Summary
유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
유비퀴틴화는 다양한 신호 경로에서 중요한 역할을 하며 염색질 기능 및 DNA 관련 과정의 조정에 특히 관여하는 번역 후 수정입니다. 이 수정은 E1 유비퀴틴 활성화, E2 유비퀴틴-컨쥬게이팅 및 E3 유비퀴틴-리가제 및 듀비퀴틴-리가제를 포함한 여러 효소의 순차적 작용을 수반하며 듀비퀴틴아제(DUBs)에 의해 역전된다. 유비퀴틴화는 효소 활성의 변조, 단백질-단백질 상호 작용 및 세포외 국소화를 포함한 단백질 기능의 저하 또는 단백질 기능의 변경을 유도합니다. 단백질 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화를 입증하는 중요한 단계는 정제된 성분으로 시험관 내 반응을 수행하는 것입니다. 효과적인 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응은 사용되는 다양한 성분, 효소 보조 인자, 완충조건 및 기질의 성질에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 여기서는 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 폴리콤 억압 복합체 1(PRC1), BMI1 및 RING1B, 리신 119에 대한 히스톤 H2A를 모노비퀴틴화하는 E3 유비퀴틴 리가제의 최소한의 성분을 사용하여 이러한 반응을 설명한다. 핵소종 H2A의 듀비퀴틴화는 인간 듀비퀴티나제 BAP1 및 그 보조 인자 ASXL2의 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인에 의해 형성된 최소한의 폴리콤 억압적 듀비퀴타제(PR-DUB) 복합체를 사용하여 수행된다. 이러한 유비퀴틴화/듀비퀴틴화 분석은 포유류 세포로부터 정제된 박테리아 정제 단백질 또는 네이티브 뉴클레오좀으로 재구성된 재조합 뉴클레오좀의 맥락에서 수행될 수 있다. 우리는 이 반응에 중요한 영향을 미칠 수 있는 복잡성을 강조하고 우리는 이 프로토콜의 일반적인 원리가 그밖 E3 유비퀴틴 ligases 및 deubiquitinases에 신속하게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.
Introduction
유비퀴틴화는 번역 후 가장 보존된 변형 중 하나이며 효모, 식물 및 척추동물을 포함한 다양한 유기체에 매우 중요합니다. 유비퀴틴은 단백질을 표적으로 하는 76개의 아미노산 폴리펩티드를 고도로 보존한 유비퀴틴의 공유 부착으로 구성되며, 즉 E1-활성화, E2-컨쥬게이팅 및 E3 리가제1과 관련된 3가지 순차적 단계에서 발생합니다. 2,3. 이 번역 후 수정은 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼에서 중심 역할을한다. 실제로 반응의 특이성을 제공하는 E3 ligases는 효소의 큰 슈퍼 패밀리를 구성하며 유비퀴틴 시스템 4,5,6의가장 풍부한 효소입니다. 단백질 유비퀴틴화의 하류 효과는 단핵화, 다중 단핵화, 선형 또는 분기된 폴리유퀴틴화와 같은 변형의 특성에 따라 달라집니다. 단핵화는 거의 프로테아소말 분해와 관련이 없지만, 대신이 수정은 다양한 신호 이벤트를 중재하는 데 관여합니다. 폴리비퀴틴화는 유비퀴틴 분자 자체에서 N 말단 또는 리신 잔기와 관련이 있으며, 폴리유비퀴틴 단백질의 운명은 유비퀴틴 사슬 연장에 관여하는 잔류물에 달려 있습니다. 유비퀴틴의 리신(48)에 의해 매개된 폴리유비퀴틴화는 프로테아소탈화를 유도하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 반대로, 유비퀴틴의 리신(63)을 통한 폴리유비퀴틴화는 종종단백질 활성화 7,8,9와연관된다. 다른 중요한 번역 후 수정과 유사하게, 유비퀴틴은 가역적이며 단백질에서 유비퀴틴 제거는 세포 과정의 중요한 규제 기관으로 부상한 듀비퀴타제(DUBs)라고 불리는 특정 프로테아제에 의해 보장됩니다. 2개 , 10. 중요한 것은, 많은 DUBs는 고도로 전문화되어 있으며, 단백질 기능에 유비퀴틴화와 듀비퀴틴화 사이의 미세한 균형이 중요하다는 것을 나타내는, 듀비퀴틴화를 통해 조절한다. E3s와 DUBs는 프로테아좀 분해 기계 및 액세서리 요인과 함께 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(UPS, >1200 유전자)을 형성하여 세포 성장 및 증식과 관련된 주요 신호 전달 경로를 조절합니다. 세포 운명 결정, 분화, 세포 이동 및 세포 사멸. 중요한 것은, 유비퀴틴화를 수반하는 몇몇 신호 폭포의 규제 완화는 종양발생 및 신경 변성 질환을 촉진5,11,12,13, 14.
유비퀴틴화는 염색질 생물학 및 DNA 의존적 과정에 만연한 역할을 한다15,16,17. 예를 들어, 리신 119(이하 H2A K119ub)에 대한 히스톤 H2A의 단일화는 전사 억압 및 DNA 수리에 관여하는 중요한 번역 후 변형(18,19,20, 21,22. H2A K119ub는 후성 유전학 정보의 유지보수에 중요한 역할을하고 매우 인간에 드로 소필라에서 보존 폴리 콤 억압 단지 1 (PRC1)에 의해 촉매된다. 정식 PRC1은 특히 RING1B 및 BMI1에 의해 구성되며, 이는 전술한 유비퀴틴이벤트(22,23)를담당하는 핵심 E3 유비퀴틴 리가제 복합체이다. Drosophila에서,H2A 단핵화 (H2A K118ub 포유류에서 H2A K119ub에 해당) DUB 칼립소에 의해 반전된다, 이는 폴리 콤 억압 DUB (PR-DUB) 복합체를형성하는 추가 섹스 빗 (ASX)와 상호 작용. 칼립소, BAP1의포유류 직교는 다양한 인간 악성 종양에서 삭제 또는 비활성화된 종양억제제(25,26,27,28, 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33. BAP1은 핵및 칼슘 신호 매개 세포자멸에서 DNA 의존적 과정을 조절하는 33,34,35,36, 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 42. BAP1은 특히 ASXL1, ASXL2 및 ASXL3 (ASXL), ASX38,43의3 개의 정형 고리를 포함하는 전사 조절기를 포함하는 다중 소단위 단백질 복합체를 조립한다. ASXL은 BAP1 DUB 활동35,36,44를자극하기 위해 ASXM 도메인이라고도 하는 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인을 사용합니다. 그러므로, ASXL는 염색질에 있는 BAP1 DUB 활동을 조정하고 더 넓게 그것의 종양 억제기 기능에 있는 중요한 역할을 합니다.
유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 과정을 연구하기 위한 몇 가지 방법이 존재한다. 특히, 박테리아에서 정제 된 단백질을 사용하여 생화학 분석은 특정 기질에서 유비퀴틴의 직접 유비퀴틴 또는 제거를 입증하는 데 매우 강력합니다. 이러한 실험은 최소 복합체의 요구 사항 결정, 반응 역학 결정, 구조/기능 관계 정의 및 병리학의 영향 이해와 같은 다양한 매개 변수를 조사하기 위해 수행될 수 있습니다. 유전자 돌연변이. 여기에서, 우리는 정제된 분대를 가진 염색질 기판에 유비퀴틴화 및 deubiquitination 반응을 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 모델 시스템으로서, 체외 에서 유비퀴틴화 및 핵소체 H2A 단백질의 듀비퀴틴화가 제시된다. RING1B/BMI1 및 BAP1/DEUBAD의 최소 복합체로 조립된 박테리아 정제 단백질은 각각 뉴클레오소좀 H2A의 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화에 사용됩니다.
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Protocol
1. GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 GSH-아가로즈 선호도 정화
- pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159 aa)-BMI1(1-109aa) 박테리아 발현 구조를 사용하여 BL21(DE3) 박테리아를 변형시키는 구조(재료표참조)23. 이러한 컨스트럭트는 pGEX-6P-2 백본에서 GST 태그를 사용하여 BMI1 도메인 1-109에 융합된 뮤린 RING1B 도메인 1-159의 발현을 허용한다.
- 100 μg/mL 암피실린 과 50 μg/mL 클로람페니콜이 있는 LB 국물 배지의 20 mL에서 GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109 aa)을 발현하는 RIL 박테리아를 접종하여 하룻밤 스타터 배양을 수행합니다. 밤새 37°C에서 흔들어 서 배양한다. 다음날, 500 mL의 신선한 LB 국물 배지(1/26 희석)를 포함하는 1 L 플라스크에 앰피실린을 넣고 37°C에서 2-4시간 동안 쉐이커에서 배양한다.
-
인큐베이션 시간 동안 분광광도계로 600 nm에서 OD를 측정합니다. 박테리아 배양이 600 nm에서 0.6 OD 단위에 도달하면, 비 유도 샘플로서 1,5 mL 튜브에서 1 mL aliquot를 취합니다. 단백질 발현을 유도하기 위해 1L 배양에 이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드(IPTG)의 400 μM을 첨가한다. 박테리아를 25°C에서 6시간 에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 1mL aliquots를 30s용 14,000 x g에서 원심분리하고, 상급자를 버리고, Laemmli 샘플 버퍼의 200 μL에서 펠릿을 다시 중단하고, 단백질 유도의 SDS-PAGE 및 Coomassie 파란색 분석을 유지합니다.
- 플라스크에서 유도된 박테리아 배양을 깨끗한 원심분리 병으로 옮기고 4°C에서 15분 동안 3,500 x g에서 스핀다운합니다. 상급을 버리고 40 mL의 차가운 PBS로 펠릿을 다시 중단하고 4 °C에서 15 분 동안 3,500 x g에서 아래로 돌립니다.
- 상급체를 버리고 펠릿을 -80°C에서 동결시키거나 다음 단계로 진행한다. 단백질이 예상 분자량으로 유도되는 경우 다음 단계로 진행합니다.
- 얼음 차가운 용해 완충제 A (50 mM Tris-HCl pH 7.5) 25 mL에서 박테리아 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 및 AEBSF, 아프로틴, 베스타틴, E-64, 루페프틴 및 펩스타틴 A를 포함하는 1/100 항 프로테아제 칵테일. 모든 박테리아 펠 릿이 다시 일시 중단 되어 있는지 확인 합니다. PMSF 및 항 프로테아제 칵테일은 박테리아 용해 시에만 용해 완충액에 신선하게 첨가되어야 합니다.
주의 사항: 항상 얼음에 샘플을 유지합니다.
참고: 100 μg/mL에서 리소자임은 박테리아 용해를 향상시키기 위해 추가 될 수 있습니다. - 박테리아를 얼음에 15분 동안 배양시키고 프로브 초음파 를 사용하여 30 초 (4-5x)의 출력 진폭 70 %에서 초음파 처리한 다음 4 °C에서 20 분 동안 21,000 x g에서 원심 분리기를 사용합니다.
주의 사항: 초음파 처리 중에 항상 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. - 원심분리 시간 동안, 15 mL 튜브에 500 μL 포장 GSH-아가로즈 비드 (50% 슬러리)를 취하고 PMSF 및 항 프로테아제없이 버퍼 A 10 mL를 추가하십시오. 4 °C에서 3 분 동안 2,500g에서 짧게 섞고 이 세척 단계를 두 번 더 반복하고 구슬을 얼음위에 유지하십시오.
- 세균성 용해 원심분리에 따라 상체를 수집하고 50 mL 원엽 튜브로 옮긴다. 총 용해액으로 100 μL의 aliquot를 취하고 SDS-PAGE 및 Coomassie 청색 분석을 위한 2x Laemmli 샘플 버퍼의 100 μL을 추가합니다.
- 0.45 μm 기공 주사기 필터를 통해 용해염을 걸러내고 GSH 구슬과 혼합합니다. 4 °C에서 5 시간 동안 흔들어 서 3 분 동안 2,500 x g에서 구슬을 스핀 다운하고 제거한 다음 장수를 통해 흐르는 동안 장수를 저장합니다. 단백질-GSH 결합 비드를 완충액 A로 6회(각각 5 mL) 세척하고 프로테아제 방지 칵테일 및 PMSF를 함유한다.
- 마지막 세척 후, 빈 크로마토그래피 컬럼에 버퍼 10 mL과 함께 구슬을 옮기고, 25 mM 글루타티온을 함유한 1.5 mL 버퍼 A를 추가하고, 중력에 의한 용출을 1.5 mL 마이크로튜브로 수집한다. 용출 절차를 4회 반복합니다.
참고: 글루타티온 스톡 솔루션은 50 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 200 mM 농도로 제조됩니다. - 4개의 용출각각에서 10 μL의 알리쿼트를 취하고 2x Laemmli 샘플 버퍼의 10 μL을 추가합니다. 이들 샘플은 정제된 단백질의 존재 및 순도를 결정하기 위해 SDS-PAGE 및 Coomassie 청색 분석에 사용될 것이다.
참고: 마지막 용출 후, 재활용 및 향후 사용을 위해 4 °C에서 완충구슬을 유지하십시오. - 추가 분석을 위해 적당한 양의 정제된 단백질을 보여주는 용출 분획을 선택합니다. 준비의 작은 별표를 확인합니다. 정제된 단백질을 -80°C에 보관하십시오. 일반적으로 단백질 농도는 μL당 0.5 μg에서 2 μg범위이며 샘플은 이 상태로 저장될 수 있습니다.
- 선택 사항: 10K 원심 필터 장치를 사용하여 샘플 농축 또는 변경 버퍼
2. BAP1/DEUBAD(ASXL2) 듀비퀴타아제 복합체의 정화
- pET30a+-His-BAP138 및 pDEST-MBP-DEUBAD(ASXL2)35세균 발현 구제를 사용하여 BL21(DE3) RIL 박테리아를 각각 변형시켜 그의 BAP1 및 MBP-DEUBAD의 생산을 시킵니다.
- 50 μg/mL 클로람페니콜과 각 플라스미드에 해당하는 항생제를 함유한 암피실린 배지의 LB 국물 20 mL에서 박테리아를 발현하는 그의 BAP1 및 MBP-DEUBAD(ASXL2)를 배양하여 별도의 하룻밤 스타터 배양을 수행, 100 μg/ 각각 카나마이신 또는 암피실린의 100 μg/mL의 mL. 37°C에서 셰이커에 놓습니다.
- 1.3-1.6 단계를 수행합니다.
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얼음 차가운 용해 완충액 B의 25 mL에 박테리아 펠릿을 다시 중단 (50 mM 트리스 pH 7.3, 500 mM NaCl, 3 mM β-메르카포에탄올, 0.2% 트리톤 X-100, 1 mMPMSF 및 1/100 안티 프로트 아제 칵테일). MBP-DEUBAD와 그의 BAP1의 동일한 볼륨을 혼합하고 15 분 동안 얼음에 배양. 소음 대 한 다음 프로토콜 1 (단계 9)에 표시된 대로 용해염을 원심 분리.
- 원심분리 동안 PMSF 및 프로테아제 방지 칵테일없이 완충B로 3회 세척하여 500 μL 포장 된 Ni-NTA 아가로즈 비드 (50% 슬러리)를 준비합니다.
- 세균성 용해 원심분리에 따라 상체를 수집하고 50 mL 원엽 튜브로 옮긴다. 총 용해액으로 100 μL의 aliquot를 취하고 SDS-PAGE 및 Coomassie 청색 분석을 위한 2x Laemmli 샘플 버퍼의 100 μL을 추가합니다.
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0.45 μm 기공 주사기 필터를 통해 용해염을 걸러내고 Ni-NTA 구슬과 혼합합니다. 4°C에서 5시간 동안 흔들어서 2,500 x g의 구슬을 3분 동안 스핀다운하고, 제거하고, 장수를 통과하는 흐름으로 저장합니다.
- 20 mM 1,3-디아자-2,4-사이클로펜타디엔(이미다졸)을 함유하는 완충B로 6회(각 5 mL)의 구슬을 세척한다.
참고 : pH 7.3에서 2 M 이미다졸의 재고 솔루션을 확인합니다.
- 20 mM 1,3-디아자-2,4-사이클로펜타디엔(이미다졸)을 함유하는 완충B로 6회(각 5 mL)의 구슬을 세척한다.
- 마지막 세척 후, 빈 크로마토그래피 컬럼에 버퍼 10 mL로 구슬을 전송하고, 200 mM Imidazole를 포함하는 1 mL 버퍼 B를 추가하고 10 μL DTT (500 mM) 및 2 μL EDTA (500 mM)를 포함하는 1.5 mL 마이크로 튜브에 중력에 의한 용출을 수집합니다. , pH : 8). 용출 절차를 4 번 반복합니다. 각 용출 분획의 10 μL을 취하고 SDS-PAGE 및 Coomassie 청색 분석을 위해 2x Laemmli 샘플 버퍼10 μL을 추가합니다. 원하는 용출 분수를 풀.
참고: 구슬을 4 °C의 완충재로 유지하여 재활용및 향후 사용을 위해 사용하십시오. -
용출 된 복합체를 완충C (50 mM Tris pH 7.3, 300 mM NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF 및 1/100 프로테아제 억제제 칵테일)로 희석한 후 아밀로스 비즈로 인큐베이션합니다.
- PMSF 및 프로테아제 방지 칵테일을 첨가하지 않고 완충C로 2회 세척하여 아밀로스 아가로즈 비드(500 μL 포장)를 준비합니다. 희석된 용출에 비드를 넣고 4°C에서 밤새 배양한다.
- 2,500 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 통과하고 흐름을 유지하십시오. 완충C(5-6x)의 5 mL로 단백질 경계 구슬을 세척합니다.
- 정제된 그의-BAP1/MBP-DEUBAD 복합체를 아밀로스 아가로즈 비드에 완충D(50 mM HEPES pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1mM DTT)에 보관하고 -80°C에 보관한다. 비드 분획 20 μL(50% 비드 용액)을 취하고 SDS-PAGE 및 Coomassie 청색 분석을 위해 2x Laemmli 샘플 버퍼 20 μL을 추가합니다.
3. HEK293T 세포에서 뉴클레오좀의 정화
- 완전한 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)에서 배양 HEK293T 세포는 5% 신생아 송아지 혈청(NBS), 2 mML-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충되었습니다.
- 접시 주위 12 x 106 HEK293T 세포 20 mL의 완전한 배지 당 15 cm 배양 접시 1 일 전에 형질감염 (10 접시사용). 형질감염 전에 혈청이 없는 배지의 12 mL로 세포의 배지를 변경하고 1 mg/mL36에서63 μl의 폴리에틸렌민 (PEI)을 사용하여 pCDNA-Flag-H2A 21 μg로 세포를 트랜스펙트합니다. 12시간 후에 완료된 매체로 변경합니다.
- 3일 후, 15 mL의 얼음-차가운 PBS(2회)로 세포를 세척하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 3 mL의 얼음 차가운 PBS에서 수확합니다. 2,100 x g에서 4 °C에서 8 분 동안 원심 분리기. PBS를 폐기하고 용해 단계로 진행하거나 -80°C에서 세포 펠릿을 동결시켰다.
- 약 10개의 버퍼 E(50 mM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2,1 mM PMSF, 1/100 프로테아제 억제제 칵테일, N-메틸말레미드(NEM) 및 인큐베이트 20 mM에서 세포 펠릿을 재중단한다. N-메틸말레미드 (NEM)는 뉴클레오좀과 함께 정화하는 DUB를 억제하는 데 중요합니다.
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3,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리 후 상급을 버리고 10 볼륨의 버퍼 E. 혼합에서 크로마틴 펠릿을 5 분 동안 3,000 x g에서 반전 및 원심 분리에 의해 다시 중단하십시오.
- 버퍼 F "MNase 버퍼"(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2,1 mM CaCl 2, 0.3 M M 수크로오스, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF, 및 1/100 프로트 억제제를 사용하여 완충제 E를 사용하여 또 두 번 세척 단계를 반복 칵테일)을 참조하십시오.
주의: 세차및 원심분리 중에 펠릿이 떠있습니다.
- 버퍼 F "MNase 버퍼"(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2,1 mM CaCl 2, 0.3 M M 수크로오스, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF, 및 1/100 프로트 억제제를 사용하여 완충제 E를 사용하여 또 두 번 세척 단계를 반복 칵테일)을 참조하십시오.
- 5 mL 버퍼 F에서 염색을 다시 중단하고 미코칼 뉴클레아제 (MNase)로 펠릿을 치료하십시오 (실온에서 10 분 동안 3 U / mL).
참고: 반응은 Dounce 균질화기를 사용하여 혼합함으로써 원조될 수 있다. -
배양 후, 뉴클레오소좀 DNA 단편의 분석을 위해 혼합물의 40 μL aliquot를 취한다. 이 알리쿼트와 페놀/클로로폼 40 μL, 6x DNA 로딩 버퍼 20 μL, 소용돌이, 2분 동안 18,000 x g에서 스핀하고 2% 아가로즈 젤에 DNA를 로드합니다.
- DNA가 주로 단핵구체에 해당하는 147 bp 단편일 때, 최종 농도에서 5 mM EDTA를 첨가하여 반응을 중단한다.
- 4°C에서 20분 동안 21,000 x g에서 원심분리를 한 후, 4°C에서 밤새 항기 수지로 수용성 염색질 분획을 배양합니다. 6x 버퍼 G (50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mMDTT, 1/100 프로테아제 억제제 칵테일)로 구슬을 씻는다.
- 5 mL 버퍼 G가 있는 비드를 빈 크로마토그래피 컬럼으로 옮긴다. 국기 용출 펩티드의 200 μg / mL로 구슬 결합 뉴클레오좀을 용출하십시오. 200 μg/mL 플래그 용출 펩타이드를 함유하는 완충제 G(재료 표참조) 및 1/5(vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0으로 구성된 용출 버퍼를 사용한다. 260 μL 플래그 용출 버퍼로 핵소체 를 3x 경화 (각 용출 2 시간).
- 페놀-클로로폼 추출을 위한 aliquot를 복용하여 3개의 용출을 테스트하고 DNA를 2% 아가로스 겔에 로드합니다. 각 용출 분획의 10 μL을 취하고 SDS-PAGE 및 Coomassie 블루 분석을 위해 Laemmli 샘플 버퍼 2x의 10 μL을 추가하고 유비퀴틴화 된 H2A의 웨스턴 블롯 검출을위한 각 용출을로드합니다. 용출을 -80°C에서 저장합니다. 일반적으로 인간 세포에서 정제하면 0.1 ~ 0.5 μg /μL에 이르는 농도로 박테리아보다 적은 양의 단백질을 얻을 수 있습니다.
4. BMI1/RING1B E3 유비퀴틴 리가제 복합체를 이용한 뉴클레오솜 유비퀴틴 분석
- 원심분리기는 10K 기공 0.5 mL 원심 필터를 통해 용출 완충제로부터 반응 완충체 H로 기판을 변화시다(25 mM Tris, pH 7.5; 10 mM MgCl2,및 5 mM ATP). 대안적으로, 시판되는 뉴클레오좀은 분석법용으로 사용될 수 있다.
참고: 기판 현탁액을 반응 완충액으로 변경하면 재현성을 보장하고 플래그 용출 혼합물에 존재하는 화합물에 의한 잠재적E3 리가제 억제를 방지할 수 있습니다. - 40 μL 버퍼 H의총 부피에서 뉴클레오좀의 1 μg를 배양. Ub 활성 효소 (UBE1) (250 ng), Ub (50 ng / μL) 및 E2 Ub-컨쥬게이팅 효소 (672 ng) 및 BMI1 / RING1B E3 유비퀴틴 리가제 복합체 1 μg를 추가하십시오. 37°C에서 3시간 동안 반응을 배양하고 가끔 씩 씩 씩씩이 한다.
참고: 생략, E1, E2, E3, ATP 및 유비퀴틴을 포함하여 여러 가지 제어가 병렬로 수행될 수 있습니다. 이것은 유비퀴틴화 반응에 대한 특이성을 보장한다. - 2x Laemmli 샘플 버퍼의 40 μL을 추가하여 반응을 멈추고 표준 절차에 따라 SDS-PAGE 및 서부 블로팅에 의한 히스톤 H2A K119 유비퀴틴화를 분석합니다. 항-H2A 또는 항-H2A K119ub 항체를 사용하십시오(재료 표참조).
5. BAP1/DEUBAD를 이용한 시험관 내 핵Ososomal H2A DUB 분석
- 시험관 내 듀비퀴틴화 분석에 정제된 뉴클레오좀을 사용한다. 40 μL 완충제 I(50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 1 mM MgCl 2,50 mM NaCl, 및 1 mM DTT)에서 100-500 ng의 뉴클레오좀을 다시 중단한다. BAP1 박테리아 정제 His-BAP1 및 MBP-DEUBAD 1 μg를 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 듀비퀴틴화 반응을 가끔 씩 씩 씩씩하게 흔들어 수행한다.
- 2x Laemmli 완충액의 40 μL을 첨가하여 시험관 내 반응을 중지하고 면역 블로팅에 의해 분석한다.
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Representative Results
GST-BMI1 및 RING1B 단백질은 박테리아에서 잘 생성되며 수용성 분획에서 쉽게 추출될 수 있습니다. 도 1A는 GST-BMI1-RING1B 복합체의 전형적인 정제를 위한 쿠마시 블루 염색을 나타낸다. GST-BMI1 및 RING1B 대역은 각각 예상 분자량, ~45 kDa 및 ~13 kDa로 마이그레이션됩니다. 특히 E3 리가제 복합체는 매우 낮은 수준의 박테리아 단백질 오염 물질 및/또는 분해 산물로 매우 균일합니다. 더욱이, 정제된 복합체의 점치내측정은 1:1의 몰 비와 같이 최적이며, GST-RING1B 단백질의 밴드 강도는 BMI1보다 2~3배 더 강할 것으로 예상된다. 유사하게, His-BAP1/MBP-DEUBAD 복합체의 정제는 또한 각각 ~90 kDa 및 ~55 kDa에서 밴드와상대적으로 매우 균일한 제제를 초래하였다 (그림 1B). BAP1 및 DEUBAD의 탠덤 친화도 정제는, 니켈-아가로즈 및 아밀로오스 아가로즈를 통해 각각 정제된 복합체로부터 자유 BAP1의 제거 및 적절한 공양측정을 보장하고 있다. 한편, 정제된 핵소종 분획은 본질적으로 고농축 단핵구 분획의 존재를 나타내는 147bp 대역에 의해 구성된다(도1C). 이러한 정제된 뉴클레오좀의 쿠마시 블루 염색은 4개의 히스톤 소단위의 전형적인 밴드 패턴을세포형성량(도 1D)으로 나타낸다. 시판되는 재조합 단뉴클레오좀은 또한 SDS-PAGE 및 아가로즈 겔에서 각각 이동될 때 유사한 단백질 및 DNA 패턴을 표시한다. 주목할 점은, H2A 및 플래그-H2A의 단일비퀴틴화된 형태는 HEK293T 정제 뉴클레오좀에서 쉽게 구별될 수 있다. 우리는 E1/E2/유비퀴틴/ATP와 함께 재조합 뉴클레오좀을 사용하고 BMI1-RING1B 복합체를 사용한 히스톤 H2A의 유비퀴틴화는 단백질의 유비퀴틴화 된 형태의 시간 의존적 증가를 나타내며, 비변형 형태의 수준은 그에 수반되는 감소. 거의 모든 H2A 단백질이 H2A K119ub(도 1E)으로 형질전환됨에따라 유비퀴틴화 반응은 총화된다. 한편, 듀비퀴틴화 분석은 네이티브 뉴클레오좀에서 수행되었다. BAP1/DEUBAD를 가진 이 뉴클레오좀의 인큐베이션에 이어, 우리는 H2A K119ub 신호의 시간 의존적 감소를 관찰하였다(도1F). 유비퀴타화 된 H2A의 두 밴드는 각각 ~ 30 kDa 및 ~ 25 kDa 대역에서 이동하는 형질 감염 된 플래그-H2A 및 내인성 H2A에 해당합니다.
그림 1: 정제, 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화. (A) GST-RING1B-BMI1 단백질의 정제 및 쿠마시 블루 염색을 이용한 분석. GST-RING1B-BMI1은 박테리아에서 생산되고 GST 친화성 구슬을 사용하여 정제되었다. 정제 순도와 단백질 크기를 확인하기 위해, 용출을 15% SDS-PAGE 젤에 적재하고 쿠마시 블루로 염색하였다. BSA의 다른 금액은 단백질 수량을 결정 하는 데 사용 됩니다. 염색된 겔을 스캔하여 도면생성. (B) MBP-DEUBAD/His-BAP1 단지의 정화. MBP-DEUBAD 및 HIS-BAP1은 박테리아에서 별도로 생산되었다. 용해 후, MBP-DEUBAD 및 HIS-BAP1을 니켈 및 말토오스 구슬을 사용하여 혼합 및 정제하였다. 정제된 복합체는 8% SDS-PAGE 젤에 적재하고 쿠마시 블루로 염색하였다. (C) MNase 처리 후 단핵구의 정제. PCDNA.3 Flag-H2A를 발현하는 HEK293T의 크로마틴을 추출하여 MNase로 처리하여 단핵구체를 생성하고 정제하였다. 단뉴클레오좀의 생성을 확인하기 위해, UV 광 하에서 페놀 클로로포름 추출 및 검출을 위해 염색질의 일부를 취하였다. 2% 아가로즈 겔에 로딩하면 단핵구를 나타내는 전형적인 147염기 DNA 단편을 밝혀냅니다. (D) 정제된 단뉴클레오좀을 쿠마시 블루 스테인드에 사용하였다. (e) 뉴클레오좀의 생체 외 유비퀴틴. 재조합 뉴클레오좀은 37°C에서 세균 정제된 E3 유비퀴틴 리가제 이량체, GST-RING1B/BMI1 및 E1/E2/ATP/유비퀴틴을 지시된 시간 동안 배양하였다. H2A 단핵화(H2A K119ub)는 웨스턴 블로팅에 의해 분석되었다. (F) BAP1/DEUBAD 듀비퀴타아제 복합체를 이용한 H2A K119ub의 듀비퀴틴분석분석. 시험관내 듀비퀴틴화 분석은 그의-BAP1/MBP-DEUBAD 및 포유류 정제 뉴클레오좀을 정제한 박테리아를 사용하여 수행하였다. 반응은 기소 된 시간에 대해 수행하고 서쪽 블로팅에 의해 분석되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜의 제어 및 개요입니다. (a) 정제된 포유류 BAP1 또는 이의 촉매 죽은 돌연변이체(C91S) 뿐만 아니라 박테리아 정제재조합 BAP1은 뉴클레오좀에 대한 H2A 디비퀴틴화를 위해 사용하였다. 완충액단독으로 또는 모의 정제로부터 수득된 용출로 배양된 뉴클레오좀도 대조군으로 포함시켰다. (B) BAP1은 RNF168 E3 리가제에 의해 유비퀴틴이 매개되는 H2A K13/K15를 듀비퀴틴화하지 않는다. HEK293T 세포는 K13/K15 잔기에서 유비퀴틴화를 보장하기 위해 RNF168과 함께 H2A K13R/K15R 또는 H2A K118R/K119R과 함께 공동 형질감염되었다. 정제된 뉴클레오좀은 BAP1 복합체에 의한 듀비퀴틴화에 사용하였다. 반응은 상이한 시점에서 중단되었고 면역블롯팅을 실시하였다. (C) 포유류 세포로부터 BAP1과 복합체에서 비유분화 및 단유분화 DEUBAD의 정제. 정제된 복합체는 핵소종 H2A K119ub에 대한 듀비퀴틴화 분석에 사용되었다. 반응은 표시된 시간 지점에 대해 수행되었고 서쪽 블로팅에 의해 분석되었습니다. (D) BAP1 deubiquitates H2A K119ub 생체 내. HEK293T 세포는 BAP1 및 ASXL2 구문과 함께 H2A 또는 H2A 돌연변이체(H2A K118R, K119R, K118R/K119R 또는 K13R/K15R)로 공동 형질감염되었다. 2일 후 형질감염, 지시된 항체를 이용하여 면역블롯팅을 위해 세포를 수확하였다. (E) 실험 워크플로우의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
관심 있는 단백질에 대 한 강력한 시험관 내 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 어설션을 확립하는 몇 가지 장점이 있습니다. 이러한 분석에 사용할 수 있습니다: (i) 최적의 조건을 설정 하 고 이러한 반응에 대 한 최소한의 요구 사항을 정의, (ii) 효소 운동 및 생 화학 상수를 결정, (iii) 이러한 반응에 영향을 미칠 수 있는 공동 인자 또는 억제제의 역할을 정의, (iv) 상호 작용 인터페이스를 식별, (v) 인공 또는 질병 관련 돌연변이의 영향을 테스트하고 (vi) 더 높은 처리량 화학 스크리닝 분석을 개발하는 데 사용할 수있는 분석 조건을 설정합니다. 여기에서, 우리는 우리가 BMI1/RING1B 중재된 H2A 유비퀴틴화 및 BAP1/ASXL 중재된 H2A deubiquitination을 핵소체 기판에 어떻게 하는지 설명해서 이 계산을 예시합니다.
히스톤 H2A의 유비퀴틴은 최소한의 성분을 사용하여 시험관 내에서 재봉화될 수 있으며, H2A의 거의 완전한 유비퀴틴화는 BMI1-RING1B 복합체를 사용하여 관찰될 수 있다. 참고로, 이 반응은 재조합 뉴클레오좀에서 수행된다. 이들은 포유류 세포에서 생기는 그밖 histones 번역 후 수정에서 자유롭다는 이점이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 유비퀴틴화 반응은 또한 네이티브 뉴클레오좀에서 효율적으로 수행될 수 있다. 유비퀴틴 반응이 약한 경우, 효소 대 기질의 비율을 증가하여 최적의 유비퀴틴 결찰을 관찰할 수 있다. 참고로, 듀비퀴틴화 반응 또는 상호작용 검정이 기질 유비퀴틴화 에 따라 수행될 경우, 유비퀴틴은 비드 결합 기판상에서 직접 수행될 수 있다. 유비퀴틴화된 기질은 풀다운에 의해 회수될 수 있고 유비퀴틴화 반응의 성분을 포함하는 상상체는 폐기될 수 있다. 그러나 효소 특성이 확립될 때, 효소는 용출될 필요가 있고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가된 분대의 stoichiometry.
듀비퀴틴화 반응은 유비퀴틴화 반응보다 적은 성분을 필요로 한다. 그러나, 단독으로 DEUBAD의 정제는 일반적으로 단백질 침전으로 이끌어 내다. 중요한 것은, DEUBAD가 BAP1로 정제될 때, 이것은 그것의 용해도를 크게 증가시킵니다. 참고로, 우리는 기질 및 효소 복합체의 다양한 양으로 듀비퀴틴화 검사를 수행하는 것이 좋습니다. 듀비퀴틴화 반응은 과량의 염색질에 의해 억제될 수 있으며, 이는 아마도 뉴클레오좀과 관련된 억제제의 증가된 농도에 의해 설명될 수 있다. 우리는 또한 무료 BAP1의 초과와 듀비퀴틴을 관찰했다. 따라서, BAP1 단독으로 핵소를 배양하는 것과 같은 몇몇 대조군(도2A)이포함되어야 한다. 또한 일부 DUBs 염색체와 공동 정화 수 있습니다 주의 하는 것이 중요 하다, 그리고 비록 우리가 NEM으로 염색체를 치료, DUBs 는 촉매 시스테인을 감소 DTT의 추가 다음 부분적으로 다시 활성화 될 수 있습니다. 추가, 금속 loproteinase DUBs는 또한 존재할 지도 모르다, 이 효소는 NEM에 둔감하고 이렇게 억제되지 않습니다. 따라서, 효소 및 DUB 촉매 죽은 돌연변이체를 첨가하지 않고 핵소체로만 구성된추가적인 대조군(도 2A)을 포함해야 한다. 참고로, H2A K119ub에 대한 BAP1 DUB 활성의 특이성은 잘 문서화되어 있으며 분석 조건에서 검증되었습니다. 우리는 H2A K118/K119R 또는 H2A K13/K15R을 발현하는 HEK293T 세포 뉴클레오좀으로부터 정제하였다. RNF168의 발현은 K13/K15에서 중요한 유비퀴틴화로 이어집니다. BAP1 DUB 활성은 H2A K119ub에 상응하는 H2A K13/K15R을함유하는 뉴클레오좀에서만 관찰된다(도 2B). 또 다른 고려 사항은 효소 활성에 중요 할 수있는 번역 후 수정이 세균성 단백질에 존재하지 않을 가능성이 있다는 것입니다. 따라서 포유류 세포로부터 정제된 성분을 이용한 시험관내 반응도35로간주될 수 있다. 예를 들어, 더 높은 진핵생물에서 관찰된 과정인 DEUBAD의 단일화는 BAP135의 듀비퀴틴나아제 활성을 크게 촉진한다(그림2C). 따라서, 포유류 세포로부터의 성분의 정제도 고려될 수 있었다. 시험관내 반응 이외에, 형질감염 후 세포에서 BAP1 DUB 활성을 직접 모니터링할 수 있다. 예를 들어, H2A 구체를 가진 HEK293T 세포의 형질감염은 세포에서의 풍부성 때문에 H2A K119ub의 명확한 신호를 줄 수 있다. 이러한 조건에서, 대부분의 유비퀴틴화는 K118/K119 잔기에서 발생하며, 아르기닌부위의 돌연변이는 H2A 유비퀴틴화의완전한 부재로 이어지도록 한다(도 2D). H2A와 함께 BAP1 및 ASXL2를 공동 발현하면 세포에서의 BAP1 DUB 활성에 대한 결론을 내릴 수 있다. 그러나 과식으로 인해 잘못된 결과가 발생할 수 있는 몇 가지 점을 고려해야 합니다. 따라서 이러한 실험은 최적화되고 잘 제어되어야 합니다.
요약하면, 그림 2E에서다시 설명하는 프로토콜은 간단하며, 전문화된 인프라 또는 실험 설정이 필요하지 않으며, 다중에 대해 상당한 양의 수정된 핵을 생성하기 위해 확장할 수 있습니다. 효소 분석, 질량 분석법 및 단백질-단백질 상호 작용 분석법을 포함한 하류 응용 프로그램.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
다이애나 아드자우드에게 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (2015-2020), 게놈 퀘벡 (2016-2019) 및 게놈 캐나다 (2016-2019)에서 E.B.A. E.B.B.A.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 레체 뒤 Québec-Santé의 수석 학자입니다. L.M과 N.S.K.는 FRQ-S에서 박사 학위를 취득했습니다. H.B는 고등 교육부와 튀니지 과학 연구와 콜 재단에서 박사 학위를 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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