류 세포에 있는 그들의 생물학 기능을 평가 하는 유망한 방법을 제공 합니다.
우리의 프로토콜에 우리가 언급 특정 oligonucleotide 디자인 더 효율적인 하위 lentiCRIPSRV2 벡터에 클로닝 보장을 더 안정적으로 정확한 sgRNA 라이브러리 생성 (단계 1-2). 높은 titer sgRNA 라이브러리 lentivirus를 얻으려면 lentiviral 상쾌한 50-fold 다음 프로토콜 (3 단계), 그리고 여러 aliquots (3.1-3.5 단계)에서-80 ° C 냉동 고에 저장 된 집중 장치를 사용 하 여 집중 해야 합니다. 추가적인 관심사는 변환에 대 한 최적의 MOI 값을 찾아내고 있다. 나 너무 낮은 경우에, 감염 된 세포의 수가 감소 하 고 sgRNA 실패를 차단으로 이어질. 나 너무 높은 경우, 단일 셀에 하나 이상의 sgRNA을 통합 하는 것입니다 그리고 그것은 원스텝 RT-PCR 및 Indel 돌연변이 검출을 통해 상영 sgRNA 라이브러리에 방해가 됩니다. 따라서, 심사 하기 전에 중요 한 단계는 이다 lentiviral 라이브러리의 적정을 통해 셀의 각 그룹에 대 한 최적의 나를 찾는. MOLM13 백혈병 세포에 lentiviral 라이브러리의 적정 및 평가 나의 프로토콜 (단계 5.1-5.10)에 실시 됩니다. 또한, 반전 녹음 방송에 대 한 셀의 철저 한 lysing 성공적인 단계 RT-PCR을 보장할 수 있습니다. 이 프로토콜 (단계 7.5-7.6) 모든 온도 단계에서 세포에 대 한 보육 시간을 증가 하 여 수행할 수 있습니다. 따라서 풀링된 CRISPR Cas9 코 라이브러리, 철저 한 셀의 심사에 대 한 효율적인 강화 하기 위하여 세포 및 반전 녹음 방송 단계 실시간 정량 Pcr (7.1-7.14 단계) 결정에 중요 한 역할을 재생 합니다. 또한, PCR 제품의 질을 증가 보장할 수 성공적인 indel 돌연변이 탐지, 낮은 품질 PCR 제품 (9.1-.6 단계) heteroduplex/homoduplex 생성 프로세스에 영향을 미칠 것입니다 때문에.
또한, CTCF 초기 배아 발달에 탈 HOX 유전자 서명으로 특정 백혈병 HOX 유전자 규칙에 있는 역할을 식별 하는 메서드를 사용할 수 있습니다. 예, HOX 유전자는 배아 개발 하는 동안 중요 한 역할을 재생 하 고 HOX gens의 모든 4 개의 클러스터는 일시적으로 그리고 공간 배아 발달에 그들의 표현 패턴에 제한. 또한, NPM1 돌연변이 AML과 AML 환자 정상 cytogenetic karyotype31의 30%에 대 한 계정에 가장 일반적인 유전 이상이 중입니다. AML의이 부분 집합은 탈 선 HOXA 및 HOXB 유전자 서명, leukemic 전이17의 지배적인 기계 장치가 되는 전시 한다. HOX 유전자의 leukemogenesis 동안 어떻게 정상적인 개발 및 dysregulated에 통제 되는지 명료 하 게 중요 하다. 우리와 다른 사람으로 나타났습니다 CTCF HOX loci9,12chromatin 조직 및 유전자 녹음 방송에 필수적인 역할을 합니다. 따라서, HOX loci 집중 sgRNA 라이브러리 심사 HOX 유전자 규칙 개발 및 조 혈 악성 종양 중에서 CTCF 바인딩 사이트의 특정 기능을 얽히게 하는 편리한 수단을 제공 합니다. 그러나, 접근의 제한은 높은 처리량 차세대 시퀀싱에 대 한 유용한 마커를 찾는의 어려움입니다. 미래 연구 목표 중 하나는 매우 선택적인 마커를 찾아서 마커의 효과 보려면 게놈 넓은 다음 세대 시퀀싱을 수행 될 것입니다. 따라서, 연구 계획 특정 형광 마커 태그 유전자를 사용 하 여 추적 기자는 중요 한 도구를 미래에 될 것 이다.
강화는 발기인 기능과 유전자 표현의 규제에 다양 한 중요 한 역할을 재생합니다. 그러나, 그것은 또한 위치와 방향을 독립적인 방식으로, 장거리에서 발기인 활동을 활성화할 수 있습니다 그리고 강화는 종종 횡단 방향에 유전자 발현 조절. 따라서, 그것은 특히 포스트 게놈 시대에에서 특정 한 유전자에 대 한 enhancer(s)를 정확 하 게 도전 이다. 전통적인 기자 분석 실험 및 상호 기능 분석 (예를 들어, chromatin immunoprecipitation 및 DNaseI 지나치게 분석 실험) 증강 기능32,33검사 사용 되었습니다. 마찬가지로, 작은 축소 로커 스 집중 상영 했다 특정 유전자34원심 및 인접 규제 요소 활동을 찾아보기에 적용 된다. 최근, HOX 유전자 loci에서 비 코딩 규정 요소를 성공적으로 대상 풀링된 sgRNA-코 라이브러리 전략 HOTTIP lncRNA로 서 HOXA7 와 HOXA9 유전자 사이 위치한 CTCF 바인딩 사이트 확인 그것은 후부 HOXA chromatin 도메인 조직, 급성 골수성 백혈병 (AML)12에 소성 HOXA 유전자 발현을 드라이브를 제어 하기 위한 중요 한 이다. 이러한 학문 풀링된 sgRNA-코 라이브러리 검사는 또한 확인 하 고 현장에서 우리의 게놈에 비 코딩 요소의 생물 학적 기능을 평가 하는 강력한 유전학 접근 방식을 설명 했다.
CTCF, chromatin 절연체 단백질으로는 중요 한 역할 게놈 조직에 특정 세포 유형11,35chromatin 이웃 특정 유전자 표현 패턴을 정의 하 여. 토폴로지가 관련된 도메인 (TAD) 구조 변경 결과 질병 상태5,11에 증강/발기인 상호 작용을 변경 합니다. CTCF 높은 metazoan에 보존 하 고 태 드 경계에 농축입니다. 그러나, 그것은 불분명 남아 여부 및 방법을 CTCF chromatin 경계 구조와 태 드 형성 유지에 기여 하 고 있습니다. CTCF 경계 부를 식별 하는 강력한 방법을 고 태 드 도메인으로 증강/발기인 상호 작용 및 내 전사 정의 증명 풀링된 CTCF sgRNA 녹아웃 라이브러리 심사 4 HOX loci에 집중 했다, 비록 태 드 도메인12. 또한,이 방법은 lncRNA 요소 및 염색 질 구조와 HOX loci의 접근성 활동을 중재 하는 녹음 방송 요인 식별에 효율적으로 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 CTCF 칩 seq에 따르면 다음 차세대 시퀀싱 식별 통해 게놈 넓은 CTCF 사이트를 포함 하는 CRISPR/sgRNA 라이브러리를 탐험 하려고 및 ChIA 애완 동물 데이터 미래에 연구. 따라서,이 전략은 전체 염색체 또는 심지어 전체 게놈을 확장할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO<sub>2</sub> Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
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