Summary
여기서, 우리는 KDM1A 억제물로 처리된 인간 또는 동물 세포, 조직 또는 혈액 샘플에서 KDM1A 표적 결합을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 무료 KDM1A 효소의 화학 프로브 태깅및 화학 프로브 기반 면역 검술을 사용하여 표적 직업의 직접 정량화를 채택하고 전임상 및 임상 연구에서 사용될 수 있습니다.
Abstract
표적 참여의 평가는, 그것이 디자인된 단백질과 약의 상호 작용으로 정의되고, 약 개발 또는 기초 연구 프로젝트에서 어떤 화합물든지의 생물학 활동의 해석을 위한 기본적인 필요조건입니다. 후성 유전학에서, 표적 약혼은 표적에 화합물의 결합을 측정하는 대신 프록시 마커의 분석에 의해 가장 수시로 평가됩니다. 분석된 다운스트림 생물학적 판독은 히스톤 마크 변조 또는 유전자 발현 변화를 포함한다. KDM1A는 유전자 발현의 침묵과 관련된 변형인 모노-및 디메틸화된 H3K4로부터 메틸기를 제거하는 리신 데메틸라제이다. 프록시 마커의 변조는 조사된 세포의 유전적 구성의 세포 유형 및 기능에 의존하며, 이는 해석 및 교차 사례 비교를 매우 어렵게 만들 수 있다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 직접 KDM1A 표적 참여의 투여 량 효과 및 역학을 평가하기 위한 다목적 프로토콜이 제시된다. 기재된 분석시험은 KDM1A 화학프로브를 사용하여 억제되지 않은 효소를 포착하고 정량화하고, 유전자 변형없이 세포 또는 조직 샘플에 광범위하게 적용될 수 있으며, 우수한 검출 창을 가지며, 기초 연구에 모두 사용될 수 있습니다. 임상 샘플의 분석.
Introduction
리신 특이적 데메틸라제 1(KDM1A)은 유전자 전사의 조절에 관여하는 데메틸라제이다. 이 단백질은 종양학에서 후보 약리학적 표적 2로 나타났다; 급성 골수성 백혈병을 포함3 (AML), 골수 형성증 증후군 (MDS)4,골수 섬유증 (MF)5,6,소세포 폐암 (SCLC)7; 겸상적혈구 (SCD)8,9,및 알츠하이머 병 (AD), 다발성 경화증 (MS)을 포함한 중추 신경계 질환에서; 그리고 침략10.
임상 개발에서 KDM1A 억제 화합물의 대부분은 사이클로프로필라민 유도체이며 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD) 보조인자(FAD)에 공유 결합함으로써 단백질을 억제한다. KDM1A의 억제는 유전자 발현 변경을 유도합니다, 그러나 이 변경은 조직, 세포 모형, 또는 질병 케이스에 걸쳐 엄청나게 변화합니다. KDM1A의 억제는 또한 히스톤마크(12)를 변화시지만, 이러한 변화는 일반적으로 게놈내의 특정 부위에서 국소적으로 생성되고, 다시, 고도로 조직 및 세포 특이적이다.
이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하기 위해 개발되었으며 사이클로프로필라민 유래 억제제와 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 상기 분석은 ELISA 기술을 기반으로 하고, 고체 상 분석에서 생물학적 시료로부터의 네이티브 단백질 추출물에서 총 및 자유(즉, 억제제에 의한 언바운드) KDM1A를 병렬로 분석한다. 첫 번째 단계로서, 생물학적 시료는 생물학적 KDM1A 선택적 화학프로브 OG-88113,14,선택적 KDM1A 억제제 ORY-1001(iadademstat) 임상에서 KDM1A의 강력한 억제제로부터 유래된 생체질화 된 KDM1A의 존재로부터 용해된다. 종양학 질환의 치료를위한 개발. 상기 화학프로브는 120 nM의 KDM1A에 대한 IC 50을 가지며, 생체연화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-꼬리에 연결된 FAD 결합 모티프를 포함한다. 화학 프로브는 자유 KDM1A에 독점적으로 결합하지만, 샘플내의 억제제 결합 KDM1A에는 결합하지 않는다. 화학 프로브 결합 후, 샘플에 복합체를 포함하는 KDM1A는 스크렙타비딘 코팅 표면이있는 마이크로 티터 플레이트에서 포착되어 무료 KDM1A를 결정하거나 단일 클론 안티 KDM1A 캡처 항체로 코팅된 플레이트에서 총 KDM1A를 결정합니다. 세척 후, 두 플레이트는 항 KDM1A 검출 항체로 배양되고, 다시 세척하고, 상대적 측정에 의해 발광 기질 및 정량화를 사용하여 검출을 위한 이차 HRP-컨쥬게이트 당나귀 반토끼 IgG 항체로 배양 광도계(그림 1)에서 라이트 유닛(RLU)을 표시합니다.
그림 1. ELISA 효소의 스키마 는 KDM1A 표적 결합을 위한 화학프로브 면역흡수제 분석과 연결: A) 샌드위치 ELISA 및 B를 이용한 총 KDM1A의 측정체ELISA를 이용한 자유 KDM1A의 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표준 곡선은 각 분석법의 선형성을 확인하기 위해 두 ELISA 플레이트에 포함되어 있습니다. 각 샘플에서 KDM1A 표적 결합의 측정은 사전 투여량 또는 비구시 처리 샘플에 대한 상대값으로 계산된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
혈액 샘플은 스페인 법률 (Real Decreto de Biobancos 1716/2011)에 따라 인스티투토 드 Investigación Biomédica Sant Pau Biobank에서 얻어졌으며 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물 조직을 사용한 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되었습니다(유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)에서 동물 실험 윤리위원회가 수립했습니다. PRAAL-PCB.
1. 분석에 대한 생물학적 샘플의 제조.
주의: 이 프로토콜은 산업 안전 보건 국 (OSHA) 혈액 매개 병원균 표준 (29 CFR 1910.1030), 유럽 의회의 지침 2000 / 54 / EC를 실시 할 수있는 생물학적 샘플의 조작을 포함합니다. 2000년 9월 18일 협의회 또는 이에 상응하는 규정. 또한, 생물학적 샘플은 생물학적활성 연구적 화학 화합물의 흔적을 포함할 수 있으며 프로토콜은 이러한 화합물의 추가 조작을 수반할 수 있다. 실험 개시 전에 사용된 화합물의 안전 데이터 시트(SDS)를 검토하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)의 사용을 포함하여 연구 센터에 수립된 모든 적용 가능한 안전 조치를 엄격히 준수하십시오. 적절한 보호복을 착용하고 실험 중에 적절한 차폐를 사용하십시오. 적절한 폐기물 용기(생물학적/세포독성 폐기물)에 잔류물을 버리십시오.
참고 : 이 프로토콜은 KDM1A 억제제와 치료되지 않은 비무장 또는 비위약치료 대조군3으로 처리 된 피험자의 세포 또는 샘플로 시작됩니다.
- 비위 또는 KDM1A 억제제로 처리된 세포
- 현탁액에서 성장한 세포의 경우, 10 mL 배양으로서, 현탁액을 깨끗한 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 1.1.3으로 진행한다.
- 부착 세포(75 cm2 플라스크에서 자란)의 경우 플라스크에서 배지를 제거하고 4 mL PBS를 사용하여 간단히 씻습니다. 2 - 5 분 동안 0.5 % 트립신 -EDTA의 1.5 mL을 사용하여 혈관에서 세포를 분리 (트립시네이징 조건은 다를 수 있습니다, 세포주에 대한 공급자권장 사항을 따르십시오), 4 mL PBS를 추가하고 깨끗한 15 mL 원추형 튜브로 세포를 옮김.
- 벤치 상단 원심분리기에 튜브를 삽입하고 4 °C에서 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 상급체를 제거하고, 마이크로파이펫을 사용하여 분배된 PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하고 현탁액을 1.5 mL 마이크로원지 지 튜브로 옮김을 옮김.
- 샘플을 마이크로튜브 원심분리기에 삽입하고 4°C에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로파이펫으로 흡인하여 PBS를 제거하고 펠릿을 얼음 위에 유지하고 2단계로 진행; 또는 드라이 아이스에 펠릿을 동결하고 3 단계까지 -80 °C에서 저장합니다.
- 비동/위약 또는 KDM1A 억제제로 치료받은 피험자 또는 동물의 샘플
- 조직: 메스를 사용하여 조직을 작고 1cm 3개로 자릅니다. Dewar 용기에 액체 N2에 티슈 조각을 동결하고 3 단계까지 -80 °C에서 저장합니다.
- 다형성 혈액 단핵 세포 (PBMC): 50 mL 원추형 튜브에서 2 부피의 PBS를 가진 K 2-EDTA 관에서 수집된 신선한 혈액 (혈액 금단 후 과정 최대 2 시간)의 10 mL을 희석합니다. 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 얻은 PBMC 분리 튜브를 사용하여 혈액으로부터 PBMC를 분리합니다. 얼음에 펠릿을 유지하고 단계로 진행 3.2; 또는 드라이 아이스에 펠릿을 동결하고 3 단계까지 -80 °C에서 저장합니다.
참고: 20~50 μL의 젖은 세포 펠릿에는 세포 크기에 따라 1 x 107 세포가 들어 있습니다. 건강한 인간의 혈액의 10 mL로부터 얻은 젖은 PBMC 펠릿은 20 μL의 부피를 가지며 □ 1 x 107 PBMC를 함유하고 있습니다.
2. 솔루션 준비
- 2 μM OG-881 작업 용액 준비: 4°C 냉장고에서 20mMMM 바이오티닐프로브 OG-881 스톡 솔루션의 10μL 일회용 aliquot를 꺼내 실온(RT)에 10분 간 방치하십시오. PBS에서 이온, 필터 팁과 마이크로 파이펫을 사용하여 다른 희석 단계 사이의 팁을 변경.
- 프로테아제 억제제 10배 준비: 1 mL PBS에 1정을 마이크로원심지 튜브에 녹입니다.
- 25 nM OG-881 화학 프로브로 1x 세포 용해 완충액의 원하는 부피를 준비합니다. 각 mL에 대해, 상업적으로 얻은 100 μL 10x 세포 용해 완충제, 10x 프로테아제 억제제의 150 μL, 2 μM OG-881의 12.5 μL, 및 타입 1 이중 증류수의 737.5 μL을 혼합합니다.
- 선택적으로 1x 셀 용해 버퍼의 원하는 볼륨을 준비하지만 25 nM ORY-1001 대신 OG-881 단계 2.3에서와 같이. 덜 강력한 억제제는 사용될 수 있지만 100% 억제와 양성 대조군에서 사용하기 위해 더 높은 농도를 요구할 수 있다(3.5단계 참조).
참고: OG-881 또는 KDM1A 억제제 재고 용액으로 솔루션 또는 시료의 의도하지 않은 오염을 방지하기 위해 적절한 조치를 취하십시오. 25 nM OG-881로 1x 셀 용해 완충액의 원하는 부피를 계산하려면 분쇄 된 조직의 40 mg당 400 μL 또는 107 셀의 젖은 펠릿 당 200 μL이 필요하다고 가정하십시오.
3. 네이티브 단백질 추출
- 조직에서:
- 몰타르와 유봉 건조 얼음에 냉각 냉동 조직의 1cm3 큐브를 분쇄하고 균질화. 40 mg의 조직 분말을 함유한 일회용 바이알에 샘플을 Aliquot, 항상 해동을 피하십시오. 3.1.2 단계로 진행합니다. 즉각적인 처리 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
- 25 nM OG-881, 10 s의 와류를 가진 1x 세포 용해 완충제의 400 μL에 가루 조직의 40 mg을 다시 중단하고, 조직의 용해가 달성될 때까지 18 게이지 무딘 주사기 바늘을 통해 적어도 5 번 샘플을 강제로 오렌지 현탁액에 혼탁한 밝은 노란색 얻은. 거품 형성을 피하십시오.
- 3.3단계로 계속
- 세포 펠릿 (PBMC 및 세포주)에서:
- 25 nM OG-881을 함유하는 1x 세포 용해 완충제의 200 μL에서 1 x 107 세포의 펠릿을 다시 중단한다. 샘플을 간략하게 소용돌이치며 5분 동안 얼음위에 보관합니다.
- 45 kHz에서 각각 20 s의 3 펄스를 사용하여 초음파 처리기에서 샘플을 초음파 처리; 펄스 사이에 20 s를 위해 얼음에 놓습니다.
참고: 생물학적 샘플이 1x 세포 라시스 버퍼에서 재중단되자마자, 나머지 과정 동안 얼음 위에 보관하십시오.
- 샘플을 얼음 위에 5분 간 간략하게 보관하고 4°C에서 미리 냉각된 원심분리기에서 14 000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.
- 1 mL 마이크로 파이펫을 사용하여, 신선한 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 슈퍼 나탄제를 전송하고 2 시간 동안 얼음에 둡니다. 4 단계로 계속.
- 선택적으로 100% 목표 참여를 시뮬레이션하는 포지티브 컨트롤은 다음과 같이 준비될 수 있습니다.
- 25 nM ORY-1001로 1x 세포 용해 완충액의 필수 부피에서 비히클 또는 미처리(predose) 샘플로부터 세포 펠릿 또는 분말 조직을 재중단하고 단계 3.1 에서 3.3에 설명된 대로 처리한다.
- 양성 대조군을 신선한 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮기고 1 시간 동안 얼음에 두어 1 시간 ORY-1001고의도적으로 KDM1A를 억제하고 화학 프로브 결합을 차단합니다.
- 양성 대조물 (40 mg 조직 샘플에서 생성 된 양성 제어를위한 부피) 또는 2 μM OG-881 작업 용액의 2μL (107-cell 샘플에서 생성 된 양성 제어를위한 부피)에 5 μL의 2 μL을 추가하십시오. 다른 샘플과 동일한 OG-881 농도를 2 시간 동안 얼음에 둡니다.
4. 브래드포드 분석서를 이용한 기본 단백질 정량화
- 시판된 브래드포드 단백질 분석 시약을 H2O 타입 1 이중 증류수로 5회 희석한다. 샘플 및 표준의 총 양에 필요한 시약의 부피를 계산합니다(샘플당 1mL 또는 표준 + 5mL 초과 부피).
- 소 혈청 알부민 (BSA) 표준 곡선의 경우, 희석 된 브래드 포드 단백질 분석 액 (빈)과 희석 된 브래드 포드 단백질 분석 액의 995 μL로 7 개의 마이크로 원심 분리튜브가있는 1 개의 미세 원심 분리튜브를 준비하십시오. BSA 표준(125~2,000 μg/mL에 이르는 농도)의 각각을 7개의 미세원심지 튜브각각에 5 μL을 추가하고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 희석된 표준을 큐벳으로 옮기고 280 nm의 분광광도계에서 빈 및 소 혈청 알부민 표준 샘플의 OD를 읽습니다.
- 생물학적 시료의 경우, 1mL희석된 브래드포드 단백질 분석액(빈)과 희석된 브래드포드 단백질 분석시약의 999μL을 가진 많은 마이크로원심분리튜브를 정량화해야 하는 시료로 준비합니다. 자동 P2 마이크로파이펫을 사용하여 3단계에서 제조된 기본 단백질 추출물 1 μL을 각 미세원심지 튜브에 넣고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. RT에서 샘플을 5 분 동안 배양합니다.
- 280 nm의 분광광도계에서 시료의 OD를 큐벳으로 전송하고 읽습니다.
- 우선적으로, 즉시 5단계로 진행하십시오. 또는, 5단계까지 천연 단백질 추출물을 -80°C에서 저장한다. 동결 해동 주기를 피하십시오.
5. 총 및 무료 KDM1A 결정을위한 발광 ELISA
참고: 실험실 온도를 23-24°C(RT)로 일정하게 유지하십시오.
- 캡처 KDM1A 항체 또는 스트렙타비딘으로 마이크로티터 플레이트 코팅
- 총 KDM1A ELISA: 각 플레이트에 대해, PBS에서 2 μg/mL의 최종 농도로 KDM1A 포획 항체의 10 mL을 준비한다. 접시의 각 우물에 100 μL을 옮김.
- 무료 KDM1A ELISA: 각 플레이트에 대해 PBS에서 10 μg/mL에서 스트렙타비딘 10 mL을 준비합니다. 접시의 각 우물에 100 μL을 옮김.
- 토탈 및 프리 KDM1A ELISA 플레이트를 접착제 필름으로 밀봉하고 냉장고에서 4°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
- 플레이트 세척 및 차단
- 냉장고에서 접시를 꺼내서 사용하기 전에 RT에서 약 45 분 동안 평형 상태로 두십시오.
- 플레이트당 1,000 mL 세척 버퍼(PBS의 0.1% 트웬트)와 50 mL 블로킹 버퍼(PBS에서 1% BSA)를 준비합니다.
- 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척하십시오. 이 단계와 후속 단계에서, 잔류 용액을 제거하기 위해 모든 세척 단계 후 종이 타월에 접시를 누릅니다.
- 두 플레이트에 웰당 200 μL의 블로킹 버퍼를 추가하고, 두 플레이트를 접착제 필름으로 최상밀봉하고 RT에서 2시간 배양합니다.
- 생물학적 시료 제제
- 3단계 말단에서 얻은 기본 단백질 추출물을 PBS를 이용하여 적절한 농도로 희석시켰다. 권장 농도는 생물학적 샘플에서 KDM1A 발현 수준의 기능에서 달라질 것이다. 적절한 범위의 예로는 (1) 세포 펠릿: 웰당 0.5- 10 μg. (2) PBMC: 5 - 30 μg 당. (3) 분쇄 된 조직 (뇌, 폐, 피부): 20 - 100 μg 당 잘. 준비 하는 동안 얼음에 샘플을 유지 합니다. 가능하면 기술 삼중 샘플 분석을 실행합니다.
- 휴먼 rKDM1A를 사용하여 표준 곡선 준비:
- KDM1A 표준 작업 용액을 준비하려면 25 pg/μL의 최종 농도에 대해 적절한 부피의 rKDM1A를 파이펫하고, 2 μM OG-881의 75 μL을 추가하고, 1x PBS를 15mL 팔콘 튜브에서 총 부피 6mL에 완료합니다. KDM1A 표준 작동 용액을 1시간 동안 얼음 위에 유지하고 20분마다 15mL 팔콘 튜브를 여러 번 반전시켜 용액을 부드럽게 혼합합니다.
- 표 1(표준 준비)에 따라 1.5mL 마이크로원심분리튜브로 KDM1A 표준 희석 시리즈를 준비하여 2개의 96웰 마이크로티터 플레이트의 삼중 분석을 위해 충분한 부피를 제공합니다.
| 표준 시리즈 | KDM1A 표준 작업 솔루션(μL) | |
| (pg KDM1A/웰) | PBS(μL) | |
| 2500 : C-* | 800 | - |
| 2500년 | 800 | - |
| 1750년 | 560 | 240개 |
| 1250년 | 400개 | 400개 |
| 750명 | 240개 | 560 |
| 250개 | 80 | 720 |
| 25개 | 8개 | 792년 |
| 0 | 0 | 800 |
| 참고: | ||
| (1) 각 희석의 부피는 분석의 삼중판에서 실행하기에 충분하다. | ||
| (2) 권장 범위는 2.5에서 5,000 pg / 웰 사이입니다. | ||
| * 음성 대조군 C-KDM1A 검출 항체가 없는 경우 | ||
표 1: 표준준비. KDM1A 단백질의 표준 시리즈를 준비하기 위해, KDM1A 표준 작업 용액 및 PBS의 표시된 부피를 8개의 제대로 표지된 1.5mL 미세원원지 튜브로 피펫합니다.
표 2: 깊은 우물 플레이트 디자인. 5.4.2 단계에서 표준(파란색) 및 샘플(노란색). 파란색 (표준) 및 노란색 (샘플) 화살표의 방향에 따라 ELISA 플레이트에 로딩을 용이하게하기 위해 깊은 우물 판의 반사 된 위치로 피펫했다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 엘리사 플레이트 디자인. 분석 판은 재조합 KDM1A 타겟의 양이 감소하는 표준 곡선을 포함 (파란색); 생물학적 샘플 (S) 노란색; 및 상응하는 음성 대조군(1차 검출 항체가 아닌 샘플을 포함)을 흰색으로, 딥 웰 플레이트로부터 ELISA 플레이트상에 적재한다. 블랭크(표준 곡선의 0)에는 모든 캡처 및 검출 시약이 포함되어 있지만 샘플은 포함되어 있지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
- Elisa
- (5.2.4단계부터 계속. ) 배양 2 시간 후, 차단 버퍼를 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 씻습니다.
- 적절하게 희석된 샘플(5.3단계의 기본 단백질 추출물 및 표준 곡선)을 표 2(Deep Well Plate Design)에 나타낸 플레이트 분포에 따라 냉장 된 96 개의 깊은 웰 저장 블록으로 옮니다.
- 표 3(ELISA 플레이트 설계)에 표시된 플레이트 분포에 따라 총 및 무료 ELISA 플레이트에서 100 μL 샘플/잘 파이펫팅될 때까지 이 블록을 얼음 위에 보관하십시오.
- RT에서 1 시간 동안 배양하고 샘플을 버리고 세척 버퍼로 접시를 5 번 씻으십시오.
- 토끼 항 KDM1A 검출 항체의 20 mL을 차단 완충액에서 0.125 μg/mL로 준비하고, 음의 대조군 C-에 대응하는 웰을 제외하고, 분석의 각 플레이트에 잘 당 100 μL을 추가한다. 플레이트를 맨 위로 밀봉하고 RT에서 1h를 배양합니다.
- 검출 항체 용액을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 6 회 세척하십시오.
- 차단 완충액에서 희석 1:5,000에 이차 염소 항 토끼 항체 HRP의 25 mL를 준비하고, 마이크로티터 플레이트에 잘 당 100 μL을 추가; RT에서 1 시간 배양하십시오.
-
화학 발광 검출
- 5.4.7단계 종료 30분 전. 그리고 부드러운 조명 조건에서, Luminol-Enhancer 및 과산화수소 용액의 동등한 부분을 혼합 (10.5 mL : 10.5 mL, 2 접시) 호박 병에 RT에 둡니다.
참고: Luminol 작업 용액을 호박색 병에 보관하고 강렬한 빛에 장시간 노출되지 않도록 하십시오. 일반적인 실험실 조명에 단기 노출하면 작업 솔루션에 해를 끼치지 않습니다. - 발광을 측정하기 최소 20분 전에 25°C에서 마이크로플레이트 리더를 켜고 판독값을 1,000ms 통합 시간 및 150ms 정착 시간으로 설정합니다. 파라미터 설정은 계측기의 기능을 최적화해야 할 수 있습니다.
- 단계 5.4.7.에서 1 시간 의 배양 후, 이차 항체 용액을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 6 회 세척하십시오.
- 5.5.1단계에서 제조된 루미놀 가공 용액(Chemiluminescent 기판)의 웰당 파이펫 100 μL. 매우 천천히 피펫과 거품 형성을 방지 할 수 있습니다. 타이머를 사용하여 용액의 첨가와 플레이트의 발광 측정 사이의 시간을 조절하고 이 시간을 일정하게 유지하여 좋은 상호 분석 재현성을 달성한다.
- 플레이트와 원심분리기를 RT에서 500 x g으로 밀봉하여 플레이트 원심분리기에서 45초동안 남은 기포를 제거합니다. 플레이트 쉐이커에서 100rpm으로 1분 동안 접시를 배양합니다.
- 판독기 내부에 플레이트를 삽입하고 25 °C에서 온도를 안정화하기 위해 3 분 동안 둡니다 (접착제 필름없이). 항상 무료 ELISA 플레이트로 시작하십시오.
- 각 ELISA 플레이트 분석법의 상대 발광 단위(RLU)를 판독한다(자유 및 총 KDM1A).
- 원시 데이터 엑셀 파일에서 Raw RLU 값을 저장하고 복사하여 결과를 추가로 분석합니다.
- 5.4.7단계 종료 30분 전. 그리고 부드러운 조명 조건에서, Luminol-Enhancer 및 과산화수소 용액의 동등한 부분을 혼합 (10.5 mL : 10.5 mL, 2 접시) 호박 병에 RT에 둡니다.
6. 목표 참여계산
- 스프레드시트 소프트웨어에서, 아래에 자세히 설명된 대로 기술적 복제 원시 데이터에서 샘플 SX 및 참조 샘플 REF(미처리, 차량 또는 사전 투여 샘플)의 RLU Free 및 RLU 총 값을 계산합니다.
- 빈 블랭크, 표준 곡선, 네거티브 컨트롤 C- 및 생물학적 샘플(SX 및 REF)의 개별 Raw RLUi 토탈 및 Raw RLUi 무료 데이터를 분석 데이터시트(예: Excel)에 입력합니다. 또한 데이터 시트의 표준 곡선에서 KDM1A의 양(pg)을 입력합니다.
- 각 기술 복제 데이터 포인트에 대한 개별 Raw Total 및 Raw Free RLUi 데이터에서 Raw 평균 RLU, 표준 편차 σRLU및 변형 CVRLU 계수를 계산합니다.
- 이상값 제거 적용(예: 트리플리케이트 데이터 포인트에서 각 개별 Raw RLU 토탈 및 Raw RLU Free 데이터 포인트 RLUi에 대해, 트리플리케이트 > 0.15에 대한 CV를 적용하고, 단일 의심스러운 Raw RLU 값을 거부할 때 그럽스 기준적용) 때
,
이에 따라 Z = n = 3 및 90% 신뢰 구간(CI)에 대해 1.148입니다. - 이상값 제거가 적용된 경우 각 데이터 포인트에 대해 비거부(nr) Raw RLUi 합계 및 Raw RLUi Free 값에서 Raw 평균 RLU, 표준 편차 σRLU 및 CVRLU를 다시 계산합니다.
- 배경 보정 적용: 각 표준 샘플에 대한 평균 RLU 무료 및 RLU 총 값을 계산하고 각 샘플 SX 및 참조 샘플 REF를 다음과 같이 계산합니다.
- 다음과 같이 데이터를 그래픽으로 나타냅니다.
- 막대 그래프에서 표본 식별(X축)을 기준으로 RLU자유 및 RLU총 값(Y축)을 플로팅합니다.
- 또한 자유 및 총 측정을 위한 rKDM1A 단백질(X축)의 pg 양을 기준으로 산점 도표에서 표준의 RLU 값(Y축)을 플롯하고 해당 직선 추세선을 플롯하고 r2(선형의 제곱)를 계산합니다. 상관 계수) 값입니다.
- 목표 참여도(TE)를 계산합니다. 즉, 기준 샘플 REF(미처리, 비차량 또는 전용량 샘플)에 상대적인 각 샘플 S X에서 KDM1A 억제제에 의해 결합된 KDM1A의 백분율은 다음과 같습니다.
- SX 및 REF 샘플에 대한 평균 RLU 무료 값과 총 값의 비율 R을 다음과 같이 계산합니다.
- 그런 다음 샘플 S X의 대상 참여(TE)를 다음과 같이 계산합니다.
선택 사항: (1) N 생물학적 복제 실험이 수행된 경우, 각각 n기술적 복제본이 있는 경우; 먼저 기술 복제 세트에 대한 TESX를 계산합니다. 이어서, 생물학적 복제 세트에 대한 평균 TE, SD 및 CV 값을 계산한다.
- SX 및 REF 샘플에 대한 평균 RLU 무료 값과 총 값의 비율 R을 다음과 같이 계산합니다.
- 분석 수용 기준이 충족되는지 수정: (1) 분석 배경이 허용되고 평균 공백 및 0.05 x 107 RLU인지 확인; (2) 샘플 자동 발광이 결석하고 음극 대조군 C-의 LUS가 정량화의 하한 미만(LLOQ = 평균 블랭크 + 10x SD) 이하이고; (3) rKDM1A 표준 곡선은 선형 및 r2 ≥ 0.98; (4) 생물학적 샘플은 LLOQ와 2,500 pg/well 사이의 분석즉, 분석의 동적 및 선형 범위에 속하는 RLU 값을 가집니다.
참고: 6.1단계. 6.4. 미적분 데이터시트에서 쉽게 자동화할 수 있습니다. - TE 값의 그래픽 표현 및 추가 통계 평가를 위해 TE 데이터를 오픈 소스 또는 상업적으로 얻은 통계 소프트웨어로 내보냅니다.
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
총 및 자유 KDM1A 결정의 선형성.
표준 시리즈는 5.3.2.단계에서 기재된 바와 같이, 0~2500 pg의 전길이 인간 재조합 KDM1A 효소를 사용하여 제조하였다. 총 및 자유 rKDM1A의 RLU 값을 평가하여 선형도를 검증하였다(도2A 및 2B). 데이터는 3개의 기술적 복제(n) ± SD를 가진 3개의 실험으로부터 평균으로 표현된다. 3명의 독립적인 자원봉사자의 혈액으로부터 인간 PBMC에서 검출된 총 및 자유 KDM1A의 RLU 값은 도 2C 및 2D의표준 곡선상에 중첩된다. 혈액 샘플은 스페인 법률 (Real Decreto de Biobancos 1716/2011)에 따라 인스티투토 드 Investigación Biomédica Sant Pau Biobank에서 얻어졌으며 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
그림 2. 건강한 지원자의 PBMC에서 총 및 무료 rKDM1A의 결정. 총 rKDM1A의 RLU 값은 ELISA (A)에 의해 평가되고 화학 프로브 캡처 ELISA (B)에 의해 평가된 자유 rKDM1A. 데이터는 3개의 복제 실험으로부터 수득되었고, 각각 3중(N=3; n=3)으로 분석하였다. ELISA (C)와 표준 곡선에 중첩 된 3 개의 독립적 인 처리되지 않은 자원 봉사자 (빨간색, 파란색 및 녹색 사각형)의 PBMC에 대해 무료 KDM1A (D)에 의해 평가 된 총 KDM1A의 RLU 값. 삼중항으로 분석된 한 실험으로부터 데이터를 수득하였다(N=1; n=3). 표현된 값은 ±SD를 의미합니다.
세포에서의 KDM1A 표적 참여 분석
AML 세포는 공급자 권고에 따라 배양되었다. 세포는 상이한 농도에서 비위 또는 ORY-1001로 처리하였다(0.25; 0.5;1; 5 및 25 nM) (그림 3). 네이티브 단백질 추출물은 25 nM OG-881 화학프로브의 존재로부터 수득되었다. 0.5 μg의 총 단백질을 앞서 설명한 바와 같이 표적 결합 분석을 수행하기 위해 사용되었다. 총 및 자유 KDM1A가 결정되었고, KDM1A에 대한 ORY-1001의 목표 참여비율은 기재된 바와 같이 차량에 대해 산출되었다.
그림 3. 인간 AML 세포주에서 KDM1A 표적 결합의 투여량-반응. 세포는 상이한 농도(0.25; 0.5; 1; 5 및 25 nM)에서 비위 또는 ORY-1001로 처리하고 기재된 바와 같이 표적 결합의 결정에 사용하였다. 데이터는 3개의 복제 실험으로부터 수득되었고, 각각 3중(N=3, n=3)으로 분석하였다. 표현된 값은 ±SD를 의미합니다.
생체 내 KDM1A 대상 참여 분석
본 실험의 목적은 용량 수준의 기능에서 상이한 랫트 조직에서 ORY-1001의 표적 결합을 특성화하는 것이었다. 이 목표를 달성하기 위해, 15 스프라그-Dawley 쥐 (200-250 g)는 테스트 된 화합물에 의한 잠재적 인 오염을 피하기 위해 세포 성 보안 실에 보관되었습니다. 최대 3마리의 쥐/케이지가 5개의 연구 그룹에 무작위로 할당되었습니다. 5개의 상이한 연구 그룹이 각각, 비히클; 1; 3; 10 또는 30 μg/kg의 ORY-1001을 4일 연속경투여에 의해 경구 투여한다. 복합 재고 솔루션은 매일 준비되었습니다. 동물은 각 투여 전에 무게를 측정하여 필요한 부피를 조절했다. 모든 동물은 일정한 실내 온도 (20 - 24 ºC) 및 상대 습도 (45 - 65 %)에서 보관되었습니다. 12 시간 동안 밝은 어두운 주기 (6 : 00 AM에 불이 켜집니다). 음식과 물은 사용할 수 있는 광고 libitum. 혈액 샘플을 K2 EDTA 튜브및 PBMC에서 마지막 투여 후 2시간 수집하였으며, 1.2.2단계에서 앞서 설명한 절차에 따라 PBMC를 분리하였다. 원토 단백질 추출전까지 -80°C에서 보존한다. 폐 샘플은 또한 마지막 약물 투여 후 2시간 동안 수집하였고, 액체 질소에서 즉시 동결시키고, -80°C에서 저장하였다. 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되었다 (유럽 공동체 위원회 지침 86/609 / EEC) PRAAL-PCB에서 동물 실험을위한 윤리위원회에 의해 설립.
분쇄 후, 폐로부터의 네이티브 단백질 추출물을 기재하고 정량화한 바와 같이 수득하였다. 총 5 μg의 풀린 PBMC 또는 3마리의 동물로부터의 폐로부터의 총 단백질7.5 μg를 KDM1A 표적 결합 분석기를 실행하기 위해 투여군당 사용하였다.
KDM1A 표적 결합의 투여량-반응-경구 위축에 의한 ORY-1001을 가진 쥐의 폐 치료에서, 기비히자 군에 대해 산출된 것은 도 4A 및 4B에도시되어 있다. 도 4C에서볼 수 있듯이, 비히클 처리된 동물로부터 25 nM ORY-1001의 폐 단백질 추출물을 함유한 생체 내 인큐베이션은 아직 전체 TE를 산출하지만 30 μg/kg ORY-1001로 4일 동안 처리된 쥐의 샘플에서 TE를 더 증가시키지 는 않습니다. , KDM1A를 확인한 것은 이미 생체 내에서 완전히 억제되었다.
그림 4. 생체 내 및 생체 외 네이티브 KDM1A 표적 참여. KDM1A 표적 결합의 투여량-PMC(A) 및 폐 샘플(B)에서 4일 연속(p.o)에 대한 ORY-1001로 처리된 랫트로부터의 반응. 데이터는 코호트당 3마리의 동물로부터 풀화된 PBMC 추출물로부터 수득되었고, 복제(N=1, n=2) 또는 코호트당 3마리의 개별 동물로부터의 폐로부터 분석되었으며, 삼중(N=3, n=3)으로 분석하였다. C. 비히클(왼쪽) 또는 30 μg/kg ORY-1001로 처리된 쥐의 풀화 폐 단백질 추출물에서 의 TE 비교; 1시간 후 생체 내 인큐베이션 후 (그레이 바) 또는 25 nM ORY-1001(블루 바)(N=3, n=3)을 가진 추출물을 배양하였다. 모든 데이터는 수단으로 표시됩니다 ± SD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 새로운 KDM1A 화학프로브 포획 기반 ELISA를 사용하여 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하기 위해 개발되었다. 이 방법은 인간, 쥐 및 마우스 및 개코원숭이(PBMC, 폐, 뇌, 피부, 종양 포함)에서 배양된 인간 세포주 및 생체 내 샘플에서 검증되었지만, KDM1A 항체 표적 에피토프 및 촉매가 있는 다른 종에 쉽게 적용할 수 있습니다. 센터가 보존됩니다. OG-881은 활성 기반 의 화학 프로브이기 때문에, 샘플 품질이 중요하고 샘플의 적절한 조작 및 보존은 특히 프로토콜의 초기 단계에서 추구되어야하며, KDM1A 활성이 보존되도록해야합니다.
현재의 실험 프로토콜은 공유 FAD 표적 억제제에 의한 KDM1A 표적 참여를 분석하도록 최적화되었다. 또한 KDM1A의 FAD 보조인자에 대한 액세스를 차단하는 가역적 억제제와 함께 사용될 수 있다. 체류 시간이 긴 강력한 가역 억제제는 수정되지 않은 프로토콜을 채택할 수 있다.
OG-881 화학 프로브는 높은 오프 레이트와 낮은 힘 가역 억제제에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 원고에 사용된 특정 화학 프로브는 세포 침투제가 아니므로 분석은 용해된 샘플에서 생체 내 생체 내에서 수행됩니다.
이 방법은 연구 및 분석 실험실에서 광범위하게 사용할 수있는 기기에서 실행할 수 있습니다. 그것은 세포로 소개되는 유전 수정을 요구하지 않으며, 다른 견본 모형에 쉽게 적용될 수 있습니다. 또 다른 장점은 개념 연구 및 독성학 모델의 전임상 증명에서 자주 사용되는 다른 종에서 파생 된 샘플에 사용될 수 있으며 임상 샘플을 분석하기 위해 성공적으로 번역되었다는 것입니다.
다른 방법은 KDM1A 표적 참여의 분석에 사용되어 왔다. 이러한 방법의 대부분은 AlphaLisa15를사용하여 H3K4me2 히스톤 마크의 변경과 같은 프록시 마커를 사용합니다. 또는 qRT-PCR 또는 FACS 분석을 이용한 발현 마커의 유도16. 그러나, 세포 또는 조직에서, 히스톤 마크는 다중 요인에 의해 통제되고, 히스톤 마크에 있는 변경을 측정하는 분석은 항상 분석을 위한 좋은 동적 범위를 제공하지 않습니다. KDM1A 억제는 유전자 및 단백질 발현에 있는 강력한 변경을 유도할 수 있습니다, 그러나 반응은 복용량 반응의 분석을 복잡하게 할 수 있는 매우 이질적이고 높게 세포 문맥 의존하는 경향이있습니다3,7.
따라서 대상의 직업에 대한 직접 평가는 목표 참여를 측정하는 가장 좋은 방법입니다. 이를 위해 제안된 한 가지 분석법은 억제제의 결합시 표적 단백질의 열 안정성의 증가에 기초하여 세포 열 시프트 분석법(CETSA)이다. 이 방법은 원칙적으로, 변형되지 않은 세포 및 상이한 조직 유형에 적용될 수 있으며 최근에는 경작된세포(17)에서KDM1A 억제제의 세포 활성을 평가하는 데 사용되고 있다. 그러나, 이 기술은 거의 생체 내 약리학 연구에 대 한 사용 되었습니다18 그리고 우리의 지식의 베스트, 그것의 사용은 임상 시험에서 보고 되지 않았습니다.
여기에 제공된 프로토콜은 세포 및 조직 샘플에서 KDM1A 표적 결합을 결정하는 데 사용된 완전 검증된 화학프로브 기반 방법을 설명합니다. 이 방법은 KDM1A 억제제19로 처리된 인간 피험자의 샘플을 분석하기 위해 성공적으로 번역되었으며 임상 시험에서 PK/PD 반응을 모델링하는 데 매우 적합합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 타마라 메이스는 전무 이사 및 주주이며, 저자 크리스티나 마스카로와 라켈 루이스 로드리게스는 오리존 유전체학 S.A. 오리존 유전체학 S.A.의 직원이며, KDM1A 억제제 개발 및 사용되는 화합물과 방법을 포함하는 특허를 보유하고 이 문서에서.
Acknowledgments
이 연구는 오리존 유전체학에 의해 융자되었다. S.A., 호프만 라 로슈, 부분적으로 CIIP-20152001 및 RETOS 협력 프로그램 RTC-2015-3332-1에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
