CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
CCCTC-바인딩 요소 (CTCF)-안정적인 도메인 토폴로지가 연결 (TADs) TADs 이웃에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에 중요 한 역할을 할 중재. CTCF 배아 발달, 신체 모방, 조, 및 leukemogenesis 제어 하는 HOX 유전자의 공간 및 시간 표현 조절에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 그것은 크게 알 수 없는 남아 여부와 HOX loci 관련 CTCF 경계 chromatin 조직과 HOX 유전자 발현을 조절 하는 방법. 현재 프로토콜에서 HOXA/B/C/D loci에서 모든 CTCF 바인딩 사이트를 타겟팅 하는 특정 sgRNA 풀링된 라이브러리 생성 CTCF 관련 chromatin 경계 태 드 형성과 HOX 유전자에 방해의 효과 검사 하 식입니다. CRISPR-Cas9를 통해 유전자 검사, HOXA7/HOXA9 유전자 (CBS7/9) 사이 위치한 CTCF 바인딩 사이트 종양 chromatin 도메인으로 소성 HOX 유전자를 유지 하기 위한 중요 하 고 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. MLL 재배열 급성 골수성 백혈병 (AML)에 식 패턴. 따라서,이 sgRNA 접근 차단 특정 유전자 loci에서 중재 CTCF 게놈 조직에 새로운 통찰력을 제공 도서관과 또한 두 코딩 주석된 유전 규제 요소 기능 특성에 대 한 기초를 제공 하 고 noncoding 포스트 인간 게놈 프로젝트 시대에 정상적인 생물학 과정.
서론
최근 게놈 상호 작용 연구 밝혀 인간의 핵 게놈 형태 토폴로지가 연결 도메인 (TADs) 세포 유형 및 종 보존을 안정. 별도 도메인으로 게놈의 조직 촉진 하 고 규제 요소 (예: 강화 및 발기인) 간의 상호 작용을 제한. CCCTC-바인딩 요소 (CTCF) 태 드 경계 한다 이웃 TADs1에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에서 중요 한 역할을 한다. 그러나, 게놈 넓은 CTCF 바인딩 데이터 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 비록 자주 작동 하는지 다른 제안에 한 셀만 특정 사이트에서 chromatin 장벽으로 밝혀 그 CTCF 기능 함께 chromatin 경계2의 형성에 다른 활동. 알 수 없는 남아 여부 경계 요소 (CTCF 바인딩 사이트) 직접 CTCF의 생물학 기능에 연결 되 고 이러한 링크 발생 하는 방법 이다. 따라서, 우리는 게놈에 특정 CTCF 바인딩 사이트 직접 TADs의 형성을 조절 및 이러한 도메인 내에서 또는 이웃 도메인 간에 발기인/증강 상호 작용을 제어 가설. 인간과 마우스 게놈 시퀀싱 프로젝트 후속 epigenetic 분석 완료 게놈의 새로운 분자 및 유전 서명을 발견 했습니다. 그러나, 유전자 규칙 및 세포질 기능을, 뿐만 아니라 그들의....
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프로토콜
1. CTCF sgRNALibrary 온라인 도구를 사용 하 여 디자인
- 유전 섭 동 (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) 플랫폼 (GPP) 디자이너 도구를 사용 하 여 인간 HOX loci에서 CTCF 바인딩 사이트를 대상으로 sgRNA 디자인.
- 1070 sgRNAs sgRNAs 303 무작위 대상 유전자, 60 긍정적인 컨트롤, 500 인간 대상으로 컨트롤 및 207 CTCF 요소 또는 lncRNA 유전자 (그림 1, 표 1)을 대상으로 대상으로 구성 된 총 음성 합성. 각 대상 DNA 요소 5-10 다른 sgRNAs 대상 이다.
2. sgRNA 라이브러리 복제
-
CRISPR 백본 lentiviral 벡터 (lentiCRISPRv2)에 합성된 oligonucleotides 클론.
- LentiCRISPRv2 벡터 2 h 37 ° C에서 BsmBI 제한 효소로 다이제스트.
- 큰 밴드의 존재에 대 한 보고 (약 12,873 ....
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결과
CRISPR-Cas9 기술은 기능 게놈 연구를 위한 강력한 연구 도구입니다. 그것은 빠르게 편집 기술을 기존의 유전자를 대체 하 고 게놈 전체 및 개별 유전자 중심 애플리케이션 위한 높은 유틸리티 있다. 여기는 첫 번째 개별적으로 복제 loci 특정 CRISPR Cas9 짓고 sgRNA 라이브러리 포함 1070 sgRNAs sgRNAs 303 무작위 대상 유전자, 60 긍정적인 컨트롤, 500 인간 대상으로 컨트롤 및 207 CTCF 요소 또는 lncRNA를 대상으로 구성 된 (그림 1, 표 1) 4 HOX loci에서 유전자를 대상으로. 이 라이브러리는 모든 CTCF 코어 바인딩 모티프, HOX 유전자 관련 lncRNAs, 규제 요소, 그리고 여러 가지 HOX 유전자 HOX loci에 긍정적인 컨트롤 이라는 대상. 그것은 .......
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토론
단백질 코딩 유전자 관련 sgRNA 라이브러리 유전자와 sgRNA 농축24,,2526 통해 특정 세포 기능을 통제 하는 네트워크를 식별 하는 기능 심사 시스템에 적용 된 ,2728. 여러 비 코딩 영역 sgRNA 라이브러리 또한 표시 했다 유전자 특정 기능 화면 원심 및 인접 요소, BCL11A, 약물 저항, Tdgf1a 등 규제 관련 유전자28, 규제 29,30. 이러한 sgRNA 라이브러리 모두 자세한 생물 정보학에 의해 생성 된 디자인.......
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공개 사항
우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.
감사의 글
또한 저자는 원고를 편집 하기 위해 니콜라스 Cesari를 감사 합니다. 작품은 건강의 국립 연구소 (상훈, R01DK110108, R01CA204044)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 3000 시약 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | 라이프 테크놀로지 | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 리가제 | 뉴잉글랜드 바이오랩& | nbsp; M0202S | |
| QIAquick 젤 추출 키트 | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR 정제 키트 | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® 그린 원스텝 키트 | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN 플라스미드 맥시 키트 | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco' s 수정된 독수리 미디엄 | 써모 피셔 사이언티픽 | ||
| RPMI 1640 | 써모 피셔 사이언티픽 | 11875093 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 | 라이프 테크놀로지 | ||
| Lenti-X 집중 장치 | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 제네시 사이언티픽 | 25-507 | |
| TAE 버퍼 | 써모 피셔 사이언티픽 | FERB49 | |
| 측량사® 돌연변이 검출 키트 | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
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| 분석 저울 MS104TS/00 | 메틀러 토레도 | 30133522 | |
| DS-11 FX 및 DS-11 FX+ 분광 광도계 | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
참고문헌
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global an....
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