Summary
Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .
Abstract
CCCTC-associazione fattore (CTCF)-mediata stabile topologicamente associando i domini (TADs) svolgono un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs. CTCF svolge un ruolo importante nel regolare l'espressione spaziale e temporale dei geni HOX che controllano lo sviluppo embrionale, patterning di corpo, ematopoiesi e leukemogenesis. Tuttavia, rimane in gran parte sconosciuto se e come i confini HOX loci associati CTCF regolano organizzazione della cromatina ed espressione genica HOX . Nel protocollo attuale, una libreria in pool specifico sgRNA targeting per tutti i siti di legame di CTCF nei loci HOXA/B/C/D è stata generata per esaminare gli effetti di turbare i confini di cromatina CTCF-collegata sulla formazione di TAD e gene HOX espressione. Attraverso CRISPR-Cas9 screening genetico, il sito di legame di CTCF situato tra geni HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) è stato identificato come un regolatore critico del dominio della cromatina oncogeno, oltre ad essere importante per mantenere un gene HOX ectopico modelli di espressione in MLL-riorganizzate leucemia mieloide acuta (AML). Così, questa libreria sgRNA approccio di screening fornisce nuove conoscenze sulla organizzazione di genoma CTCF mediata in loci genici specifici e inoltre fornisce una base per la caratterizzazione funzionale degli elementi normativi genetici con annotazioni, entrambi di codifica e non codificante, durante i normali processi biologici in epoca di progetto genoma post-umano.
Introduction
Recenti studi di interazione tra genoma ha rivelato che le forme di genoma nucleare stabili topologicamente associando domini (TADs) che sono conservati attraverso specie e tipi di cellule. L'organizzazione del genoma in domini distinti facilita e limita le interazioni tra elementi normativi (ad es., esaltatori e promotori). Il fattore di CCCTC-associazione (CTCF) si lega ai limiti di TAD e svolge un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs1. Tuttavia, il genoma vasta CTCF associazione dati hanno rivelato che sebbene CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, spesso funziona come una barriera di cromatina presso un sito specifico in una cella tipo ma non in altro, suggerendo che funzioni CTCF insieme ad altre attività nella formazione della cromatina confini2. Ciò che rimane sconosciuto è se gli elementi di contorno (siti di legame per CTCF) sono direttamente collegati alla funzione biologica di CTCF, e come questi collegamenti si verificano. Quindi, supponiamo che specifici siti di legame di CTCF nel genoma direttamente regolano la formazione di TADs e controllano le interazioni promoter/enhancer all'interno di questi domini o tra domini limitrofi. Il completamento dei umani e successive analisi epigenetiche e progetti di sequenziamento del genoma di topo hanno scoperto nuove firme genetiche e molecolari del genoma. Tuttavia, il ruolo di firme/modifiche specifiche nella regolazione genica e la funzione cellulare, come pure i loro meccanismi molecolari, devono ancora essere pienamente compreso.
Linee multiple di prova sostengono che il TADs CTCF-mediata rappresenta funzionale della cromatina domini3,4,5. Anche se CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, dati CTCF ChIP-seq ampi del genoma ha rivelato che CTCF spesso funziona come una barriera di cromatina in una cella tipo ma non negli altri2. CTCF svolge un ruolo essenziale durante lo sviluppo di mediazione genoma organizzazione4,6,7. Rottura dei confini CTCF alterata enhancer/promotore interazioni ed espressione genica, che conduce al bloccaggio inerente allo sviluppo. Ciò suggerisce che CTCF mediata TADs sono non solo componenti strutturali, ma anche unità normativo necessario per enhancer corretta azione e gene trascrizione5,8,9.
Geni HOX giocano un ruolo critico nello sviluppo embrionale e sono temporalmente e spazialmente limitate nel loro pattern di espressione. Il locus HOXA forma due TADs stabile che separa geni anteriori e posteriori da un elemento di contorno CTCF-collegata in hESCs e IMR90 cellule1. I rapporti recenti hanno dimostrato che HoxBlinc, un HoxB locus associato lncRNA, media la formazione di CTCF diretto TADs e interazioni enhancer/promotore in luogo del HOXB . Questo porta alla attivazione del gene HOXB anteriore durante ESC impegno e differenziazione10. Inoltre, ai loci genici specifici compreso il luogo HOXA , alterazione di CTCF mediata profili di espressione genica specifici di TAD domini ha cambiato la sua stirpe ed è stata associata con lo sviluppo della malattia stati11,12. La prova sostiene una funzione primaria per CTCF nella trascrizione genica di coordinamento e nella determinazione della microcella organizzando il genoma in domini funzionali.
Nonostante il suo ruolo nello sviluppo embrionale, durante l'ematopoiesi, geni HOX regolano la funzione delle cellule (HS/PC) ematopoietica staminali e progenitrici. Questo viene fatto controllando l'equilibrio tra proliferazione e differenziazione10,13,14,15. L'espressione dei geni HOX è strettamente regolata in tutta la specifica e la differenziazione delle cellule ematopoietiche, con massima espressione in HS / espressione genica pz. HOX gradualmente diminuisce durante la maturazione, con i suoi livelli più bassi che si verificano differenziato cellule ematopoietiche16. Disregolazione genica HOX è un meccanismo dominante di trasformazione leucemica di proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione disregolando di HS/PCs che conduce alla trasformazione leucemica17,18. Tuttavia, il meccanismo di stabilire e mantenere la normale vs modelli di espressione oncogena di geni HOX , nonché reti di regolazione associati rimane poco chiaro.
Lo screening CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteca è stato ampiamente usato per interrogare di geni codificanti per proteine19 come bene come geni non codificanti, come lncRNA20 e miRNA21 in specie diverse. Tuttavia, il costo per utilizzare la libreria di sgRNA CRISPR-Cas9 per identificare nuovi bersagli genomici rimane alto, perché il sequenziamento del genoma ad alta velocità è spesso applicato per verificare la proiezione di libreria sgRNA. Nostro sgRNA sistema di screening è focalizzata sul loci specifici genoma e valuta la sgRNAs targeting attraverso One-step RT-PCR secondo l'espressione del gene marcatore, ad esempio HOXA9. Inoltre, Sanger sequenziamento ha confermato che il sgRNA è stato integrato nel genoma le mutazioni Indel può essere rilevata per identificare il sgRNA targeting per sito. Attraverso lo screening genetico loci specifici CRISPR-Cas9, il confine di cromatina CBS7/9 è stato identificato come un regolatore fondamentale per stabilire il dominio della cromatina oncogeno e mantenere ectopico pattern di espressione genica HOX nella patogenesi dell'AML 12. il metodo può essere ampiamente applicato per identificare non solo la funzione specifica di confine CTCF in sviluppo embrionale, ematopoiesi, leukemogenesis, ma anche limite di CTCF come potenziali bersagli terapeutici per la futura terapia epigenetica.
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Protocol
1. CTCF sgRNALibrary Design utilizzando uno strumento Online
- Progettare il sgRNA targeting siti di legame di CTCF nei loci HOX umani utilizzando lo strumento di progettazione genetica perturbazione piattaforma (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
- Sintetizzare un totale di 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncRNA targeting geni (Figura 1, tabella 1). Ogni elemento di DNA targeting è bersagliato da 5-10 differenti sgRNAs.
2. sgRNA biblioteca clonazione
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Clonare gli oligonucleotidi sintetizzati nel vettore lentivirale spina dorsale CRISPR (lentiCRISPRv2).
- Digerire il vettore LentiCRISPRv2 con enzima di restrizione BsmBI a 37 ° C per 2 h.
- Cercare la presenza della band più grandi (circa 12.873 bp) sul gel dopo digestione di BsmBI e quindi purificarla con il kit di estrazione del gel.
Nota: Un pezzo di piccola riempitrice kb 2 è anche presente sul gel dopo la digestione, ma questo può essere ignorato. - Legare gli oligonucleotidi sintetizzati e digerito LentiCRISPR vettoriale con 150 ng di digerito LentiCRISPR DNA, 1 µ l di 10 µM oligos, 2 µ l di tampone di ligasi 10 x T4, 1 µ l di ligasi T4 e poi incubare a 16 ° C durante la notte.
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Trasformare la libreria CRISPR/sgRNA lentivirale nelle cellule electro-competente per l'amplificazione.
- Preparare la electroporator a 1,8 kV, 200 Ω e 25 µF. Pre-riscaldare il recupero media SOC in bagnomaria a 37 ° C, quindi pre-riscaldare piatti antibiotici ampicillina della libbra a 37 ° C.
- Scongelare le cellule competenti in ghiaccio per 10 min.
- Preparare le provette da 1,5 mL micro-centrifuga e 1 mm elettroporazione cuvette sul ghiaccio.
- Mescolare 1 µ l di un plasmide di biblioteca di 10 ng / µ l DNA in 25 µ l di cellule competenti in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga e mescolare delicatamente, spostando il fondo della provetta un paio di volte manualmente.
- Una volta che la cuvetta è abbastanza fredda, è possibile trasferire la miscela delle cellule del DNA/competenti ad esso. Toccare due volte sul piano di lavoro e pulire eventuali gocce di acqua dall'esterno della cuvetta con una velina. Quindi posizionare la cuvetta nel modulo elettroporazione e premere impulso.
- Aggiungere immediatamente 975 µ l di media di 37 ° C pre-riscaldato SOC. Mix di pipettaggio su e giù e trasferirlo in una provetta da 15 mL.
- Ruotare e incubare a 37 ° C per 1 h.
- Diluire 100 celle µ l in 900 µ l di media SOC e mettere 100 µ l su una piastra di agar antibiotico ampicillina LB. Incubare per una notte a 37 ° C.
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Estrarre il DNA del plasmide dalle colonie combinate utilizzando una colonna maxi-prep come specificato nel protocollo del produttore.
- Raschiare tutte le colonie dalla piastra di agar di LB e inoculare una coltura starter di 2 mL di mezzo di antibiotico ampicillina LB e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione vigorosa (~ 200 x g).
- Diluire la cultura starter 1: 500 in 100 mL di terreno LB ampicillina e incubare a 37 ° C per 12-16 ore con agitazione vigorosa (~ 200 x g).
- Raccogliere il pellet cellulare batterica mediante centrifugazione a 6.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet batterico in 10 mL di buffer di sospensione.
- Lisare precipitato sospeso con 10 mL di tampone di lisi e vigorosamente invertire 4 - 6 volte. Incubare il lisato per 5 min a temperatura ambiente.
- Neutralizzare il lisato con 10 mL di tampone di neutralizzazione refrigerati. Miscelare capovolgendo delicatamente i tubi di 4 - 6 volte e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
- Rotazione verso il basso a 13.500 x g per 30 min a 4 ° C. Prontamente trasferire il surnatante contenente il DNA del plasmide ad un nuovo tubo.
- Ripetere il passaggio 2.3.7 e prontamente trasferire il surnatante contenente il DNA del plasmide ad un nuovo tubo.
- Equilibrare la colonna applicando 10 mL di buffer di equilibrazione e consentire nella colonna vuota di flusso di gravità.
- Aggiungere il supernatante alla colonna e permetterle di entrare la resina da colata a gravità.
- Lavare la colonna con 2 x 30 mL di tampone di lavaggio.
- Eluire il DNA con 15 mL di tampone di eluizione.
- Precipitare il DNA con 10,5 mL di isopropanolo temperatura al DNA eluito. Mix e spin giù immediatamente a 15.000 x g per 30 min a 4 ° C e delicatamente decantare il supernatante.
- Lavare la pallina di DNA con 5 mL di etanolo al 70%, a pellet di DNA di centrifuga a 15.000 x g per 10 min e scartare il supernatante chiaro.
- Ripetere il passaggio 2.5.14 altre due volte.
- Centrifugare a pellet di DNA a 15.000 x g per 10 min e delicatamente decantare il supernatante senza disturbare il pellet di DNA.
- Asciugare il pellet per 5-10 min e sciogliere il DNA in un volume richiesto del buffer (buffer di TE, pH 8.0).
3. l'alto titolo sgRNA generazione della libreria Lentivirus
- Preparazione di cella: cultura HEK293T cellule in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS) e 1% (vol/vol) penicillina-streptomicina (PS) antibiotico in boccette di T-25. Metterli in incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
- Pacchetto dei lentivirus: co-transfect HEK293T cellule con 20 µ g di vettori libreria purificata dal passaggio 2, 15 µ g del plasmide pacchetto (psPAX2) e 10 µ g del plasmide busta (pMD2.G) per 48 h prima della raccolta i virus.
- Collezione di virus: dopo 48 h, collectthe virus surnatante e filtrare il surnatante attraverso una membrana PVDF di 0,45 µm povera in proteine associazione virus.
- Concentrazione di virus: concentrare il surnatante lentivirale utilizzando 50 volte il concentratore e testare il virus MOI nel passaggio 5.
- Deposito di virus: aliquota del concentrato virus e conservare in un congelatore a-80 ° C.
4. ottimizzato con puromicina concentrazione
- Coltura delle cellule di leucemia: cellule di cultura MOLM13 AML in RPMI 1640 completati con 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS) e 1x antibiotici penicillina-streptomicina (PS) in un matraccio da T-125. Metterli in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
Nota: Le cellule sono in genere passate ogni 4-5 d a un rapporto di divisione di 1:4 o 1:6, mai permettendo che le cellule di raggiungere più di 70% confluency. - Impostare MOLM13 cellule in un piatto di 12-pozzetti con una densità pari a 1,0 x 104 cellule/mL, a un volume totale di 2 mL per pozzetto (2.0 x 104 celle).
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Analisi di tempo-corso: cellule MOLM13 trattare con con puromicina per 7 giorni in aumento delle concentrazioni (0,1 µ g/mL, 0,2 µ g/mL, 0,5 µ g/mL, 1,0 µ g/mL e 2,0 µ g/mL)
- Impostare MOLM13 cellule senza un trattamento con puromicina il giorno 0 e impostare 3 pozzi replicare senza un trattamento con puromicina come controllo dal giorno 0 al giorno 7.
- Curare le cellule MOLM13 con 0,1 µ g/mL, 0,2 µ g/mL, 0,5 µ g/mL, 1,0 µ g/mL e 2,0 µ g/mL, separatamente, con ogni condizione sperimentale contenente 3 pozzi replicare.
- Il rapporto di cellule vive di contare e fare una curva di sopravvivenza dal giorno 0 al giorno 7 contenente tutte le condizioni.
- Curva di sopravvivenza: macchia le cellule con Trypan blue e conteggio vitalità ogni giorno per ottenere le curve di sopravvivenza per ciascuna concentrazione con puromicina.
- Ottimizzare la concentrazione minima con puromicina: determinare la concentrazione minima con puromicina attraverso la colorazione blu di Trypan nel quale MOLM13 tutte le cellule sono uccise tra 5-7 giorni.
5. titolazione della biblioteca lentivirale in cellule di leucemia di MOLM13
- Preparazione di cellule di AML: raccogliere le cellule MOLM13 AML con il mezzo di trasduzione (RPMI 1640, 10% FBS, PS di 1% e 8,0 µ g/mL liquido di rivestimento) con una densità di 1.5 x 106 cellule/ml.
- Posto MOLM13 cellule della piastra 12-pozzetti con 1.5 x 106 cellule in ciascun pozzetto.
- Scongelare il lentivirus: rimuovere il lentivirus concentrato dal congelatore-80 ° C e scongelare su ghiaccio.
- Mix MOLM13 cellule con una dose diversa del lentivirus concentrato in pozzetti separati, tra cui 0, 1, 2.5, 5, 7,5 e 10 µ l (totali 6 gruppi).
- Immediatamente centrifugare queste miscele a 1.000 x g per 2 h a 33 ° C e trasferire le 12-pozzetti piastre in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 4 h.
- Dopo 4 h, rotazione verso il basso le cellule infettate a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Delicatamente aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule trasdotte con mezzi freschi (RPMI 1640, 10% FBS e 1% PS) e poi trasferirli in boccette di T-25 e incubare a 37 ° C per 48 h senza con puromicina.
- Dopo 48 h, queste celle suddivise in 2 flaconi (2 gruppi): un gruppo sperimentale trattato con 1 con puromicina µ g/mL per 5 giorni e un gruppo di controllo senza un trattamento con puromicina per 5 giorni.
- Effettuare con puromicina selezione per 5 giorni con 1 con puromicina µ g/mL secondo il punto 4 fino a quando tutte le celle di controllo non trasdotte sono morte. Cambio per i media freschi ogni 2 giorni.
- Misurare il valore MOI ottimizzato per trasduzione del dividendo il numero di cellule vive, trattati con con puromicina con il numero di cellule senza un trattamento con puromicina.
6. trasduzione della libreria KO pool CRISPR-Cas9
- Trasduzione con lentivirus: infettare 1.5 x 106 MOLM13 cellule con 0,3 MOI di lentivirus sgRNA riunito in mezzo (RPMI 1640, 10% FBS, PS di 1% e 8 µ g/mL liquido di rivestimento) in piastra a 6 pozzetti e utilizzare le celle senza l'infezione dei lentivirus come controllo.
- Immediatamente Centrifugare la piastra 6 pozzetti a 1.000 x g per 2 h a 33 ° C a spinfect le cellule e trasferire le piastre in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 4 h.
- Rotazione verso il basso le cellule infettate a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Delicatamente aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule trasdotte con mezzi freschi (RPMI 1640, 10% FBS e 1% PS) e poi trasferirli in boccette di T-25 e incubare a 37 ° C per 48 h senza con puromicina.
- Dopo 48 h, è possibile trattare le cellule con 1 con puromicina µ g/mL per 5 giorni. Scambiare per media fresco dopo 2 giorni e mantenere una densità cellulare ottimale.
- Il singolo clone in piastre da 96 pozzetti con limitazione di metodi di diluizione del seme e incubare questi singoli cloni a 37 ° C e 5% CO2. Della loro coltura per 3-4 settimane.
- Dopo una singola cellula si sviluppa in su in una popolazione, trasferire la metà delle cellule in 24 pozzetti per ulteriore cultura sotto selezione con puromicina e verificare questi cloni nel passaggio successivo. Mantenere il resto delle cellule.
7. screening della libreria KO pool CRISPR-Cas9 con One-step RT-qPCR
- Determinare l'efficacia del clone integrato sgRNA screening dalla valutazione dell'espressione del gene marcatore HOXA9 con un passo d'inversione-transcriptase della polimerasi catena (One-step RT-qPCR).
Nota: HOXA9 sono altamente espressi in cellule di AML MOLM13 in leukemogenesis22,23. - Conte il sgRNA integrato MOLM13 e trasferimento 1 x 104 cellule per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.
- Centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 min e poi accuratamente rimuovere e scartare il surnatante con una pipetta senza disturbare il pellet cellulare.
- Lavare le cellule con 125 µ l di tampone PBS e centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 min. Quindi rimuovere 120 µ l del surnatante con una pipetta e conservare circa 5 µ l di PBS in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 50 µ l di mix master lisi cellulare contenente 48 µ l di tampone di lisi delle cellule, 1 µ l di soluzione di proteinasi K (10 mg/mL) e 1 µ l di soluzione di dnasi (1 mg/mL) ad ogni pozzetto. Quindi dispensare su e giù per 5 volte per risospendere il pellet cellulare.
- Incubare il mix per 10 min a temperatura ambiente, seguita da 5 min a 37 ° C e poi a 75 ° C per 5 min.
- Memorizzare il lysate delle cellule in congelatore a-80 ° C.
- La preparazione della reazione di One-step RT-qPCR: scongelare il mix di reazione di One-Step e altri componenti di reazione a 4 ° C. Quindi rallentare brevemente per raccogliere soluzioni nella parte inferiore dei tubi e metterli su ghiaccio senza luce. Mescolare e girare delicatamente.
- Aggiungere 1 µ l di lysate delle cellule per i pozzetti PCR con il mix di reazione di RT-qPCR, tra cui 1 µ l di primer forward di gene marcatore (300 nM) e reverse primer (300 nM), 0.125 µ l della trascrittasi inversa (10 U / µ l) e 5 µ l di miscela di reazione di One-Step (2x).
- Sigillare i pozzetti con la pellicola otticamente trasparente e delicatamente vortice e miscelare i componenti di reazione.
- Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti su uno strumento PCR in tempo reale.
- Eseguire la reazione di trascrizione inversa per 10 min a 50 ° C, seguita da inattivazione della polimerasi e denaturazione del DNA per 1 min a 95 ° C.
- Eseguire RT-PCR con 40 cicli di reazione di PCR: denaturazione per 15 s a fluorescenza 95 ° C, ricottura/estensione e piastra di lettura per 20 s a 60 ° C e quindi analisi della curva di fusione a 65-95 ° C tramite incrementi di 0,5 ° C a 2-5 s/step.
- Impostare sovraregolati, downregulated e nessun cambiamento in gruppi secondo i livelli di espressione del gene HOXA9 in confronto al controllo, separatamente. Utilizzare gene β-actina come controllo gene housekeeping.
8. Verifica dell'integrato sgRNAs cloni positivi attraverso la genotipizzazione e la sequenza di Sanger
- Verificare i cloni di espressione HOXA9 è diminuito attraverso Sanger sequenziamento ed eseguire PCR con 50-100 genoma ng MOLM13 DNA, buffer di 5 µ l della polimerasi reazione (10x), primer di 1 µ l in avanti (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) e 1 µ l inverso Primer (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µ l dNTP (10mM), polimerasi (5 U /µL) di 1 unità. Eseguire la reazione di PCR con la denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 s e quindi più denaturazione a 94 ° C per 20 s, ricottura a 56 ° C per 20 s, estensione a 68 ° C per 20 s (Totale 30 cicli), estensione finale a 68 ° C per 10 min e quindi si tiene a 4 ° C.
- Estrarre e purificare i prodotti di PCR (dimensione 285 bp) con un Kit di purificazione di PCR.
- Legare i prodotti di PCR purificati nel vettore T con 2 µ l T4 legatura di tampone (10x), 50 ng T vector DNA (50 ng / µ l), 25 ng purificato PCR DNA (285 bp), ligasi di 1 µ l T4 (3 unità / µ l) e posto la legatura si mescolano in un incubatore a 16 ° C durante la notte.
- Trasferire il mix di legatura in cellule competenti DH5α, crescere su una piastra di agar antibiotico ampicillina LB e incubare per una notte a 37 ° C.
- Scegli i singoli cloni dalla piastra LB e verificarli di genotipizzazione e Sanger sequenziamento.
9. rilevazione di sgRNAs mutazione Indel indotte dall'analisi di digestione di nucleasi
- Rilevare che il sgRNA integrato singolo clone indotto Indel tariffe da un'analisi di test di nucleasi.
- A parte preparare ampliconi PCR con 50-100 ng Indel mutante (test) e DNA wild-type (WT, riferimento) come modello PCR, 5 µ l tampone di reazione della polimerasi (10x), 1 µ l dNTP (10mM), polimerasi (5 U / µ l) di 1 unità, 1 µ l primer avanti (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') e 1 µ L reverse primer (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). La reazione di PCR è stata effettuata con denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s e poi la denaturazione a 98 ° C per 20 s, ricottura a 56 ° C per 20 s, estensione a 72 ° C per 30 s (Totale 30 cicli) ed estensione finale a 72 ° C per 10 min e che tiene a 4 ° C.
- Impostare il gruppo di miscela dell'eteroduplex con 200 ng di "reference" (20 ng / µ l) e 200 ng di "prova" (20 ng / µ l) tra gli ampliconi PCR in provetta PCR 0,2 mL e il gruppo di miscela omoduplex con solo 400 ng di "reference" ampliconi PCR come controllo.
- Separatamente Incubare la miscela dell'eteroduplex e omoduplex a 95 ° C per 5 min in un becher da 1 litro riempito con 800 mL di acqua e poi raffreddare gradualmente a temperatura ambiente per temprare e formare dell'eteroduplex o omoduplici.
- Separatamente il digest 400 ng della miscela dell'eteroduplex e omoduplex ricotta con nucleasi di 1 µ l indel mutazione rilevamento (2,5 U / µ l) e 2 µ l tampone reazione nucleasi (10x) a 42 ° C per 60 min.
- Analizzare i campioni digeriti con elettroforesi su gel di agarosio, il DNA di miscela dell'eteroduplex deve essere tagliato in piccoli frammenti (70-250 bp) e alla omoduplex DNA (320 bp) non devono essere tagliate.
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Representative Results
La tecnologia CRISPR-Cas9 è un potente strumento di ricerca per gli studi di genomici funzionali. Si sta rapidamente sostituendo il gene convenzionali tecniche di editing ed ha alta utilità per applicazioni orientate al gene genoma e individuali. Qui, la prima individualmente clonato loci specifici CRISPR-Cas9-schierati sgRNA libreria contiene 1.070 sgRNAs composto sgRNAs targeting 303 geni targeting casuale, 60 controlli positivi, 500 controlli non-Human Target e 207 elementi CTCF o lncRNA targeting per geni in quattro loci HOX (Figura 1, tabella 1). Questa libreria è destinata a tutti i motivi che legano CTCF core, HOX gene associato lncRNAs, noto elementi regolatori e diversi geni HOX come controlli positivi nei loci HOX . Contiene inoltre sgRNAs targeting casuale non -HOX geni, geni non-umani e regioni intergeniche come controlli negativi. Per migliorare l'efficienza e la specificità di CTCF sito knock-out (KO) lentiCRISPR trasduzione, ogni sito di destinazione contiene 5-10 sgRNAs (tabella 1). Nel protocollo qui descritto, sgRNA librerie sono progettate secondo siti di associazione CTCF loci HOXA/B/C/D e lncRNAs in questi loci, che si basa sugli strumenti sgRNA Broad Institute (Figura 1, Figura 2). Dopo trasduzione ad una molteplicità di bassa di infezione con un MOI di 0,3 in MOLM13 cellule che trasportano la fusione MLL-AF9, il tasso di infezione è meno di un sgRNA/cella seguita dalla selezione con puromicina, e quindi erano i cloni resistenti coltivati da teste di serie singola cellula schermati per insufficienza di espressione del gene HOXA9 .
Il flusso di lavoro per lo screening di biblioteca sgRNA è stato brevemente descritto (Figura 3). In primo luogo, la libreria sgRNA contenitore di virus sono stati generati in HEK293T cellule con l'aiuto di due vettori (psPAX2 e pMD2.G). sgRNA riunito biblioteca lentivirus erano concentrati e trasformata in cellule di AML MOLM13 con polybrane (8,0 µ g/mL). Dopo una trasduzione di 48 h, le cellule sono state trattate con la concentrazione ottima di con puromicina. Dopo 5 giorni, le cellule sono state seminate un cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e i singoli cloni sono stati generati in presenza con puromicina. Infine, sono stati identificati sgRNA singoli cloni integrati nel genoma di One-step RT-PCR, Sanger sequenziamento e rilevazione di mutazioni Indel (Figura 3). Il resistenti con puromicina singoli cloni sono identificati attraverso gocciolina di One-step RT-qPCR digitale (RT-ddqPCR) secondo l'alterazione dell'espressione dell'oncogene HOXA9 (Figura 4). Genotipizzazione e sequenza Sanger sono stati effettuati per la costruzione della libreria sgRNA e verifica (Figura 2, Figura 4).
sgRNA targeting MOLM13 cloni positivi in una piastra PCR a 96 pozzetti sono stati ulteriormente confermati con il metodo di RT-qPCR basato suilivelli di espressione di HOXA9 geni attraverso il confronto con le cellule di controllo. Fuori la 528 sopravvivere cloni schermati, 10 cloni hanno esibiti più di 50% di riduzione nei livelli di HOXA9 (Figura 4A). sgRNAs integrato nel HOXA9-ridotto, HOXA9-invariato e HOXA9-cloni aumentati sono stati ulteriormente confermati dall'amplificazione di PCR delle sequenze sgRNA utilizzando primers fiancheggianti di vettore. I prodotti di PCR purificati erano legati al sistema di vettore T tramite ligasi T4 e inviati per l'identificazione di sequenza Sanger (Vedi punto 8). I dati di sequenza hanno indicato che fuori 30 cloni sequenziati, 21 cloni incluso sgRNA singolo (tabella 2). Le categorie di sgRNA sono state identificate e analizzate secondo i livelli di espressione di HOXA9 . Sei dei dieci cloni mostrando una riduzione in HOXA9 livelli contenuti sgRNAs sul sito CBS7/9 di targeting, ma non nei geni non-umani, geni umani casuale e altri controlli di sito CTCF (Figura 4 e tabella 2).
sgRNA integrato positivo singole mutazioni Indel clone-indotta sono determinate dalla PCR-basata genotipizzazione e nucleasi digestione basata sull'analisi della nucleasi (Figura 5). L'analisi di digestione di nucleasi è stata eseguita per identificare mutazioni si è verificate nel contorno CBS7/9 nel rappresentante HOXA9Indel-ridotto, HOXA9 -invariato e HOXA9 -aumentato cloni. I risultati hanno rivelato che la mutazione di CBS7/9 è stata trovata in 4 fuori il 6 HOXA9-ridotto cloni: cloni #5, 6, 28 e 121, ma non in cloni #15 e #31 (Figura 5). Tuttavia, clone #15 contenuto sgRNA destinazione HOTTIP lncRNA sito, , mentre clone #31 conteneva diversi sgRNAs rivolto a HOAIRM1 lncRNA, HOTAIR lncRNA, sito di legame di CTCF HOXD9/10 (figure 4B, 5 e tabella 2).
Figura 1 : Diagramma schematico mostrando i siti di legame di CTCF e lncRNAs in quattro HOX loci genici. Ogni elemento di DNA targeting contiene 5-10 differenti sgRNAs. CTCF ChIP-seq dataset è stato scaricato da GEO (GSM1335528) e visualizzati con visualizzatore genomico integrato (IGV). SgRNA targeting siti CTCF in loci HOX sono stati etichettati con forbici arancioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diagramma schematico che rappresenta la parte di integrazione sequenza vettore sgRNA e primer di amplificazione di PCR. I primer di amplificazione di PCR sono stati progettati in base alla sequenza vuota del vettore lentivirale sgRNA. Il primer forward (P1) è stato evidenziato in giallo, il primer reverse (P2) è stato evidenziato in rosso e la sgRNA è stata evidenziata in verde nel vettore lentivirale sgRNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Diagramma schematico che rappresenta il flusso di lavoro per la progettazione della libreria sgRNAs, costruzione e verifica. Questo flusso di lavoro è come indicato di seguito. In primo luogo, la libreria sgRNA è stata progettata e clonata in un vettore lentivirale CRISPR, e quindi il lentivirus è stato confezionato con i sgRNA biblioteca vettoriale, psPAX2 e pMD2.G vettori lentivirali nelle cellule HEK293T. Successivamente, le cellule MOLM13 sono state infettate con un virus MOI (0,3) basso e queste cellule hanno subito la selezione con puromicina. Quindi, il singolo clone è stato seminato in una piastra a 96 pozzetti. Infine, i cloni di singolo sgRNA integrati in un genoma sono stati identificati da One-step RT-qPCR, sequenza di Sanger e rilevazione di mutazioni Indel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Pool CRISPR-Cas9 KO biblioteca proiezione identificato con One-step RT-qPCR e sequenza di Sanger. (A) uno screening di PCR di digitale passo RT-gocciolina dell'espressione HOXA9 in singoli cloni infettato da lentivirus che contiene la libreria sgRNA. Lo screening di 528 sgRNA biblioteca infettato cloni per i livelli di espressione di HOXA9 è mostrato (528 punti). Dieci di 528 cloni hanno esibiti più di 50% di riduzione in HOXA9 livelli (frecce viola). La linea rossa indica il limite di un cambiamento di diminuzione 2 volte confrontando con le cellule di controllo; la linea blu indica il limite di un cambiamento di aumento di 2 volte. (B), i sei cloni #5, 6, 28, 121, 207 e 420 vennero bersagliati con il sgRNA specifico CBS7/9 tramite sequenza Sanger (frecce verdi). (C) l'analisi di RT-ddqPCR di HOXA9 livelli in WT MOLM13 e il 21 cloni contenente singole sgRNA mirati. I dati di espressione di HOXA9 sono stati raggruppati in cinque gruppi secondo le categorie di sequenze sgRNA: sito CTCF HOXA7/9 , gli obiettivi non-umani, altri siti CTCF i loci HOX , HOX associati lncRNAs, e altri bersagli umani. Questa figura è stata modificata da Luo et al.12. Per le statistiche, i dati è stati rappresentati come la media ± SD da tre esperimenti indipendenti con test t di Student. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Indel mutazioni di sgRNAs integrato clone positivo confermato con l'analisi PCR-basata di genotipizzazione e nucleasi. (A) Il DNA di genomic è stato isolato dal rappresentante CRISPR-Cas9 KO biblioteca proiettato cloni che hanno esibito ridotti, invariati o aumentati livelli di espressione di HOXA9 . L'omissione eterozigotica del sito CTCF situato tra HOXA7 e HOXA9 geni (limite di CBS7/9) è stata identificata dalla genotipizzazione basati su PCR. HOXA9-diminuita eliminazione di cloni #5, 6, 28 e 121 esposto nel punto di confine di CBS7/9 (frecce nere). (B) The Indel mutazioni nel sito CBS7/9 sono state analizzate da nucleasi digestione dosaggio da rappresentante cloni che hanno esibito ridotto (linea rossa), invariato (linea blu), o ha aumentato i livelli di espressione di HOXA9 (linea viola). HOXA9-diminuito cloni #5, 6, 28 e 121 ha esibito le mutazioni nella posizione limite CBS7/9 (frecce arancioni). Questa figura è stata modificata da Luo et al.12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: sgRNAs informazioni sulla destinazione di biblioteca della piscina. Questi dati sono da Luo et al.12. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Sanger risultati di sgRNAs presentato in selezionati di sequenziamento HOXA9 -diminuito, HOXA9 -invariato, e HOXA9 -aumentato cloni. HOXA9-cloni in diminuzione, immutati e aumentati sono evidenziati in rosso, blu e viola, separatamente. Questi dati sono da Luo et al.12. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Proteina-codificazione gene relativo sgRNA librerie sono state applicate in un sistema di screening funzionale all'identificazione di geni e i networks che regolano specifiche funzioni cellulari attraverso sgRNA arricchimento24,25,26 ,27,28. Regione non codificante diversi correlati sgRNA librerie inoltre sono state indicate nelle schermate funzionale gene-specifico per distale e prossimale elementi, tra cui BCL11A, Tdgf1a e farmaco-resistenza di regolazione regolazione geni28, 29,30. Tutte queste librerie sgRNA sono state generate da una dettagliata bioinformatica design, sintesi del oligonucleotide e sub-clonazione i pool di oligonucleotide in vettori. L'approccio di screening intero genoma è molto potente e utile, ma richiede competenze computazionali per genoma sgRNA progettazione e finanziamento coerente per la sintesi di costosa; così, è ancora difficile per la maggior parte dei laboratori. Tuttavia, la nostra libreria di loci specifici sgRNA approccio di screening è sia conveniente ed efficiente per identificare l'elemento di DNA specifico come ad esempio il sito di legame di CTCF coinvolto nell'organizzazione della cromatina e regolazione trascrizionale (Figura 1 e Figura 2). Prendendo di mira i confini CTCF, abbiamo applicato un one-step RT-PCR per valutare cloni sgRNA mirata in base al livello di espressione di un gene marcatore specifico, HOXA9. Inoltre, abbiamo effettuato Sanger sequenziamento per confermare questi cloni positivi integrato sgRNAs (Figura 2 e Figura 4). Per funzionalmente di confermare che queste sgRNAs positivo mirati cloni, abbiamo effettuato un'analisi di rilevamento genotipizzazione e mutazione PCR-basata per determinare se il sgRNA induce la destinazione sito inserimento o eliminazione mutazioni (Figura 5). Questo ci dà un metodo promettente per target specifici elementi di DNA non codificante e valutare la loro funzione biologica in cellule di mammifero.
Nel nostro protocollo, abbiamo detto che un design di oligonucleotide specifico farà in modo più efficiente Sub-clonazione nei vettori lentiCRIPSRV2 e più attendibilmente generare una libreria di accurata sgRNA (passi 1 – 2). Al fine di ottenere il lentivirus di libreria sgRNA alto titolo, il surnatante lentivirale dovrebbe essere concentrato 50 utilizzando il concentratore seguendo il protocollo (fase 3) e conservati in un congelatore-80 ° C in più aliquote (passaggi 3.1 – 3,5). Un'ulteriore preoccupazione è trovare il valore ottimale di MOI per trasduzione. Se il MOI è troppo bassa, il numero delle cellule infettate diminuirà e portare a sgRNA fallimento di screening. Se il MOI è troppo alto, si integrerà più sgRNA in una singola cella e interferirà con la libreria sgRNA di screening attraverso l'One-step RT-PCR e rilevazione di mutazioni Indel. Pertanto, prima proiezione, trovare il MOI ottimo per ogni gruppo di cellule attraverso la titolazione della biblioteca lentivirale è un passo importante. Titolazione della biblioteca lentivirale in cellule di leucemia di MOLM13 e valutazione del MOI devono essere effettuati nel protocollo (passi 5.1 – 5,10). Inoltre, un approfondito di lisi delle cellule per trascrizione inversa può garantire successo One-step RT-PCR. Questo può essere fatto aumentando il tempo di incubazione per lisi in tutte le fasi di temperatura nel protocollo (passaggi 7,5 – 7,6). Pertanto, al fine di migliorare l'efficiente per lo screening della libreria CRISPR-Cas9 KO in pool, cella completa Lisi e trascrizione inversa gioca un ruolo critico nel determinare l'One-step RT-qPCR (passaggi 7.1 – 7,14). Inoltre, aumentando la qualità dei prodotti di PCR può garantire successo indel rilevazione di mutazione, perché i prodotti PCR di bassa qualità influirà sul processo di generazione dell'eteroduplex/omoduplex (passaggi 9.1 –.6).
Inoltre, il metodo può essere utilizzato per identificare il ruolo di CTCF nella regolazione dei geni HOX nello sviluppo embrionale precoce e certa leucemia con la firma di gene HOX aberrante. Ad esempio, i geni HOX giocano un ruolo critico nello sviluppo embrionale e tutti i quattro cluster HOX Gens sono temporalmente e spazialmente limitati nel loro pattern di espressione nello sviluppo embrionale. Inoltre, mutazioni di NPM1 sono tra l'anomalia genetica più comune in AML e rappresentano il 30% dei pazienti LMA con cariotipo normale citogenetica31. Questo sottoinsieme di AML esibisce una firma di gene HOXA e HOXB aberrante, che diventa un meccanismo dominante di trasformazione leucemica17. È fondamentale per chiarire come gene HOX sono regolati nello sviluppo normale e dysregulated durante leukemogenesis. Noi ed altri abbiamo indicato che CTCF svolge un ruolo essenziale nella trascrizione della cromatina per organizzazione e gene HOX loci9,12. Così, lo screening di HOX loci focalizzate sgRNA libreria fornisce un mezzo conveniente per intrappolare la funzione specifica del sito di legame di CTCF nella regolazione genica HOX durante lo sviluppo e la malignità ematopoietiche. Tuttavia, una limitazione dell'approccio è la difficoltà di trovare un utile marker per il sequenziamento di nuova generazione ad alta velocità. Uno degli obiettivi di ricerca futura sarà di trovare un marcatore altamente selettivo ed effettuare il sequenziamento di nuova generazione genoma al fine di vedere gli effetti del marcatore. Pertanto, utilizzando un gene marcatore-etichetta fluorescente specifico come il reporter di rilevamento diventerà uno strumento fondamentale in futuro piani di ricerca.
Rinforzatori di giocano una moltitudine di ruoli critici nella regolazione dell'espressione di gene e la funzione di promotore. Tuttavia, può anche attivare l'attività del promotore da lunga distanza in maniera indipendente, posizione e orientamento, e rinforzatori spesso regolano l'espressione genica in un orientamento di trans . Così, è difficile per individuare il enhancer(s) per geni specifici, particolarmente nell'era post-genomica. Reporter tradizionali saggi e correlative analisi funzionali (ad es., immunoprecipitazione della cromatina e dosaggi ipersensibile DNaseI) sono state utilizzate per esaminare enhancer funzione32,33. Allo stesso modo, piccole proiezioni orientate al locus in scala sono stati applicati anche per esplorare le attività di elementi regolatori distale e prossimale per specifici geni34. Recentemente, la strategia di biblioteca di pool sgRNA-KO che gli obiettivi non codificanti elementi regolatori nei luoghi del gene HOX correttamente identificato un sito di legame di CTCF situato tra geni HOXA7 e HOXA9 , come pure un lncRNA HOTTIP che è fondamentale per il controllo posteriore HOXA dominio nell'organizzazione cromatinica, che aziona l'espressione ectopica di HOXA gene nella leucemia mieloide acuta (AML)12. Questi studi hanno dimostrato che lo screening di libreria pool sgRNA-KO è anche un approccio di genetica potente per identificare e valutare la funzione biologica di elementi non-codificazione nel nostro genoma in situ.
CTCF, come una proteina di isolante di cromatina, svolge un ruolo importante nell'organizzazione del genoma definendo quartieri della cromatina per pattern di espressione genica specifici nella cella specifica tipo11,35. Alterazione della struttura di dominio topologicamente associato (TAD) cambia le interazioni enhancer/promotore, risultante in un stato malato5,11. CTCF è altamente conservata nei metazoi e si arricchisce ai confini di TAD. Tuttavia, rimane poco chiaro se e come CTCF contribuisce a mantenere la struttura di confine della cromatina e formazione di TAD. Anche se lo screening di libreria sgRNA-knockout CTCF pool era incentrato sul quattro loci HOX , essa ha dimostrato di essere un metodo efficace per identificare e sezionare i confini CTCF e definire dominio TAD così come l'interazione enhancer/promotore e trascrizione entro il dominio TAD12. Inoltre, questo metodo può essere applicato in modo efficiente per identificare gli elementi di lncRNA e fattori di trascrizione che mediano la conformazione della cromatina e attività di accessibilità in loci HOX . Stiamo anche cercando di esplorare la libreria CRISPR/sgRNA che contiene i siti CTCF genoma attraverso la successiva identificazione di sequenza di generazione secondo CTCF ChIP-seq e ChIA-PET dati di ricerca in futuro. Pertanto, questa strategia può essere esteso a un intero cromosoma o anche l'intero genoma.
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Disclosures
Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano anche Nicholas Cesari per il manoscritto di editing. Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
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