Summary
Ubiquitination är en post-translationella modifiering som spelar viktiga roller i cellulära processer och är tätt koordinerad av deubiquitination. Defekter i båda reaktionerna ligger bakom mänskliga patologier. Vi tillhandahåller protokoll för att utföra ubiquitination och deubiquitination reaktion in vitro med hjälp av renade komponenter.
Abstract
Ubiquitination är en post-translationella modifiering som spelar viktiga roller i olika signalering vägar och är särskilt involverad i samordningen av kromatin funktion och DNA-associerade processer. Denna modifiering innebär en sekventiell åtgärd av flera enzymer, inklusive E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-konjugering och E3 ubiquitin-Ligase och reverseras av deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination inducerar nedbrytning av proteiner eller förändring av proteinfunktion inklusive modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaktion och subcellulär lokalisering. Ett kritiskt steg för att demonstrera protein ubiquitination eller deubiquitination är att utföra in vitro-reaktioner med renade komponenter. Effektiva ubiquitination och deubiquitination reaktioner kan påverkas kraftigt av de olika komponenter som används, enzym co-faktorer, buffertförhållanden, och arten av substratet. Här, vi tillhandahåller steg-för-steg-protokoll för att utföra ubiquitination och deubiquitination reaktioner. Vi illustrerar dessa reaktioner med minimala komponenter i mus polycomb repressiva Complex 1 (PRC1), BMI1, och RING1B, en E3 ubiquitin Ligase som monoubiquitinates Histon H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utförs med hjälp av en minimal Polycomb repressiv Deubiquitinase (PR-DUB) komplex som bildas av den mänskliga deubiquitinase BAP1 och DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domän av dess Co-Factor ASXL2. Dessa analyser av ubiquitination och deubiquitination kan utföras i samband med antingen rekombinanta nukleosomer som bereds med bakterierenade proteiner eller inhemska nukleosomer som renas från däggdjursceller. Vi belyser de krångligheter som kan ha en betydande inverkan på dessa reaktioner och vi föreslår att de allmänna principerna i dessa protokoll snabbt kan anpassas till andra E3 ubiquitin Ligaser och deubiquitinases.
Introduction
Ubiquitination är en av de mest bevarade post-translationella modifieringar och är kritisk för en mängd olika organismer, inklusive jäst, växter och ryggradsdjur. Ubiquitination består av den kovalent fastsättning av ubiquitin, en mycket bevarad 76 Amino Acid polypeptid, att rikta proteiner och förekommer i tre sekventiella steg med tre enzymer, dvs E1-aktiverande, E2-konjugating och E3 Ligase1, 2,3. Denna post-translationella modifiering spelar centrala roller i ett brett spektrum av biologiska processer. Faktum är att E3 ligases, som ger specificiteten av reaktionen, utgör en stor superfamilj av enzymer och är de vanligast förekommande enzymerna i ubiquitin systemet4,5,6. De efterföljande effekterna av protein ubiquitination beror på arten av förändringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, och linjär eller förgrenade polyubiquitination. Monoubiquitination är sällan förknippad med proteasomen nedbrytning, men i stället denna modifiering är involverad i medla olika signalering händelser. Polyubiquitination innebär N-terminalen eller lysin rester i ubiquitin molekyl själv, och ödet för ett polyubiquitinated protein beror på vilka rester är inblandade i ubiquitin kedje förlängning. Det har länge varit känt att polvubiquitinering medierad av lysin 48 av ubiquitin inducerar proteasomen nedbrytning. Tvärtom, polvubiquitinering via lysin 63 av ubiquitin är ofta förknippad med protein aktiveringen7,8,9. Liknar andra viktiga post-translationella modifieringar, ubiquitination är reversibel och ubiquitin avlägsnande från proteiner säkerställs genom specifika proteaser kallas deubiquitinases (DUBs), som har vuxit fram som viktiga regulatorer av cellulära processer 2 , 10. viktigt, många dubs är mycket specialiserade, och reglera, genom deubiquitination, specifika substrat, vilket indikerar att en fin balans mellan ubiquitination och deubiquitination är avgörande för proteinfunktion. E3s och dubs, tillsammans med proteasom nedbrytning maskiner och tillbehör faktorer, bildar ubiquitin proteasom systemet (UPS, med > 1200 gener) som reglerar större signalering vägar, av vilka flera är förknippade med celltillväxt och proliferation, cell öde bestämning, differentiering, cell migration, och celldöd. Viktigare, avreglering av flera signalering kaskader som involverar ubiquitination främjar tumorigenes och neurodegeneration sjukdomar5,11,12,13, 14.
Ubiquitination spelar genomgripande roller i kromatin biologi och DNA-beroende processer15,16,17. Till exempel, monoubiquitination av Histon H2A på lysin 119 (hädanefter H2A K119ub) är en kritisk post-translationella modifiering inblandade i transkriptionella förtryck och DNA Repair18,19,20, 21,22. H2A K119ub katalyseras av Polycomb repressiva Complex 1 (PRC1), som spelar en nyckelroll i upprätthållandet av epigenetisk information och är starkt bevarad från Drosophila till människa. Canonical PRC1 utgörs särskilt av RING1B och BMI1, som är det centrala E3 ubiquitin Ligase-komplexet som ansvarar för den ovan nämnda ubiquitination-händelsen22,23. I Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K118ub som motsvarar H2A K119ub i mammalians) är omvänd av Dub Calypso, som interagerar med ytterligare sex kam (ASX) bildar polycomb-REPRESSIVA Dub (PR-Dub) komplex24. Den däggdjur ortoolog Calypso, BAP1, är en tumör suppressor bort eller inaktiveras i olika mänskliga maligniteter25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reglerar DNA-beroende processer i kärnan och kalciumsignalerad apoptos vid endoplasmatiska Retikulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 monterar flera subunit proteinkomplex som innehåller transkription regulatorer särskilt ASXL1, ASXL2 och ASXL3 (asxls), tre ortologer av ASX38,43. Asxls använda den deubiquitinase adaptern (deubad) domän, också benämnd asxm domän, till stimulera BAP1 Dub aktivitet35,36,44. Därför asxls spela viktiga roller i samordningen BAP1 Dub aktivitet på kromatin och mer allmänt dess tumör suppressor funktion.
Det finns flera metoder för att studera ubiquitination och deubiquitination processer. I synnerhet är biokemiska analyser med proteiner som renas från bakterier mycket kraftfulla för att demonstrera direkt ubiquitination av, eller avlägsnande av ubiquitin från, specifika substrat. Dessa experiment kan utföras för att undersöka en rad parametrar såsom bestämning av kravet på minimala komplex, bestämning av reaktionskinetik, definition av struktur/funktionsförhållanden och förståelse av effekterna av patologiska genmutationer. Här, vi tillhandahåller protokoll för att genomföra ubiquitination och deubiquitination reaktioner på kromatin substrat med renade komponenter. Som modellsystem, in vitro -ubiquitination och deubiquitination av nukleosomalt H2A protein presenteras. Bakterier-renade proteiner monterade i minimala komplex av RING1B/BMI1 och BAP1/DEUBAD används för ubiquitination eller deubiquitination av nukleosomal H2A, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GSH-aguppstod affinitet rening av GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 ubiquitin Ligase Complex
- Använd pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bakterier uttryck konstruera för att omvandla BL21 (DE3) bakterier (se tabell över material)23. Denna konstruktion tillåter uttrycket av murina RING1B domän 1-159 smält till BMI1 domän 1-109 med gst tagg i pgex-6p-2 Backbone.
- Utför en övernattning starter kultur genom att vaccinera RIL-bakterier uttrycker GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) i 20 mL LB buljong medium i närvaro av 100 μg/mL ampicillin och 50 μg/mL kloramfenikol. Inkubera genom skakning vid 37 ° c över natten. På nästa dag, tillsätt förrätt kulturen till en 1 L kolv som innehåller 500 mL färskt LB buljong medium (1/26 utspädning) med ampicillin och inkubera kulturen i shaker vid 37 ° c för 2 till 4 h.
-
Under inkubationstiden mäter du OD vid 600 Nm med en spektrofotometer. När bakteriekulturen når 0,6 OD-enheter vid 600 Nm, ta en 1 mL alikvot i en 1,5 mL tub som det icke-inducerade provet. Tillsätt 400 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till 1 L-kulturen för att inducera proteinuttryck. Inkubera bakterier vid 25 ° c i 6 h till över natten.
- Centrifugera 1 mL-aliquoterna vid 14 000 x g i 30 s, Kassera supernatanten, Omsuspendera pelleten i 200 μl av Laemmli-provbufferten och behåll för SDS-Page och Coomassie Blue-analys av protein induktion.
- Överför den inducerade bakteriekulturen från kolven till en ren centrifugering flaska och snurra på 3 500 x g i 15 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten med 40 mL kallt PBS och snurra på 3 500 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten och frysa pelleten vid-80 ° c eller Fortsätt till nästa steg. Om proteinerna induceras vid den förväntade molekylvikten, gå vidare till nästa steg.
- Omsuspendera bakterie pelleten i 25 mL iskall lyseringsbuffert a (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm pmsf, 0,5 mm DTT, och 1/100 anti-proteas cocktail innehållande AEBSF, aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, och Pepstatin A). Se till att alla bakterier pelleten är återsuspenderade. PMSF och anti-protease cocktail måste nyligen läggas till lyseringsbufferten, endast vid tidpunkten för bakteriens Lys.
Försiktighet: Håll alltid provet på is.
Anmärkning: Lysozym på 100 μg/mL kan tillsättas för att öka bakteriernas Lys. - Inkubera bakterierna lysate på is i 15 min. Använd en sond-sonikator och Sonikera vid 70% uteffekt amplitud för 30 s (4-5x), och sedan Centrifugera vid 21 000 x g för 20 min vid 4 ° c.
Försiktighet: Under ultraljudsbehandling, hålla alltid proverna på isen. - Under centrifugeringen, ta 500 μL packade GSH-aguppstod pärlor (50% slurry) i en 15 mL tub och tillsätt 10 mL buffert a utan PMSF och anti-proteaser. Blanda kort och snurra på 2 500 g i 3 min vid 4 ° c, upprepa detta tvätta steg två gånger och hålla pärlorna på isen.
- Efter bakteriell lysate centrifugering, samla supernatanten och överföra den till ett 50 mL koniskt rör. Ta en alikvot på 100 μL som totalt lysat och tillsätt 100 μL 2x Laemmli provbuffert för SDS-PAGE och Coomassie Blue Analysis.
- Filtrera lysatet genom filter på 0,45 μm pore-spruta och blanda det med GSH-pärlorna. Inkubera vid 4 ° c med skakning i 5 h. snurra ner pärlorna på 2 500 x g i 3 min, ta bort och spara supernatanten som flödet genom. Tvätta proteinerna-GSH bundna pärlor 6 gånger (5 mL vardera) med buffert A innehåller anti-proteas cocktail och PMSF.
- Efter den sista tvätten, överför pärlorna tillsammans med 10 mL buffert till en tom kromatografikolonn, tillsätt 1,5 mL buffert A som innehåller 25 mm glutation, och samla upp elueringen med tyngdkraften i 1,5 ml mikrotuber. Upprepa elutionsproceduren 4 gånger.
Anmärkning: Glutathione-lagerlösningen bereds vid 200 mM koncentration i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 - Ta en alikvot på 10 μL från var och en av de 4 elutionerna och tillsätt 10 μL 2x Laemmli-provbuffert. Dessa prover kommer att användas för SDS-PAGE och Coomassie blå analys för att bestämma förekomst och renhet av de renade proteiner.
Anmärkning: Efter den sista elueringen ska pärlorna förvaras i buffert vid 4 ° c för återvinning och framtida användning. - Välj den eluerade bråk som visar rimliga mängder av renade proteiner för vidare analys. Gör små alikvoter av preparatet. Förvara de renade proteinerna i-80 ° c. Vanligtvis, protein koncentrationen kommer att variera från 0,5 μg till 2 μg per μL och prover kan lagras i detta tillstånd.
- Valfritt: Koncentrera provet eller ändra bufferten med hjälp av en 10K centrifugalfilterenhet
2. rening av BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase Complex
- Använd pET30a +-his-BAP138 och PDEST-MBP-deubad (ASXL2)35 bakteriell Expression konstruktioner för att omvandla BL21 (de3) RIL bakterier för produktion av hans-BAP1 och MBP-deubad respektive.
- Utför två separata natt starter kulturer genom att ruinera his-BAP1 och MBP-DEUBAD (ASXL2) som uttrycker bakterier i 20 ml lb buljong av ampicillin medium innehållande 50 μg/ml kloramfenikol och motsvarande antibiotikum för varje plasmid, 100 μg/ mL kanamycin eller 100 μg/mL ampicillin. Placera på shaker vid 37 ° c.
- Utför steg 1.3 – 1.6.
-
Omsuspendera bakterien pellets i 25 mL iskall lysis buffert B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-merkaptoetanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF och 1/100 anti-protease cocktail). Blanda lika volymer av his-BAP1 med mbpen-deubad celllysat och inkubera på is för 15 min. Sonikera och centrifugera sedan lysatet som det indikeras i protokoll 1 (steg 9).
- Under centrifugering, Förbered 500 μL packade ni-NTA aguppstod pärlor (50% slurry) genom att tvätta dem tre gånger med buffert B utan PMSF och anti-proteas cocktail.
- Efter bakteriell lysate centrifugering, samla supernatanten och överföra den till ett 50 mL koniskt rör. Ta en alikvot på 100 μL som totalt lysat och tillsätt 100 μL 2x Laemmli provbuffert för SDS-PAGE och Coomassie Blue Analysis.
-
Filtrera lysatet genom filter på 0,45 μm pore-spruta och blanda det med ni-NTA-pärlorna. Inkubera vid 4 ° c med skakning i 5 h. snurra ner pärlorna på 2 500 x g i 3 min, ta bort och spara supernatanten som flödet genom.
- Tvätta pärlorna 6 gånger (5 mL vardera) med buffert B som innehåller 20 mm 1,3-diaza-2, 4-cyklopentadien (Imidazol).
Anmärkning: gör en stamlösning på 2 M Imidazol vid pH 7,3.
- Tvätta pärlorna 6 gånger (5 mL vardera) med buffert B som innehåller 20 mm 1,3-diaza-2, 4-cyklopentadien (Imidazol).
- Efter den sista tvätten, överför pärlorna med 10 mL buffert till en tom kromatografikolonn, tillsätt 1 mL buffert B som innehåller 200 mm Imidazol och samla upp elueringen med tyngdkraften i 1,5 ml mikrotuber som innehåller 10 μl dtt (500 mm) och 2 μl edta (500 mm , pH: 8). Upprepa elutionsproceduren 4 gånger. Ta 10 μL av varje elutionsfraktion och tillsätt 10 μL 2x Laemmli provbuffert för SDS-PAGE och Coomassie Blue Analysis. Pool den önskade eluerade fraktioner.
Anmärkning: Förvara pärlorna i buffert vid 4 ° c för återvinning och framtida användning. -
Späd den eluerade komplex 3 gånger med buffert C (50 mm Tris pH 7,3, 300 mm NaCl, 1% Triton X-100, 5 mm DTT, 1 mm EDTA, 1 mm PMSF, och 1/100 proteas inhibitor cocktail) före inkubering med och aguppstod pärlor.
- Förbered och aguppstod pärlor (500 μl packad) genom att tvätta dem 2 gånger med bufferten C utan att lägga PMSF och anti-proteas cocktail. Tillsätt pärlorna till den utspädda elueringen och inkubera över natten vid 4 ° c.
- Centrifugera vid 2 500 x g i 3 min och håll flödet genom. Tvätta proteinerna-bounds pärlor med 5 mL buffert C (5 – 6x).
- Håll den renade his-BAP1/MBP-deubad Complex på och agaros pärlor i buffert D (50 mm Hepes pH 8,0, 50 mm NaCl, 10% glycerol och 1 mm DTT) och förvara vid-80 ° c. Ta 20 μL av pärlfraktionen (50% pärlor lösning) och tillsätt 20 μL 2x Laemmli provbuffert för SDS-PAGE och Coomassie Blue Analysis.
3. rening av Nukleosomer från HEK293T celler
- Culture HEK293T celler i komplett Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 5% nyfödda kalv serum (NBS), 2 mM L-glutamin, och 1% penicillin/streptomycin.
- Tallrik runt 12 x 106 HEK293T celler i 20 ml komplett Media per 15 cm kultur rätt en dag före transfektion (10 rätter användes). Före transfektion, ändra cellens medium till 12 mL av serumfritt medium och transfect cellerna med 21 μg pCDNA-Flag-H2A med 63 μl polyetylenimin (PEI) vid 1 mg/mL36. Byt till komplett medium 12 h senare.
- Tre dagar efter transfektion, tvätta cellerna med 15 mL iskall PBS (två gånger) och skörda dem i 3 mL iskall PBS med hjälp av en cell skrapa. Centrifugera vid 2 100 x g i 8 min vid 4 ° c. Kassera PBS och fortsätt till Lys-steget eller frys cellpelleten vid-80 ° c.
- Omsuspendera cellpelleten i cirka 10 volymer buffert E (50 mm Tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm mgcl2, 1 mm PMSF, 1/100 proteas inhibitor cocktail, och 20 mm av N-metylmaleimide (Nem)) och inkubera på is under 20 min. lägga till N-metylmaleimid (NEM) är avgörande för att hämma DUBs som co-purify med nukleosomer.
-
Efter centrifugering vid 3 000 x g i 5 min, Kassera supernatanten och Omsuspendera kromatinpelleten i 10 volymer buffert E. Blanda genom inversion och centrifugera vid 3 000 x g i 5 min.
- Upprepa tvättsteget en annan gång med hjälp av buffert E och två gånger med hjälp av buffert F "mnase buffert" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCL, 2 mm mgcl2, 1 mm CaCl2, 0,3 M sackaros, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF, och 1/100 proteashämmare cocktail).
Varning: pellets kommer att flyta under tvättar och centrifugering.
- Upprepa tvättsteget en annan gång med hjälp av buffert E och två gånger med hjälp av buffert F "mnase buffert" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCL, 2 mm mgcl2, 1 mm CaCl2, 0,3 M sackaros, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF, och 1/100 proteashämmare cocktail).
- Omsuspendera kromatin i 5 mL buffert F och behandla pelleten med micrococcal Nuclease (mnase) (3 U/ml för 10 min vid rumstemperatur).
Anmärkning: Reaktionen kan vara hjälpt genom att blanda med en Dounce Homogenisatorer. -
Efter inkubering, ta en 40 μL alikvot av blandningen för analys av nukleosomala DNA-fragment. Blanda denna alikvot med 40 μL fenol/kloroform och 20 μL 6x DNA-lastbuffert, Vortex, snurra på 18 000 x g i 2 min, och ladda DNA på en 2% aguppstod gel.
- När DNA är övervägande en 147 BP fragment som motsvarar mononukleosomes, stoppa reaktionen genom att tillsätta 5 mM EDTA vid slutlig koncentration.
- Efter centrifugering vid 21 000 x g i 20 minuter vid 4 ° c, inkubera den lösliga kromatin fraktionen med anti-Flag harts över natten vid 4 ° c. Tvätta pärlorna med 6x buffert G (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 5 mm edta, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 proteashämmare cocktail).
- Överför pärlorna med 5 mL buffert G till en tom kromatografikolonn. Eluera de pärlbundna nukleosomerna med 200 μg/mL flagg elueringpeptid. Använd en elutionsbuffert som består av buffert G som innehåller 200 μg/ml flagga elutionspeptider (se tabell över material) och 1/5 (VOL: VOL) 1 M Tris, pH 8,0. Eluera nukleosomerna 3x med 260 μL flagga Elutionsbuffert (2 h varje eluering).
- Testa de 3 elutioner genom att ta en alikvot för fenol-kloroformextraktion och ladda DNA i en 2% aguppstod gel. Ta 10 μl av varje elutionsfraktion och tillsätt 10 μl laemmli-provbuffert 2x för SDS-Page och Coomassie Blue-analys och ladda varje eluering för Western blot-detektion av och H2A. Förvara elueringen vid-80 ° c. I allmänhet ger rening från mänskliga celler mindre mängd proteiner än bakterier, med koncentrationer som sträcker sig från 0,1 till 0,5 μg/μL.
4. nukleosome Ubiquitination assay med BMI1/RING1B E3 ubiquitin Ligase Complex
- Centrifugera nukleosomerna genom 10K pore 0,5 mL centrifugalfilter för att ändra substratet från elutionbufferten till reaktionsbufferten H (25 mm Tris, pH 7,5; 10 mm mgcl2och 5 mm ATP). Alternativt kan kommersiellt tillgängliga nukleosomer användas för analysen.
Anmärkning: Byte av substrat upphängnings lösning till reaktionsbuffert säkerställer reproducerbarhet och förebygger potentiell E3-ligashämning genom föreningar som finns i flaggans elueringblandning. - Inkubera 1 μg av nukleosomerna i 40 μL total volym av buffert H. Tillsätt UB-aktiverande enzym (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) och E2 UB-konjugationsenzymer (672 ng) och 1 μg BMI1/RING1B E3 ubiquitin Ligase Complex. Inkubera reaktionen i 3 h vid 37 ° c med enstaka skakningar.
Anmärkning: Flera kontroller kan utföras parallellt inklusive utelämnande, E1, E2, E3, ATP och ubiquitin. Detta säkerställer specificiteten för ubiquitination reaktionen. - Stoppa reaktionen genom att tillsätta 40 μl av 2x laemmli prov buffert och analysera Histon H2A K119 ubiquitination av SDS-Page och Western blotting, enligt standardprocedurer. Använd antingen anti-H2A eller anti-H2A K119ub antikroppar (se tabell över material).
5. in vitro-Nukleosomalt H2A DUB-analys med BAP1/DEUBAD
- Använd de renade nukleosomerna för den in vitro-deubiquitination analysen. Omsuspendera 100 – 500 ng av nukleosomer i 40 μL buffert i (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 1 mm mgcl2, 50 mm NaCl och 1 mm DTT). Tillsätt 1 μg BAP1 bakterier-renas hans-BAP1 och MBP-DEUBAD. Utför den deubiquitination reaktionen för 3 h vid 37 ° c med tillfällig skakning.
- Stoppa in vitro-reaktionen genom att tillsätta 40 μL av 2x Laemmli buffert och analysera genom Immunoblotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GST-BMI1 och RING1B proteiner är väl producerade i bakterier och kan lätt extraheras i den lösliga fraktionen. Figur 1a visar en Coomassie Blåfärgning för en typisk rening av den gst-BMI1-RING1B komplex. GST-BMI1 och RING1B band migrerar vid förväntad molekylvikt, ~ 45 kDa och ~ 13 kDa respektive. Särskilt E3 Ligase Complex är mycket homogen med mycket låga nivåer av bakterier proteiner föroreningar och/eller nedbrytningsprodukter. Dessutom är stökiometrin av det renade komplexet optimalt, som med en molar förhållande på 1:1, är bandet intensiteten av GST-RING1B protein förväntas vara två till tre gånger starkare än BMI1. Likaså resulterade rening av hans-BAP1/MBP-DEUBAD Complex också i relativt mycket homogena preparat med band på ~ 90 kDa och ~ 55 kDa, respektive (figur 1b). Tandem affinitet rening av BAP1 och DEUBAD, genom nickel-Agreste och amylose-Agreste respektive säkerställer och adekvat stökiometri och avlägsnande av fri BAP1 från det renade komplexet. Å andra sidan består den renade nukleosomala fraktionen i huvudsak av 147bp-band som indikerar närvaron av höganrikat mononukleosomalt bråk (figur 1c). Coomassie Blue färgning av dessa renade nukleosomer visar ett typiskt band mönster av de fyra Histon subenheter med stökiometriska mängder (figur 1d). Kommersiellt tillgängliga rekombinanta mononukleosomes uppvisar också liknande protein-och DNA-mönster när de migreras på SDS-PAGE respektive aguppstod geler. Notera, monoubiquitinated former av H2A och flagga-H2A kan lätt särskiljas på HEK293T-renade nukleosomer. Vi använde rekombinanta nukleosomer tillsammans med E1/E2/ubiquitin/ATP och observerade att ubiquitination av Histon H2A med BMI1-RING1B Complex visar en tidsberoende ökning av den ubiquitinerade formen av proteinet, medan halterna av den icke-modifierade formen är minskade samtidigt. Den ubiquitination reaktionen är total, som praktiskt taget alla H2A proteiner omvandlas till H2A K119ub (figur 1e). Å andra sidan, deubiquitination analysen utfördes på inhemska nukleosomer. Efter inkubering av dessa nukleosomer med BAP1/DEUBAD observerade vi en tidsberoende minskning av H2A K119ub signal (figur 1f). Observera att två band av och H2A observerats med anti-H2A K119ub motsvarar transfekterade flagga-H2A och endogena H2A migrera på ~ 30 kDa och ~ 25 kDa band respektive.
Figur 1: rening, ubiquitination och deubiquitination. (A) rening av gst-RING1B-BMI1 proteiner och analys med hjälp av Coomassie Blåfärgning. GST-RING1B-BMI1 producerades i bakterier och renas med hjälp av GST affinitetspärlor. För att bekräfta rening renhet och proteiner storlek, elutioner lastades på 15% SDS-PAGE gel och färgas med Coomassie blå. Olika mängd BSA används för att bestämma proteinkvantiteten. Den färgade gelen skannades för att generera figuren. Brening av MBP-deubad/his-BAP1 Complex. MBP-DEUBAD och HIS-BAP1 producerades separat i bakterier. Efter Lys, var MBP-DEUBAD och hans-BAP1 blandas och renas med hjälp av nickel och maltos pärlor. Den renade komplexet lastades på 8% SDS-PAGE gel och färgas med Coomassie Blue. Crening av mononukleosome efter behandling med mnase. Kromatin från HEK293T uttrycker pcDNA. 3 flagga-H2A extraherades och behandlades med MNase att generera och rena mononukleosomes. För att bekräfta uppkomsten av mononukleosome, en bråkdel av kromatin togs för fenol kloroform extraktion och detektering i UV-ljus. Lastning på 2% aguppstod gel avslöjar en typisk 147 bas-par DNA-fragment indikativt för mononukleosome. D) renade mononukleosomer användes för Coomassie Blue-färgning. E) in vitro-ubiquitination av nukleosomer. Rekombinanta nukleosomer inkuberades vid 37 ° c med bakterien renad E3 ubiquitin Ligase dimer, GST-RING1B/BMI1 och E1/E2/ATP/ubiquitin, för de angivna tiderna. H2A monoubiquitination (H2A K119ub) analyserades av Western blotting. (F) deubiquitination assay av H2A K119ub med hjälp av BAP1/deubad deubiquitinase Complex. In vitro-deubiquitination analyser utfördes med hjälp av bakterier renas hans-BAP1/MBP-DEUBAD och däggdjur renade nukleosomer. Reaktionerna utfördes för de åtalade tiderna och analyserades av Western blotting. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kontroller och översikt av protokollet. (A) renat DÄGGDJURS BAP1 eller dess katalytiska döda Mutant (C91S) samt bakterier-renade REKOMBINANTA BAP1 användes för H2A deubiquitination på nukleosomer. Nukleosomer som inkuberats med enbart buffert eller med elutioner erhållna från mock-rening ingick också som kontroller. (B) BAP1 inte deubiquitinate H2A K13/K15 vars ubiquitination medieras av RNF168 E3 Ligase. HEK293T celler var Co-transfected med antingen H2A K13R/K15R eller H2A K118R/K119R tillsammans med RNF168 för att säkerställa ubiquitination på K13/K15 rester. De renade nukleosomerna användes för deubiquitination av BAP1 komplexen. Reaktionen stoppades vid olika tidpunkter och utsattes för Immunoblotting. Crening av icke-ubiquitinerade och monoubiquitinated deubad i komplex med BAP1 från däggdjursceller. Det renade komplexet användes för deubiquitination test på nukleosomal H2A K119ub. Reaktionerna utfördes för de indikerade tid punkterna och analyserades av Western blotting. D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. HEK293T celler var Co-transfected med H2A eller H2A mutanter (H2A K118R, K119R, K118R/K119R eller K13R/K15R) tillsammans med BAP1 och ASXL2 konstruktioner. Två dagar efter transfektion, celler skördades för Immunoblotting med hjälp av de angivna antikropparna. E) schematisk representation av försöks arbetsflödet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera fördelar med att etablera robusta in vitro ubiquitination och deubiquitination analyser för proteiner av intresse. Dessa analyser kan användas för att: (i) fastställa optimala förhållanden och definiera minimala krav för dessa reaktioner, (II) bestämma enzymatiska kinetiska och biokemiska konstanter, (III) definiera rollerna för kofaktorer eller hämmare som kan påverka dessa reaktioner, (IV) identifiera interaktions gränssnitt, (v) testa effekterna av artificiella eller sjukdomsassocierade mutationer och (vi) fastställa villkor för analysen som kan användas vidare för att utveckla hög genomströmning kemiska screening analyser. Här, vi exemplifiera dessa analyser genom att beskriva hur vi utför BMI1/RING1B-medierad H2A ubiquitination och BAP1/ASXL-medierad H2A deubiquitination på nukleosomala substrat.
Den ubiquitination av Histon H2A kan återfått in vitro med minimala komponenter, som nästan fullständig ubiquitination av H2A kan observeras med BMI1-RING1B komplex. Observera att denna reaktion utförs på rekombinanta nukleosomer. Dessa har fördelen av att vara fri från andra histoner post-translationella modifieringar som förekommer i däggdjursceller. Icke desto mindre, den ubiquitination reaktionen kan också effektivt utföras på inhemska nukleosomer. Om den ubiquitination reaktionen är svag, förhållandet mellan enzymer kontra substrat kan ökas för att iaktta optimal ubiquitin ligering. Notera, om deubiquitination reaktioner eller interaktion analyser ska utföras efter substrat ubiquitination, sedan ubiquitination kan direkt utföras på pärlor-bundna substrat. Det ubiquitinerade substratet kan återvinnas genom pull-down och supernatanten som innehåller komponenterna i den ubiquitination reaktionen kan kasseras. När enzymatiska egenskaper skall fastställas måste emellertid enzymerna elueras och stökiometrin för komponenterna utvärderas genom kromatografi av storleks undantaget.
Den deubiquitination reaktionen kräver mindre komponenter än den ubiquitination reaktionen. Rening av DEUBAD ensamt leder dock i allmänhet till protein nederbörd. Viktigt, när DEUBAD renas med BAP1, detta ökar kraftigt dess löslighet. Notera, vi föreslår att bedriva deubiquitination analyser med olika mängder av substrat och enzymkomplex. Den deubiquitination reaktionen kan hämmas av överskjutande mängder av kromatin, som kan förmodligen förklaras av ökade koncentrationer av hämmare i samband med nukleosomer. Vi observerade också deubiquitination med överskott av gratis BAP1. Därför måste flera kontroller inkluderas såsom inkuberande nukleosomer med enbart BAP1 (figur 2A). Det är också viktigt att notera att vissa DUBs kan Co-purify med kromatin, och även om vi behandlar kromatin med NEM, DUBs kan delvis reaktiveras efter tillsats av DTT som minskar den katalytiska cystein. Dessutom kan metalloproteinas dubs också förekomma, och dessa enzymer är okänsliga för Nem och är därmed inte hämmade. Därför bör ytterligare kontroller inkluderas som endast består av nukleosomer utan tillsats av enzymer och DUB katalytisk död Mutant (figur 2A). Notera, specificiteten av BAP1 DUB aktivitet mot H2A K119ub är väl dokumenterad och validerats i våra assay villkor. Vi renas från HEK293T celler nukleosomes uttrycker antingen H2A K118/K119R eller H2A K13/K15R. Uttryck för RNF168 leder till en viktig ubiquitination på K13/K15. BAP1 DUB aktivitet observeras endast på nukleosom innehåller H2A K13/K15R motsvarande H2A K119ub (figur 2b). En annan faktor är att posttranslationella modifieringar som kan vara kritiska för enzymatisk aktivitet sannolikt inte kommer att förekomma i bakteriella proteiner. Därför kan in vitro -reaktioner med hjälp av komponenter som renas från däggdjursceller också övervägas35. Till exempel, monoubiquitination av DEUBAD, en process som observerats i högre Eukaryoter, kraftigt främja deubiquitinase aktivitet BAP135 (figur 2C). Därför kan rening av komponenter från däggdjursceller också övervägas. Förutom in vitro-reaktioner, är det möjligt att övervaka BAP1 DUB aktivitet direkt i celler efter transfektion. Till exempel, transfektion av HEK293T celler med H2A konstruera kan ge en tydlig signal om H2A K119ub på grund av dess överflöd i celler. I dessa villkor, de flesta av de ubiquitination händer på K118/K119 rester, som mutation av dessa platser till arginin leda till fullständig avsaknad av H2A ubiquitination (figur 2D). Co-uttrycker BAP1 och ASXL2 tillsammans med H2A gör det möjligt att dra slutsatsen om BAP1 DUB aktivitet i celler. Flera punkter måste dock betraktas som överuttryck kan leda till felaktiga resultat. Därför måste dessa experiment optimeras och kontrolleras väl.
Sammanfattnings, de protokoll som beskrivs här, återfått i figur 2e, är enkla, inte kräver en specialiserad infrastruktur eller experimentell installation, och kan skalas upp för att producera betydande mängder av modifierade nukleosomer för flera tillämpningar nedströms inklusive enzymatiska analyser, masspektrometri och protein-protein interaktions analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Diana Adjaoud för teknisk assistans. Detta arbete stöddes av bidrag från naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) och genom Canada (2016-2019) till E.B.A. E.B.A. är en senior lärd i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M och N.S.K. har ett doktorandstipendium från FRQ-S. H. B hade ett doktorandstipendium från ministeriet för högre utbildning och från vetenskaplig forskning i Tunisien och stiftelsen Cole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
References
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A.
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M.
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B.
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
